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用于快速开发亲和层析树脂的活化交联琼脂糖——以抗体捕获为例

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DOI：

10.3791/59933

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2019年8月16日

 ,  ,  , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Sanofi Deutschland GmbH, 3Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.

本文内容

摘要

在此方案中，将一种基于 DsRed 的表位配体固定化，以制备高选择性亲和树脂，用于从粗制植物提取物或细胞培养上清液中捕获单克隆抗体，可作为 Protein A 的替代方法。

摘要

单克隆抗体（mAbs）的纯化通常通过 Protein A 亲和层析实现，该步骤可占整个工艺成本的25%。因此，在需要大量生产单一mAb的工业级制造中，开发替代性、更具成本效益的捕获步骤具有重要价值。本文介绍了一种将基于DsRed的表位配体固定于交联琼脂糖树脂的方法，可在不使用Protein A的情况下，从粗制植物提取物中选择性捕获HIV中和抗体2F5。首先将线性表位ELDKWA在基因水平上与荧光蛋白DsRed融合，并在转基因烟草（Nicotiana tabacum）植株中表达该融合蛋白，随后通过固定化金属离子亲和层析进行纯化。此外，我们优化了一种基于活化交联琼脂糖的固定方法，以实现高配体密度、高效偶联和低成本。在偶联过程中，pH值、缓冲液组成以及可溶性配体浓度是最关键的参数，通过实验设计方法对这些参数进行了优化。所得亲和树脂被用于测试其在粗制植物提取物中选择性结合目标mAb的能力，并进一步优化洗脱缓冲液，以实现高mAb回收率、产物活性以及亲和树脂的稳定性。该方法可轻松适用于其他具有线性表位的抗体。新型树脂相比Protein A可实现更温和的洗脱条件，同时还有望降低mAb生产中初始捕获步骤的成本。

引言

生物制药产品在几乎所有医学领域的多种疾病治疗中均具有重要意义1单克隆抗体（mAbs）主导着生物制药市场，其全球销售额预计将达到近 €2020年的1100亿2首选的mAb表达平台为中国仓鼠卵巢细胞系，该细胞系通常可产生高达10 g的高滴度mAb∙L-1 在培养上清液中3,4然而，由于培养基成本高昂且需要无菌发酵，哺乳动物细胞培养生产单克隆抗体的费用较高5. 植物等替代表达平台可能为工业生产提供一种更快捷、更简单、更低成本且更具可扩展性的方法6,7.

除了与哺乳动物细胞培养相关的成本外，工业生产单克隆抗体（mAbs）的主要成本驱动因素还包括广泛使用 Protein A 亲和层析进行产物捕获。Protein A 天然存在于Staphylococcus aureus细胞表面，可结合某些小鼠和人源抗体的可结晶片段（Fc）区，从而作为一种逃避体液免疫系统的防御机制8。Protein A 已成为从细胞培养上清液中捕获 mAbs 的行业金标准，同时也被科研界广泛使用，因其具有高度选择性，通常可在单步操作中实现约 95% 的 mAb 纯度8。过去二十年中，Protein A 的销售额与 mAbs 的销售额高度同步，这一现象并不令人意外8。根据生产规模的不同，Protein A 的成本可能占总工艺成本的 25% 以上，从而影响治疗性 mAbs 的市场价格，后者可高达 €2,000 g-1 5,9。因此，开发具有类似纯化性能的替代层析树脂有望显著降低生产成本，使基于抗体的疗法惠及更多患者10,11,12。此类替代方法还可能规避 Protein A 层析的若干缺点，例如在低 pH（通常 <3.5）条件下进行洗脱，可能导致 mAbs 发生构象变化并促进聚集13。值得注意的是，Protein A 仅对特定 IgG 亚类的 Fc 区具有选择性，因此具有截短结合域的非功能性分子可能与完整产物共同纯化5，而单链可变区片段（scFv）等 mAb 衍生物则完全不与 Protein A 结合。

本文描述了一种用于捕获HIV中和性单克隆抗体2F5的替代性亲和层析树脂，该方法利用其线性表位ELDKWA（单字母氨基酸编码）5,14。我们将2F5表位通过基因工程融合至荧光蛋白DsRed的C末端，DsRed作为载体和报告分子，随后在转基因烟草（Nicotiana tabacum）植株中表达了融合蛋白DsRed-2F5-Epitope（DFE）。DFE通过一步式固定化金属离子亲和层析（IMAC）进行纯化。将纯化的DFE亲和配体固定于交联琼脂糖树脂上，是通过使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化的交联琼脂糖柱进行化学偶联实现的。随后采用统计实验设计优化固定化过程及偶联效率15。我们从抗体纯度、得率和配体稳定性等方面评估了2F5单克隆抗体的纯化策略。与结合Fc区的Protein A不同，DFE结合2F5的互补决定区，从而确保纯化出具有完整抗原结合位点（paratope）的分子。该策略可轻松拓展至任何具有线性表位的单克隆抗体，或可通过微阵列研究快速鉴定的其他基于多肽的亲和配体16。

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图1：用于从粗制植物提取物或细胞培养上清液中捕获单克隆抗体（mAb）的表位亲和树脂制备流程示意图。 (A) 亲和配体DFE在转基因烟草植株中表达。在收获叶片进行匀浆(C)之前，加入了热沉淀步骤(B)。(D) 粗制植物提取物通过袋式过滤、深层过滤和0.2 µm无菌过滤进行澄清。(E) 随后通过IMAC纯化DFE。(F, G) 将纯化的DFE亲和配体偶联至EDC/NHS活化的交联琼脂糖柱上。(H) 携带编码抗体2F5的T-DNA的细菌培养物用于在植物生长室(I)中培育的N. benthamiana植株中进行瞬时表达。(J) 收获N. benthamiana叶片，并按D步骤所述方法处理。(K) 使用DFE亲和柱从澄清的提取物中纯化单克隆抗体2F5(L)。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 培养转基因烟草植株

注意：DFE 融合蛋白的设计及转基因植物的构建已在其他文献中描述5,17。

  1. 将转基因烟草幼苗在土壤中萌发。用 1.0 g·L-1 的肥料溶液浇灌植株。当植株生长至直径约 0.04 m 时，将其移栽至单独的 100 mm × 100 mm × 60 mm（长、宽、高）花盆中。
  2. 在温室中培养转基因烟草植株，光照周期为 16 小时（光/暗温度为 25/22 °C），相对湿度保持在 70%，并每小时自动施用 1.0 g·L-1 肥料溶液 15 分钟。
  3. 7 周后，收获除植株茎基部四片子叶以外的所有叶片。立即按以下所述方法处理收获的叶片。

2. 宿主细胞蛋白的热沉淀

  1. 在不锈钢加热容器（0.3 m × 0.3 m × 0.3 m）中设置一个工作体积为 20 L 的水浴。开始时，在水浴中放置一个磁力泵，以 5 L min-1 的流速持续搅拌液体。在水浴上安装可调式恒温器以控制温度（见步骤 2.4 和 2.8）。
    注意：从本步骤至步骤 2.10 的所有操作均涉及高温液体处理。请穿戴适当的个人防护装备，包括隔热手套和护目镜。
  2. 向水浴中加入 15 L 去离子水，并将液体加热至 70 °C。
  3. 将一个装有 5 L 去离子水的 10 L 桶置于磁力搅拌器上。加入磷酸钠，使其终浓度为 120 mM。使用 10 M 盐酸调节 pH 至 8.14。待所有组分完全溶解后，将所得的浓缩漂烫缓冲液（5 L）加入步骤 2.2 中的水浴中。
  4. 持续搅拌水浴，直至温度达到 70 °C。如有必要，使用 10 M 盐酸调节 pH 至 8.14。在达到目标温度和 pH 后，继续搅拌至少 15 分钟，以确保整个系统达到热平衡。
  5. 准备一个 20 L 的桶（0.3 m × 0.3 m × 0.3 m），其中装入约 17 °C 的去离子水（用于步骤 2.9）。
  6. 将步骤 1.3 中收获的烟草叶片分成每份 400 g 的等分试样。取一份试样放入穿孔篮中（0.2 m × 0.2 m × 0.2 m；孔径至少为 0.02 m × 0.02 m）。避免篮子装填过满或叶片堆积过紧，以防组织受损。
  7. 将穿孔篮完全浸入步骤 2.4 中的热漂烫缓冲液中，并确保所有叶片均保持在液面以下。如有需要，可使用耐高温硅胶勺将叶片压入液面下。
  8. 在磁力泵持续搅拌条件下，将烟草叶片在漂烫液中孵育 1.5 分钟。在整个孵育过程中监测液体温度。避免烟草叶片堵塞泵的进液口。
  9. 将装有烟草叶片的篮子从漂烫缓冲液中取出，沥去叶片上残留的缓冲液 30 秒。随后将篮子转移至装有冷水的桶中（来自步骤 2.5），将叶片浸入冷水中 30 秒。取出篮子后再次沥去残留水分 30 秒，然后进行匀浆处理（步骤 3）。
  10. 使用步骤 2.6 中的新鲜等分试样重复步骤 2.6 至 2.9，直至全部收获的生物量处理完毕。在整个过程中持续监测并调节水浴中漂烫缓冲液的 pH 和温度。
    注意：若需进行多次漂烫循环处理全部生物量，漂烫后的植物材料可在冰上保存最多 30 分钟。漂烫后的叶片也可在真空密封袋中于 –80 °C 保存至少 3 周。但建议立即进行后续处理，因为长期储存可能会降低 DFE 产率。

3. 蛋白质提取与澄清

注意：以下步骤涉及带有旋转刀片的搅拌机。在搅拌机通电或安装在电机单元上时，切勿在搅拌机容器内操作。

  1. 将150 g（湿重）漂烫过的烟草叶片（步骤2.9）放入搅拌器容器中，加入450 mL提取缓冲液（50 mM磷酸钠，500 mM氯化钠，10 mM连二亚硫酸钠，pH 7.5）。拧紧搅拌器盖子，防止植物材料或缓冲液溢出。
  2. 以每次30秒、间隔30秒的方式对叶片进行3次匀浆处理。确保所有叶片均被充分匀浆，且无叶片粘附在搅拌器容器顶部。如有必要，可在间隔期间打开搅拌器，使用洁净的硅胶勺将粘附在容器上部的叶片压下。
  3. 匀浆完成后，取1.0 mL匀浆液样品用于后续分析（步骤7）。
  4. 将匀浆液收集至适当大小的容器中（例如，若处理总生物量为1.0 kg，则使用容量至少为5 L的容器）。重复步骤3.1至3.3，直至所有漂烫后的生物量均完成匀浆。
  5. 将滤袋安装至滤袋支架上，并在装置下方放置另一个适当大小的容器（见步骤3.4）。以约0.15 L min-1的流速将匀浆液加入滤袋中。每过滤1升后取样滤液用于后续分析（步骤7），并使用浊度计或类似设备测定滤液池的浊度（以提取缓冲液稀释10倍后测定）。
  6. 使用每升滤液池需0.02 m2的K700（上层）与KS50（下层）深层滤材组合进一步澄清滤液池。以3.0 L min-1·m-2的流速进行过滤，最大压力不超过0.2 MPa。随后，如前所述5，将澄清后的滤液通过0.2 µm无菌滤膜以去除残留颗粒。

4. DFE 亲和配体的纯化

  1. 通过使用洗脱缓冲液（10 mM 磷酸钠，300 mM 咪唑，pH 7.4）、洗涤缓冲液（10 mM 磷酸钠，pH 7.4）和平衡缓冲液（20 mM 磷酸钠，500 mM 氯化钠，pH 7.4）冲洗，准备快速蛋白液相色谱系统。每公斤叶生物量（约 2.5 L 深层滤液）安装一个含有约 50 mL 螯合交联琼脂糖树脂的色谱柱。
  2. 通过加入 5 个柱体积（CV）的 200 mM 硫酸镍溶液对色谱柱进行镍离子负载，并用 5 个柱体积的洗脱缓冲液洗涤。所有后续色谱步骤均使用 50 cm h-1 的流速，并监测 260、280 和 558 nm 处的紫外信号。
  3. 用 10 个柱体积的平衡缓冲液对色谱柱进行平衡。然后将 50 个柱体积的澄清植物提取物（来自步骤 3.6）上样至已平衡的色谱柱中。
  4. 用 10 个柱体积的洗涤缓冲液洗涤色谱柱。用 5 个柱体积的洗脱缓冲液洗脱 DFE 融合蛋白，并在 280 nm 和 558 nm 处的紫外信号较基线升高超过 5 mAU 时开始收集含产物的组分。
  5. 从洗脱组分中取 0.2 mL 样品，用于测定总可溶性蛋白（TSP）浓度（步骤 7.1）、DFE 浓度（步骤 7.2 和 7.3）以及 DFE 纯度（步骤 7.4）。
  6. 在色谱系统上安装一个含有约 50 mL 交联葡聚糖树脂的色谱柱。用 5 个柱体积的偶联缓冲液（200 mM HEPES，500 mM 氯化钠，pH 8.5）对色谱柱进行平衡。注入 10 mL DFE 洗脱组分（步骤 4.4）以进行缓冲液置换，并监测 280 nm 和 558 nm 处的紫外吸光度。
  7. 当 280 nm 和 558 nm 处的紫外信号较基线升高超过 5 mAU 时，收集含 DFE 的组分。取 0.2 mL 样品，测定 TSP 浓度、DFE 浓度和 DFE 纯度（步骤 7）。
  8. 使用离心浓缩管，在 4 °C、3,000 x g 条件下离心 30 分钟，将纯化的 DFE 样品（来自步骤 4.7）浓缩至 15 g L-1。随后进行偶联反应（步骤 5）。
    注意：若无法立即进行浓缩或偶联步骤，需将 DFE 溶液在 4 °C 下保存。

5. 将 DFE 偶联至活化的交联琼脂糖树脂

注意：在连接所需的全部设备和溶液准备就绪之前，不得更换用于保存NHS活化柱的异丙醇。切勿让色谱柱变干。

  1. 建立一个实验设计（DoE）模型，以优化DFE与活化树脂的偶联，其中pH、缓冲液组成和DFE浓度作为影响因素。DoE方法的详细信息见其他文献15。
  2. 将亲和配体溶液（来自步骤4.8）配制成0.5–15 g·L-1浓度范围（或根据DoE定义的浓度），并在冰上保存，直至偶联反应准备就绪（步骤5.5）。用DFE溶液填充至少十个2 mL注射器，并准备适配器，将注射器安装到床体积为1.0 mL的NHS活化交联琼脂糖柱上。
  3. 每使用10根用于偶联的柱子，需准备30 mL封闭溶液（0.5 M乙醇胺，0.5 M氯化钠，pH 8.3）、30 mL低pH溶液（0.1 M乙酸钠，0.5 M氯化钠，pH 4.0）和10 mL保存溶液（0.05 M磷酸氢二钠，0.1% (m/v)叠氮化钠，pH 7.0）。
  4. 在离心管中配制20 mL 1 mM盐酸，并在冰上孵育至少20分钟。准备一台精密天平，用于监测偶联反应过程中所有步骤的流出液（步骤5.7）。
  5. 打开密封的NHS活化交联琼脂糖柱，并在柱入口处安装注射器适配器。连接注射器前，在适配器入口处滴加一滴缓冲液，防止空气进入柱中。
  6. 以<1 mL min-1的流速，用6 mL冰浴的1 mM盐酸（来自步骤5.4）洗涤柱子，并立即进入步骤5.7。
  7. 使用2 mL注射器以<1 mL min-1的流速注入1.5 mL DFE溶液（步骤5.2），并在精密天平（步骤5.4）上收集流出液，用于后续分析（步骤7）。密封柱子两端，在22 °C下孵育15–45分钟，具体时间根据DoE设置而定。
  8. 以<1 mL min-1的流速依次注入6 mL封闭溶液和6 mL低pH溶液，以去除树脂上非共价结合的配体。然后注入6 mL封闭溶液，并将柱子孵育15分钟。
  9. 向柱中注入6 mL低pH溶液，随后注入6 mL封闭溶液。然后再向柱中注入6 mL低pH溶液。
  10. 向柱中注入2 mL保存溶液，并在4 °C下保存。

6. 从澄清的植物提取物中纯化单克隆抗体的检测

  1. 制备含有2F5的100 mL澄清植物提取物5 或来自优选的基于细胞的表达系统的上清液，其中也含有2F5。
  2. 配制平衡缓冲液（20 mM 磷酸钠，500 mM 氯化钠，pH 7.4）、低pH洗脱缓冲液（0.05 M 柠檬酸，0.05 M 氯化钠，pH 4.0–3.25）以及高离子强度洗脱缓冲液（1.0–4.0 M 氯化镁，0.1 M HEPES，pH 8.0）
  3. 用缓冲液冲洗层析系统。将亲和层析柱（来自步骤5.10）安装至层析系统上，以1.0 mL/min的流速用平衡缓冲液平衡5个柱体积。-1监测280 nm处的紫外吸收。
    注意： 将植物提取物或细胞培养上清液上样至色谱柱时，可能导致反压升高。请设置0.2 MPa的高压警报，以避免对色谱系统或DFE柱造成损坏。
  4. 将80 mL澄清的植物提取物或上清液（步骤6.1）以0.5 mL/min的流速上样至层析柱中-1 确保接触时间为2分钟。将流出液以2 mL为一份收集，用于穿透曲线的重建（步骤7.3）。若无法立即进行样品分析，则将流出液样品储存在4 °C。
  5. 用6个柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱。在此步骤的开始、中间和结束时分别收集洗脱液样品。
  6. 用5个柱体积的低pH洗脱缓冲液或高离子强度洗脱缓冲液（0.1 M HEPES，1.25 M 氯化镁，pH 8.0）洗脱单克隆抗体2F5。当紫外280 nm信号上升至基线以上5 mAU时，收集DFE组分。
    1. 针对每种表位-抗体组合优化洗脱缓冲液。对于2F5，1.25 M氯化镁在产物回收率与配体稳定性之间实现了最佳平衡。
      注意： 氯化镁溶液易产生沉淀。因此，先将氯化镁溶于约700 mL水中。另取100 mL水溶解HEPES，并调节pH至8.0。将溶解后的氯化镁溶液加入HEPES溶液中，再加水至终体积1.0 L。溶解氯化镁后不可调节pH，否则会导致沉淀生成。
  7. 使用 Bradford 法、十二烷基硫酸锂聚丙烯酰胺凝胶电泳（LDS-PAGE）和表面等离子体共振（SPR）光谱法（步骤 7）分析在步骤 6.4–6.6 中采集的所有样品。

7. 样品分析

  1. 使用 Bradford 法测定总可溶性蛋白（TSP）浓度18,19。
    1. 将每个样品取 2.5 µL，设三个重复，加入 96 孔板的单个孔中。使用八个牛血清白蛋白（BSA）标准品，设三个重复，浓度范围为 0–2,000 mg·L-1。
    2. 向每个孔中加入 200 µL Bradford 试剂，并通过轻柔吹打混匀。保持移液器水平，避免产生气泡，以免干扰后续读数。
    3. 将 96 孔板在 22 °C 下孵育 10 分钟，使用分光光度计在 595 nm 处测定吸光度。根据 BSA 参考点绘制的标准曲线，计算样品中的 TSP 浓度。
  2. 通过荧光测定法定量 DFE
    1. 将每个样品取 50 µL，设三个重复，加入黑色 96 孔半面积板的单个孔中。设置六个 DsRed 标准品，浓度范围为 0–225 mg·L-1。
    2. 使用分光光度计，以 530 ± 30 nm 激发滤光片和 590 ± 35 nm 发射滤光片，重复测定荧光值两次。根据 DsRed 参考点绘制的标准曲线，计算样品中 DFE 的浓度。
  3. 通过 SPR 光谱法测定 2F5 浓度20。
    1. 配制 HBS-EP 运行缓冲液（10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、3 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、150 mM 氯化钠、0.005% v/v Tween-20，pH 7.4），并通过 0.2 µm 真空瓶顶滤器过滤除菌。将缓冲液脱气 15 分钟。
    2. 将 HBS-EP 运行缓冲液连接至 SPR 仪器，在固定羧甲基化葡聚糖表面芯片后，使用“引液”功能平衡系统。启动手动运行，流速为 30 μL min-1，通过交替注入 30 mM 盐酸和 25 mM 氢氧化钠（每种各两次），在流速 30 μL min-1 下处理 1 分钟，对流路 1 和 2 的芯片表面进行预处理。
    3. 在 10 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.0）中配制 300 µL 浓度为 500 mg·L-1 的 Protein A 溶液。解冻含有 0.4 M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和 0.1 M NHS 的试剂瓶，于 16,000 x g 离心 1 分钟，然后混合 70 μL EDC 和 70 μL NHS。
    4. 将 EDC/NHS 混合液和 Protein A 溶液转移至 7 mm 塑料样品瓶中，放入样品架。以 10 μL min-1 的流速向流路 1 和 2 注入 EDC/NHS 混合液，持续 10 分钟，以活化羧甲基化葡聚糖芯片表面。
    5. 以 15 μL min-1 的流速向流路 2 注入 Protein A 溶液，持续 15 分钟，使 Protein A 与活化的羧甲基化葡聚糖表面偶联。
    6. 在 Protein A 偶联过程中，解冻一瓶 1.0 M 盐酸乙醇胺（pH 8.5），于 16,000 x g 离心 1 分钟。将 150 µL 转移至 7 mm 塑料样品瓶并放入仪器。当步骤 7.3.5 完成后，以 10 μL min-1 的流速向流路 1 和 2 注入盐酸乙醇胺溶液，持续 7 分钟，以封闭芯片表面。
    7. 通过交替注入 30 mM 盐酸和 25 mM 氢氧化钠（每种各两次），在 30 μL min-1 流速下处理 0.5 分钟，对流路 1 和 2 的芯片表面进行再次预处理。
    8. 在 HBS-EP 运行缓冲液中配制浓度为 500 µg·L-1 的 2F5 抗体标准品，并将含 2F5 的样品用 HBS-EP 缓冲液稀释至终浓度为 20–1,000 µg·L-1。以 30 μL min-1 的流速向流路 1 和 2 注入样品和标准品，持续 3 分钟。每检测 15 个样品后注入一次 2F5 标准品。
    9. 对每个样品，将流路 2（检测池）的响应单位（RU）信号减去流路 1（参比池）的信号，根据 2F5 标准品注入的 RU 信号计算抗体浓度。
    10. 每次样品或标准品注入后，以 30 μL min-1 的流速向流路 1 和 2 注入 30 mM 盐酸 0.5 分钟，以再生芯片表面。
    11. 将步骤 6.4 中每个穿流样品的 2F5 浓度对穿流体积作图，获得 2F5 突破曲线。计算当穿流中 2F5 浓度达到上样浓度 10% 时所注入的 2F5 量，以获得 10% 动态结合容量（DBC）。
  4. 通过 LDS-PAGE 分析蛋白质样品。
    1. 打开一块即用型 4–12% BisTris LDS 聚丙烯酰胺凝胶，放入电泳模块中。将 800 mL 运行缓冲液（50 mM MES、50 mM Tris 碱、0.1% (m/v) SDS、1 mM EDTA，pH 7.3）加入模块，并添加 0.5 mL 抗氧化剂溶液。
    2. 在 1.5 mL 离心管中，将 10 µL 上样缓冲液与 4 µL 还原剂和 26 µL 蛋白质样品混合。在 80 °C 的金属浴中孵育 10 分钟。于 500 x g 离心 30 秒。
    3. 上样 LDS 聚丙烯酰胺凝胶（每道 10 µL 样品），另设一道上样 5 µL 预染蛋白标准品（10–180 kDa）。
    4. 关闭电泳槽并连接电源。电泳运行 40 分钟，恒压 200 V。
    5. 从电泳槽中取出凝胶。打开凝胶夹板，将凝胶置于摇床上，用去离子水洗涤 15 分钟（19 rpm）。随后在摇床上用染色液染色 1 小时（19 rpm）。
    6. 在摇床上用去离子水脱色 1 小时（19 rpm）。使用胶片扫描仪扫描凝胶。

结果

亲和配体的表达与纯化

融合蛋白DFE在温室种植的转基因烟草植株中得到表达，产量约为120 mg·kg-1 叶片质量，平均每株植物生物量约为130 g。DFE纯度为 <5%的TSP存在于焯烫前的粗提植物提取物中，但在加热处理后增加至约40% 70 °C 1.5 分钟，使沉淀析出 >97% 的宿主细胞蛋白。漂白步骤可轻松整合到收获与提取流程中（图1）且额外耗时少于2小时，包括水浴装置的准备。DFE的总回收量为23.5 mg kg1 纯度为 >90%。导致产物损失的步骤分别为漂烫、深层过滤和IMAC，具体损失分别为40%、27%和45%。深层过滤器的平均载量为135 ± 36 L m-2 (±SD，n=3），因此处于文献报道值的上限范围21。DFE 产量随植株年龄增加而提高（图2).

亲和配体在NHS活化层析柱上的固定化

在初步的偶联测试中，我们发现 HEPES 缓冲液（pH 8.3）可将偶联效率提高至 89% ± 6% (±SD，n=3）相较于78 ± 9% (±SD，n=3）时，达到制造商推荐的碳酸氢盐缓冲液的水平。因此，后续所有偶联实验均采用HEPES缓冲液。为优化DFE与NHS活化的交联琼脂糖树脂的偶联效率，选用实验设计（DoE）方法。固定在树脂上的DFE绝对量随注入柱中DFE质量的增加而上升，并在约15 g时趋于平缓·L-1 而随着注入更多的DFE，偶联产率持续下降（图2。偶联产率也 >在酸性缓冲液中降低了50%，表明需要针对每种配体逐案筛选合适的偶联条件。通过实验设计（DoE）软件中的数值优化工具，确定了在偶联产率、固定化DFE的绝对量以及柱成本方面的理想条件。最理想的条件（pH 9.0，每1 mL交联琼脂糖树脂负载7.0 mg DFE）位于一个宽广的平台区域，因此具有较强的稳健性。DFE分子在偶联后仍保持其红色荧光，且颜色强度与固定化DFE的总量相对应图2因此，柱子颜色可作为简单的质量控制参数，用于评估偶联效率和柱子质量。荧光结果还证实，DFE融合蛋白以天然DsRed的四聚体形式组装。

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图2：DFE固定化条件的优化，使用NHS活化的交联琼脂糖树脂。 （A）采用LDS-PAA凝胶电泳并结合蛋白印迹法检测未烫漂和烫漂后的转基因DFE植物提取物的匀浆液及洗脱样品。植物分别在播种后38、45或52天收获。蛋白印迹使用抗His6抗体进行检测5。（B）固定化DFE亲和配体总量与偶联pH值以及注入NHS活化交联琼脂糖柱的纯化DFE总质量之间的关系。红色圆点表示用于构建响应面模型的实际实验点。（C）偶联反应完成后的DFE亲和层析柱。图中编号对应于B图中标注的偶联条件。dps = 播种后天数。请点击此处查看该图的放大版本。

使用DFE亲和树脂检测2F5的分离

重组2F5抗体在瞬时条件下产生于 Nicotiana benthamiana 在植物生长室中培养的植物5使用偶联了约 7.0 mg 纯化 DFE 的亲和柱（步骤 6）检测从粗制植物提取物中捕获 2F5 的效果。蛋白 A 核酸树脂的洗脱通常采用酸性缓冲液（pH ~3.3）进行。13因此，我们首先评估了不同低pH洗脱缓冲液（pH 6.0–3.25）用于DFE柱的洗脱效果。2F5在pH低于4.5时可成功洗脱，在pH 3.25时回收率最高，约为35%。然而，低pH洗脱使抗体（通过SPR光谱法确认）和DFE配体（表现为颜色消失及动态结合载量降低）均失活。 图3）。后者是预料之中的，因为天然DsRed在pH下会变性 <4.022,23为避免产物和配体发生变性，我们测试了氯化镁作为替代洗脱剂，因其此前已被用于从其他亲和树脂中洗脱单克隆抗体241.25 M 的氯化镁浓度足以从 DFE 亲和树脂上洗脱 2F5，回收率达 105 ± 11% (±SD，n=3）和纯度97 ± 3% (±SD，n=3）。该性能与Protein A树脂相当25,26. 平衡解离常数（KD) 经DFE纯化的2F5抗体与合成配体Fuzeon的结合亲和力为791 pM，而经Protein A纯化的对应抗体则为763 pM5此外，在总共25次结合-洗脱循环中，树脂未观察到明显的颜色损失。DFE亲和树脂在2F5穿透率为10%时的动态结合载量（DBC）在25个循环过程中线性下降至初始值的约15%图3).

figure-results-2
图3：使用DFE亲和树脂从澄清的植物提取物中分离2F5的检测结果。 (A) 使用pH值在4.0–3.0范围内的不同缓冲液进行一次洗脱循环后，以及在pH 6.0条件下进行中和步骤后的DFE亲和树脂。(B) 使用1.25 M或4.00 M氯化镁作为洗脱液，进行一次和六次2F5纯化循环后的DFE亲和树脂。(C) 前端加载实验（穿透曲线）的色谱图，用于测定使用氯化镁作为洗脱液时DFE树脂的循环依赖性动态结合容量。穿透曲线在4.0 M和1.25 M氯化镁洗脱缓冲液以及不同循环次数下测得。(D) 使用1.25 M氯化镁作为洗脱液时DFE树脂的循环依赖性动态结合容量。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

新型亲和树脂的应用

我们已证明，通过将含有针对单克隆抗体（mAb）特异性表位的配体固定于NHS活化的交联琼脂糖上，可制备用于捕获单克隆抗体的定制亲和层析树脂。设计此类树脂需知晓表位序列，并使用线性表位。所获得的树脂在单克隆抗体捕获方面具有优势，因其有望替代昂贵的Protein A亲和层析步骤。在本案例研究中，2F5与DFE之间的相互作用由表位–互补位结合介导，因此我们的配体相较于结合大多数鼠源和人源IgG Fc区的Protein A应具有更高的选择性。由于每种单克隆抗体均需单独的配体，该方法初看可能仅适用于大规模生产的抗体。然而，若将本方法与快速的基于植物的瞬时蛋白表达技术相结合，可在不到两周的时间内以极少的工作量制备出新的亲和配体2728。因此，该方法也适用于小规模单克隆抗体的纯化。

亲和配体的生产及其潜在改进

植物为亲和配体（如本案例研究中所述的DFE融合蛋白）提供了一种快速且安全的生产平台5,29,30。对植物材料进行热烫处理可显著减少宿主细胞蛋白的含量，仅需一步即可完成，并且易于整合到标准的澄清流程中。然而，在当前的实验条件下，配体的回收率较低，这可能是由于其热稳定性中等，以及部分非特异性结合至滤膜层所致，其他产品也已有类似报道31,32,33。因此，通过蛋白质工程手段提高载体的热稳定性，未来可能有助于提升配体的产率，这一点已在疟疾疫苗候选分子CCT、抗肿瘤酶PpADI或一种中温型β-葡萄糖苷酶的研究中得到证实34,35,36。深度过滤步骤同样如此，通过蛋白质工程优化可能有助于降低蛋白与滤材之间的非特异性结合37。此外，通过使用絮凝剂或滤材添加剂来提高整体澄清效率，也有望降低DFE及类似配体的生产成本38,39。

当使用DsRed作为载体时，它会形成四聚体复合物。这一特性具有优势，因为它增加了每个配体上的表位数量，但也可能使配体在亲和层析过程中更容易发生解聚或变性。因此，使用如mCherry这样的单体载体蛋白可能更为理想，因为mCherry在低pH条件下稳定40，且通过引入表位的串联重复序列可提高配体的结合强度，从而增加树脂的载量5,26,41。对于结构简单的载体-表位蛋白（即不含二硫键或翻译后修饰的蛋白），采用微生物表达系统可降低生产成本，使这类配体在成本上更接近Protein A。例如，绿色荧光蛋白已在细菌细胞中成功表达，产量约为~1 g·kg-1生物量，这将显著降低配体的生产成本42。

无论采用何种表达宿主，在偶联过程中都需要使用经纯化的亲和配体，以最大限度减少宿主细胞蛋白或培养基成分的固定化，否则会降低树脂的选择性和载量。在IMAC纯化中引入多聚组氨酸标签可在单步操作中将纯度提高至约90%，从而实现快速且低成本的配体生产5,43,44。然而，融合标签的位置至关重要，因为它可能在空间位阻上影响表位结合，或导致标签或表位从载体上发生裂解45,46。

亲和配体在NHS活化层析柱上的固定化

固定化操作可手动进行，也可使用层析系统完成。由于每根层析柱所需的缓冲液体积较小，手动操作似乎更具优势（例如可产生最少的废液体积）。然而，当需要多个或更大规格的层析柱时，层析系统更易于控制偶联条件（如调节流速），因此在动态结合载量（DBC）方面更有可能获得可重复的结果。我们的数据表明，偶联缓冲液及其pH值对偶联效率和整体柱成本具有重要影响。因此，筛选影响偶联反应的因素，并针对每种载体蛋白（甚至每种载体-配体融合物）优化这些条件，可提高偶联效率和树脂性能，我们推荐采用这一策略。

使用DFE亲和树脂检测2F5的分离

树脂的产率和纯度是其性能的重要指标，在DFE的情况下，我们实现了105 ± 11%（±标准差，n=3）的产率和97 ± 3%（±标准差，n=3）的纯度，这与基准Protein A树脂的性能相当25,26。对于一般树脂（尤其是基于亲和配体的树脂）而言，另一个关键性能指标是产品穿透10%时的动态载量（DBC），因为该参数会影响特定工艺所需树脂的用量，从而影响成本。DFE配体的初始DBC约为4 g·L-1树脂，这一数值在相似条件下（仅2分钟接触时间）约为Protein A相应值的13%25,47，但与使用相同2分钟停留时间的其他定制亲和树脂（如抗FSH免疫亲和配体）相比，约高出15倍48。经过25次结合-洗脱循环后，DFE的DBC下降至初始值的15%，而商用Protein A树脂在相同DBC损失下则需要超过50次循环49。然而，需要指出的是，我们的载体尚未像Protein A那样经过充分优化，后者在过去四十年中已得到系统研究和持续改进8。

迄今为止，我们通过将低pH洗脱缓冲液改为高浓度氯化镁，提高了树脂的稳定性和产物回收率（图3），该方法此前已有研究推荐13。在经历25次结合-洗脱循环后，亲和配体特有的红色并未显著褪去，因此我们推测，澄清植物提取物中的内源性植物蛋白酶31可能截断了配体的表位，从而使其失活。因此，设计抗蛋白酶降解的连接臂以连接载体与表位，可能有助于在更多循环中维持初始的动态结合载量（DBC）。鉴于DFE配体表达与纯化的快速简便性、其与商用层析树脂的简单偶联过程，以及其优异的产物得率和纯度，我们认为，该方法可作为Protein A的合适替代方案，用于纯化不能与Protein A结合的单克隆抗体及其抗体衍生物，特别是当载体和连接臂的优化能够进一步提升DBC和配体稳定性时。这一假设得到了DFE纯化与Protein A纯化的2F5抗体解离常数差异较小的支持5，表明我们的新型亲和配体能够回收高质量的单克隆抗体。

该方法的优势与当前局限性

将亲和配体作为与载体蛋白的基因融合体进行表达，可提高其在水性缓冲液中的溶解度，从而更好地适用于典型的配体偶联条件。相比之下，由固相多肽合成获得的空白多肽在这些条件下可能因序列本身50而溶解度有限，且该序列无法改变，因为它由待纯化单克隆抗体所识别的表位氨基酸序列决定。因此，其他研究者已采用在树脂上直接合成多肽配体的方法51。所获得树脂的静态结合容量较高（约80 g·L-1），但树脂制备过程耗时较长，未报道动态结合容量，且所得纯度和回收率低于本方法。在实验室规模下，融合蛋白配体的另一个优势在于，配体及其变体可通过一种易于使用的高效表达系统快速地进行表达、纯化和测试，所需工作量极小52。

本方法目前存在的两个局限性是动态结合载量较低，仅为 3 g·L-1，以及在连续进行 25 次结合-洗脱循环后，其载量下降 90%5。未来可通过采用较温和的上样条件，并以经工程化改造的、更稳定的 DsRed 载体替代当前的 DsRed 载体，分别解决上述问题。例如，将目前的接触时间从 2 分钟延长至 4 分钟，有望使动态结合载量翻倍，这一点已在某些 Protein A 介质中得到证实26。

故障排除

下表列出了在本实验方案中可能遇到的潜在问题，并提供了相应的解决建议（表1）。

表1：可能遇到的问题及相应的解决方法。
实验步骤问题原因解决方法
1植物未生长生长条件不佳检查肥料的pH值和电导率
检查温度和光照条件
2 和 3提取后存在大量宿主细胞蛋白沉淀不完全检查烫漂过程中的温度
检查烫漂浴中的搅拌情况
2 和 3在植物提取物中未检测到目标产物烫漂温度过高检查烫漂过程中的温度和pH值
烫漂缓冲液pH值过低
3提取后仍有大量茎或叶碎片残留搅拌机混合不充分确保植物材料在搅拌机中未形成堵塞
3深层过滤过程中压力迅速升高滤器选择或安装方向错误检查滤器类型和安装方向
4洗脱时融合蛋白量少 / 大量融合蛋白出现在穿流液中IMAC树脂未正确负载金属离子检查IMAC树脂是否已正确负载金属离子
融合蛋白丢失了亲和标签避免在植物培养过程中暴露于强烈阳光和高温
4浓缩过程中融合蛋白丢失融合蛋白结合到膜上检查膜的类型
确保浓缩倍数不过高
5偶联产率低偶联试剂添加顺序错误检查试剂标签及添加顺序
偶联前柱子准备不当检查柱子准备的条件
5 和 6mAb产率低植物生物量中mAb表达水平低检测生物量中mAb的表达水平
配体密度低检查融合蛋白制备物的纯度
7Bradford测定中蛋白浓度极低或极高移液过程中产生气泡检查96孔板中是否存在气泡
7SPR检测中mAb浓度偏低Protein A芯片性能受损与已知浓度的标准mAb结果进行比较
样品稀释错误检查稀释倍数和缓冲液

表1：故障排除。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢 Ibrahim Al Amedi 培育转基因烟草植株，感谢 Thomas M. Rademacher 博士提供烟草表达载体。作者谨此感谢 Richard M. Twyman 博士在编辑方面提供的帮助，以及 Markus Sack 就 DFE 亲和配体结构所进行的富有成效的讨论。本研究部分由弗劳恩霍夫协会内部项目（资助编号：Attract 125-600164）以及北莱茵-威斯特法伦州“网络化自适应生产”卓越中心项目（资助编号：423）资助。本研究还得到了德国研究基金会（DFG）在研究培训组“靶向肿瘤的药物递送”项目（资助编号：331065168）框架内的支持。GE 医疗集团支持了本文的开放获取出版。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 升/20 升桶n/an/a烫漂设备
2100P 便携式浊度计Hach4650000浊度计
ÄKTApureGE Helthcare29018226色谱系统
Allegra 25RBeckman Coulter369434离心机
胺偶联试剂盒GE HealthcareBR100050SPR 芯片偶联试剂盒
胺偶联试剂盒GE HealthcareBR100050SPR 芯片偶联试剂盒
抗体 2G12Fraunhofer IMEn/aSPR 定量标准品
搅拌机Waring800EG搅拌机
BP-410Fuhr2632410001袋式过滤器
CanoScan 5600FCanon2925B009扫描仪
50 mL 自立式离心管Labomedic1110504反应管
螯合 Sepharose FFGE Helthcare17-0575-01色谱树脂
Cond 3320WTWEKA 3338电导率仪
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n/a实验设计软件
Discovery CompfortGilsonF81029多通道移液器
磷酸氢二钠Carl Roth GmbH4984.3培养基组分
多种玻璃瓶Schott Durann/a玻璃瓶
Dri Block DB8TechneZ381373加热金属块
DsRedFraunhofe IMEn/a标准品
EDTACarl Roth GmbH8043.2缓冲液组分
EnSpirePerkin Elmer2390-0000酶标仪
ETHG-912Oregon Scientific086L001499-230温度计
F9-CGE Helthcare29027743馏分收集器
Ferty 2 MegaKammlott5.220072肥料
Forma -86°C 超低温冰箱ThermoFisher88400冰箱
HEPESCarl Roth GmbH9105.3缓冲液组分
Hettich Centrifuge Mikro 200Hettich2400离心机
HiPrep 26/10GE HelthcareGE17-5087-01色谱柱
HiTrap NHS-活化 Sepharose HP，1 mLGE Helthcare17-0716-01色谱柱
盐酸Carl Roth GmbH4625.1缓冲液组分
咪唑Carl Roth GmbH3899.2缓冲液组分
K700Pall5302305深层过滤层
KM02 basicIKAn/a磁力搅拌器
KS50P 60DPallB12486深层过滤层
L/S 24MasterflexSN-06508-24管路
Lauda E300Lauda Dr Wobser GmbHZ90010浸入式循环器
氯化镁Carl Roth GmbHKK36.2缓冲液组分
Masterflex L/SMasterflexHV-77921-75蠕动泵
Minisart 0.2 µmSartorius16534K滤器单元
Nalgene Rapid-Flow PES 瓶顶过滤器Thermo Fischer Scientific595-4520SPR 缓冲液真空过滤
硫酸镍Carl Roth GmbHT111.1缓冲液组分
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS 凝胶InvitrogenNP0336BOXLDS-PAA 凝胶
Novex X-cell Mini CellInvitrogenEI0001PAGE 电泳槽
NuPAGE 20x 电泳缓冲液InvitrogenNP0002缓冲液浓缩液
NuPAGE 抗氧化剂InvitrogenNP0005抗氧化剂
PageRuler 蛋白标准品（10-180 kDa）Invitrogen26616蛋白标准品
带孔桶n/an/a烫漂
PH 3110WTW2AA110pH 计
PowerPac HCBiorad1645052电泳模块
来自 Staphylococcus aureus 的蛋白 ASigma-AldrichP7837-5MGSPR 芯片包被
Sephadex G-25 细粒，交联葡聚糖GE Helthcare17003301色谱树脂
硅胶勺n/an/a勺子
Simply Blue SafeStainInvitrogenLC6060凝胶染色液
乙酸钠Carl Roth GmbH6773.1缓冲液组分
乙酸钠Carl Roth GmbHX891.1培养基组分
叠氮化钠Sigma AldrichS2002-100G培养基组分
氯化钠Carl Roth GmbHP029.2缓冲液组分
柠檬酸钠Carl Roth GmbHHN13.2缓冲液组分
亚硫酸氢钠Carl Roth GmbH243973-100G培养基组分
磷酸钠Carl Roth GmbHT877.2培养基组分
SPR 亲和传感器 - 高容量胺Sierra Sensors GmbH/Bruker DaltonicsSPR-AS-HCASPR 芯片
SPR-2/4 表面等离子共振分析仪Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonicsn/aSPR 设备
SSM3Stuart10034264微型旋转摇床
加热容器，20 LClatronicn/a烫漂室
无菌注射器，2 mLB. Braun4606027V注射器
注射器接头（Luer F 联通接头）GE Helthcare181112-51注射器适配器
TE6101SartoriusTE6101精密天平
Tween-20（聚山梨酯）Merck8170721000缓冲液组分
Unicorn 6.4GE Helthcare29056102色谱软件
真空袋Ikea203.392.84植物储存
VelaPad 60PallVP60G03KNH4滤器外壳
Vortex-Genie 2Scientific industriesSI-0236涡旋振荡器
XK-26/20 柱套GE Helthcare28-9889-48色谱柱

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