叶绿体是定义植物的细胞器1.与许多其他代谢、发育和信号功能一起，叶绿体负责光合作用——即利用阳光能量驱动生命细胞活动的过程。因此，叶绿体不仅对植物至关重要，对依赖植物的众多生态系统和农业同样重要。叶绿体由数千种不同的蛋白质组成，其中大多数通过细胞核编码并从细胞质导入，然后被引导到多个明显不同的器官内区室之一。为了更全面地理解叶绿体的发育和功能，并推动涉及叶绿体操控的生物技术策略，以应对与粮食安全或生物能源相关的全球挑战，确定重要叶绿体蛋白的靶向、定位和相互作用至关重要。本方法集描述了一组关键且互补的技术，可用于实现这些目标。该收藏主要聚焦于广泛使用的模式植物拟 南芥（Arabidopsis thaliana ，蓟花），但这些方法也可以被应用到其他生物身上。
该文集描述了两种不同技术，用于分析核编码蛋白在双膜包膜中叶绿体的导入情况。Ling和Jarvis的文章2描述了一种体外方法，将分离的叶绿体与放射性标记的前体蛋白一起培养。叶绿体吸收前体蛋白的程度通过监测转运肽（靶向先导序列）切割引起的蛋白质大小变化，利用SDS-PAGE和磷光成像来确定。本方法源自一种已用于体外研究叶绿体蛋白导入数十年的方法3,4，并包含了评估进口机制对工厂所经历应力条件响应性的额外步骤。另一方面，Lee等人6的文章描述了一种基于在完整细胞（原生体）中瞬时表达携带荧光蛋白结构域的嵌合前体蛋白的体内方法。在该检测中，叶绿体蛋白的输入范围可以通过两种不同方式进行测量：通过使用荧光显微镜监测荧光信号的定位和强度;以及通过免疫印迹分析转运肽切割导致的蛋白质大小变化。这两种方法高度互补，结合使用时能产生令人信服的结果。
一旦蛋白质被穿过包膜进入叶绿体，其转运肽被移除，它可能会在基质（细胞器的主要内部水腔室）中形成最终构象，或进入多种内部分选途径之一。作为高度丰富的光合作用复合物所在地，类囊体膜是此类内部分选的重要场所;事实上，类脑囊核蛋白靶向涉及多条机制不同的通路。Asher等人7的文章描述了一系列体外方法，使不同的类囊核蛋白易位途径得以研究。这些方法涉及将分离的类脑果体与放射性标记的前体蛋白以及某些情况下浓缩的基质提取物一起培养。通过评估靶向信号的切割以及利用SDS-PAGE和磷光成像对蛋白质免受外源热解素蛋白酶的保护，监测该蛋白被类囊体吸收的程度。当然，类囊体并非叶绿体的唯一亚区室，通常也希望能够评估其他区室。在这方面，Bouchnak等人8的文章尤为重要，因为它描述了叶绿体亚分馏以产生高度纯度样品的方法，这些样品对应于包膜、基质和类囊体。制备完成后，这些组分可以通过免疫印迹和/或质谱分析，以提供关于叶绿体蛋白亚细胞器定位的丰富信息9。
关于蛋白质间相互作用和多蛋白复合物组装的分析，文献集中描述了两种不同的方法。Shanmugabalaji 等人的文章10提出了一种叶绿体多蛋白复合物亲和纯化的方法。该技术分析表达目标复合物中被设计携带亲和标签（即串联亲和纯化标签，TAP）成分的转基因植物。该标签与惰性基体强结合的能力被用作纯化策略的一部分。本方法专注于纯化叶绿体蛋白输入机制（包括嵌入膜中的多蛋白复合物TOC和TIC，1），但原则上也可以调整用于研究叶绿体11中存在的其他多蛋白组装。Rantala等人12的文章描述了一种基于电泳在本地条件下进行复杂表征的补充方法。该技术如图所示，涉及使用温和的非离子洗涤剂从纯化的类囊体中解放光合作用复合物，然后使用蓝色本体（BN）-PAGE分离。复合物的初级分辨率之后，可以在变性条件下进行第二维电泳，从而使得可视化在第一维度中识别的每个复合物的各个组成部分。与TAP方法类似，这种原生PAGE方法也可成功应用于细胞器内的其他蛋白质复合物研究。无论采用哪种方法，纯化后的复合物都可以通过多种方式进行分析，包括免疫印迹和质谱。
本方法集中的文章共同呈现了一套强大的互补技术，结合现有资源15,16，有望大幅提升我们对叶绿体生物生成和功能的多方面理解，特别是与细胞器蛋白质组密切相关的方面。由于叶绿体负责陆地光合作用初级生产的大部分，并且在植物对环境（包括生物和非生物应激）的反应中扮演着重要角色，这些卓越的细胞器必将在未来多年内成为全球基础和应用研究的主要焦点。