叶绿体是植物特有的细胞器1。除了参与多种代谢、发育和信号传导功能外，叶绿体还负责光合作用——即利用太阳能为生命活动提供细胞能量的过程。因此，叶绿体不仅对植物本身至关重要，也对依赖植物的众多生态系统以及农业生产具有重要意义。叶绿体由数千种不同的蛋白质组成，其中大多数蛋白质由细胞核编码，在细胞质中合成后被导入叶绿体，并进一步定向至叶绿体内若干结构明确的亚细胞区室1。为了更全面地理解叶绿体的发育与功能，并推动针对粮食安全或生物能源等全球性挑战的叶绿体改造生物技术策略，明确重要叶绿体蛋白的靶向定位、空间分布及其相互作用显得尤为关键。本方法合集介绍了一系列至关重要且相互补充的技术手段，可用于实现上述目标。该合集主要以广泛使用的模式植物Arabidopsis thaliana（拟南芥）为研究对象，但所述方法也可经适当调整后应用于其他生物体。
该系列包含两种不同技术的描述，用于分析细胞核编码的蛋白质穿过叶绿体双层膜包被进入叶绿体的过程。Ling 和 Jarvis2 的文章介绍了一种体外方法，其中将分离的叶绿体与放射性标记的前体蛋白共同孵育。通过监测转运肽（靶向引导序列）切割所导致的蛋白质大小变化，并利用 SDS-PAGE 和磷屏成像技术，来确定叶绿体摄取前体蛋白的程度。该方法是在已有数十年历史的体外研究叶绿体蛋白导入技术基础上发展而来的3,4，并增加了新的步骤，可用于评估蛋白导入机制对植物所经历的胁迫条件的响应能力5。另一方面，Lee 等人6 的文章描述了一种基于瞬时表达嵌合前体蛋白的体内方法，该前体蛋白携带一个荧光蛋白结构域，并在完整细胞（原生质体）中表达。在此检测中，叶绿体蛋白导入的程度可通过两种方式追踪：一是利用荧光显微镜监测荧光信号的定位和强度；二是通过免疫印迹分析转运肽切割所引起的蛋白质大小变化。这两种方法高度互补，联合平行使用时可获得令人信服的结果5。
蛋白质一旦被转运穿过被膜进入叶绿体，且其转运肽已被切除，便可能在基质（细胞器内部主要的水相区室）中折叠为最终构象，或进入若干内部分选途径之一1。作为高度丰富的光合作用复合物所在地，类囊体膜是此类内部分选的重要靶位点；事实上，类囊体蛋白的靶向运输涉及多种机制上不同的途径。Asher 等人7的文章描述了一系列体外方法，可用于研究不同的类囊体蛋白转运途径。这些方法包括将分离的类囊体与放射性标记的前体蛋白共同孵育，在某些情况下还需加入浓缩的基质提取物。通过分析靶向信号肽的切割情况以及蛋白对胞外添加的热稳定蛋白酶（thermolysin）的抗性，结合SDS-PAGE和磷屏成像技术，来监测蛋白被类囊体摄取的程度。当然，类囊体并非叶绿体中唯一的亚区室，通常也需要具备评估其他区室的能力。在这方面，Bouchnak 等人8的文章尤为重要，该文描述了叶绿体亚组分分离的方法，可获得对应于被膜、基质和类囊体的高纯度样品。制备完成后，这些组分可通过免疫印迹和/或质谱分析，从而提供大量有关叶绿体蛋白亚细胞器定位的信息9。
关于蛋白质-蛋白质相互作用及多蛋白复合物组装的分析，本合集介绍了两种不同的方法。Shanmugabalaji 等人10的文章提出了一种用于叶绿体多蛋白复合物亲和纯化的方法。该技术涉及分析转基因植物，这些植物表达目标复合物中的一个组分，且该组分被改造为携带亲和标签（即所谓的串联亲和纯化标签，TAP标签）。该标签能够强烈结合到原本惰性的基质上，这一特性被用于纯化策略中。所介绍的方法特别聚焦于叶绿体蛋白导入机器的纯化（该机器由嵌入被膜的多蛋白复合物TOC和TIC组成1），但原则上也可加以调整，用于研究叶绿体中存在的其他多蛋白复合物11。Rantala 等人12的文章则描述了一种基于天然条件下电泳的互补性复合物表征方法。本文所述技术包括使用温和的非离子型去污剂从纯化的类囊体中释放光合作用复合物，随后通过蓝色天然PAGE（BN-PAGE）进行分离。在第一维实现复合物的初步分离后，可进一步在变性条件下进行第二维电泳，从而可视化第一维中各复合物所含的单个组分。与TAP方法类似，这种天然PAGE方法也可成功应用于研究该细胞器内的其他蛋白复合物13,14。采用上述任一方法所获得的纯化复合物，均可通过多种方式进一步分析，包括免疫印迹和质谱分析。
综上所述，本方法合集中所包含的文章提供了一套强大的互补技术，结合现有资源15,16，可显著增进我们对叶绿体发生及其功能多个方面的理解，尤其是与细胞器蛋白质组密切相关的方面。由于叶绿体负责地球上大部分光合作用的初级生产，并且在植物对环境（包括生物和非生物胁迫）响应中发挥关键作用，这些卓越的细胞器无疑将在未来多年内继续成为全球基础与应用研究的主要焦点。