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方法文章

在免疫缺陷小鼠中建立肝脏原位人眼葡萄膜黑色素瘤异种移植平台

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⸱

DOI：

10.3791/59941

⸱

2019年11月6日

 ,  , 
1Department of Diagnostic and Interventional Radiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 2Department of Surgery, National Hospital Organization, Kure Medical Cancer Center, 3Department of Medical Oncology, Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

本文内容

摘要

采用手术原位移植技术，将患者来源的肿瘤组织块植入小鼠体内，同时结合培养的人眼葡萄膜黑色素瘤细胞系进行针头注射，从而建立人肝转移性葡萄膜黑色素瘤的原位异种移植小鼠模型。

摘要

近几十年来，与体外培养的传统人源细胞系相比，在免疫缺陷小鼠中皮下移植的患者来源异种移植瘤或培养的人源细胞系被认为更能代表人类癌症的研究模型。近年来，小鼠体内原位移植的患者来源肿瘤异种移植（PDX）模型被开发出来，以更真实地模拟患者肿瘤的特征。肝脏原位异种移植小鼠模型有望成为一种有价值的癌症研究平台，有助于深入理解肿瘤生物学特性及药物治疗反应。然而，肝脏原位肿瘤移植通常较为复杂。本文介绍了我们建立患者来源的肝转移性葡萄膜黑色素瘤原位移植模型的操作方案。我们将人源肝转移性葡萄膜黑色素瘤细胞系移植至免疫缺陷小鼠体内。本方案采用两种技术均可实现稳定且较高的技术成功率：一种是通过手术将患者来源的葡萄膜黑色素瘤组织块进行原位移植，另一种是通过注射培养的人源细胞系悬液完成针头接种。此外，我们还描述了利用CT扫描检测肝脏内部肿瘤以及使用冻存肿瘤组织进行再移植以实现再植入的技术流程。综上所述，这些方案为转化医学研究中肝转移性葡萄膜黑色素瘤的肝脏原位移植小鼠模型提供了更为完善的实验平台。

引言

脉络膜黑色素瘤是西方国家成年人中最常见的眶内恶性肿瘤。在过去50年中，美国脉络膜黑色素瘤的发病率（每百万人5.1例）一直保持稳定1,2。该肿瘤起源于虹膜、睫状体或脉络膜中的黑色素细胞，一旦发生转移，其致死性极高。脉络膜黑色素瘤转移患者在初次诊断转移后1年内的死亡率为80%，2年内的死亡率高达92%。无论接受何种治疗，从转移诊断到死亡的间隔时间通常很短，少于6个月3,4。该癌症通过血液传播，倾向于主要转移至肝脏（89–93%）4,5。目前迫切需要建立有效的动物模型，以进一步研究肝转移性脉络膜黑色素瘤。在转化医学研究中，明确需要构建一种肝脏局部定植的转移性脉络膜黑色素瘤小鼠模型。

源自患者的肿瘤异种移植（PDX）小鼠模型有望为个体化医疗策略提供支持。这些模型可能具有预测临床结果的能力，可用于临床前药物评估，并适用于肿瘤的生物学研究6。典型的PDX模型是异位移植肿瘤的异种移植小鼠，其肿瘤位于皮下部位。大多数研究人员无需特殊训练即可进行皮下移植手术7,8，并且可以方便地监测皮下肿瘤。尽管皮下PDX模型在研究阶段已广泛应用，但在向实际应用转化过程中仍存在一些障碍。皮下移植迫使源自患者的肿瘤在与原发肿瘤不同的微环境中定植，从而导致移植失败和肿瘤生长缓慢9,10,11,12,13,14。相比之下，原位移植可能是构建PDX模型更为理想和合理的方法，因为它使用与原发肿瘤相同的器官环境15,16。

近期，我们建立了患者来源的肝转移性葡萄膜黑色素瘤组织在NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠中进行原位肝移植的手术操作方案，以及使用培养的人源肝转移性葡萄膜黑色素瘤细胞系进行针头注射的技术17,18。这些方案具有稳定且较高的技术成功率。我们还建立了可用于检测肝脏内部肿瘤的CT扫描技术，并开发了在PDX模型平台中对冷冻保存的肿瘤进行再移植的方法。我们发现，葡萄膜黑色素瘤异种移植模型能够维持原始患者肝脏肿瘤的特征，包括其组织病理学和分子特征。综上，这些技术为葡萄膜黑色素瘤在转化研究中的肝脏原位肿瘤模型提供了更优的实验平台。

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方案

根据机构审查委员会批准的方案，参与研究的患者应提供书面同意，允许将废弃的手术样本用于科研和遗传学研究。本方案严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》中的建议，并已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 收集新鲜的患者来源的肿瘤组织

  1. 在医院手术室中获取患者来源的肿瘤组织，组织可来自手术切除或穿刺活检。
  2. 将肿瘤组织置于含有汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的100 mL容器中，并置于冰上保存。
  3. 将组织转移至实验室的无菌操作台（生物安全二级）中。
  4. 应尽快进行步骤2。
    注意：出于安全考虑，排除已知感染HIV、乙型肝炎或丙型肝炎的患者。

2. 新鲜患者来源肿瘤组织的处理

  1. 将组织放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的50 mL离心管中，并置于冰上。用PBS洗涤组织：向管中加入PBS，弃去PBS，重复两次。
  2. 将组织转移至含有PBS的培养皿中，并置于冰上。
  3. 使用无菌镊子和剪刀去除组织的坏死部分。在步骤2.3至2.5期间保持组织湿润且低温。对于穿刺活检样本，跳过步骤2.3和2.5，不要切割样本。
    注意： 坏死组织通常在触碰时容易碎裂。
  4. 将组织切成1 mm3的立方体，用于手术肝植入。
  5. 将剩余组织在培养皿中切成2 mm的立方体。
  6. 将组织分别转移至含有4%甲醛的1.7 mm微量离心管中，用于组织学分析；另取一管用于基因组和蛋白质组分析。
  7. 将微量离心管放入装有液氮的液氮罐中。随后将管子转移至-80 °C超低温冰箱中长期保存。
    注意： 从患者体内取出样本至组织处理完成的时间不应超过30分钟。

3. 采用患者来源肿瘤组织的手术肝脏移植

  1. 将所有进入手术操作台的物品用70%乙醇喷洒消毒。
    注意：包括手术器械、加热垫和麻醉机。
  2. 测量棉签和无纺吸收布片的重量。
  3. 将小鼠放入诱导室，使用3–5%异氟烷蒸发器进行麻醉。
  4. 待小鼠完全麻醉后，将其仰卧置于加热垫上，并将异氟烷面罩罩住小鼠鼻部，以吸入1.5–3%异氟烷维持麻醉状态。
    注意：整个手术过程中小鼠必须始终置于加热垫上，否则可能导致低体温。
  5. 使用超细镊子轻刺小鼠足部，若无反应则确认麻醉深度足够。
  6. 术前使用27 G针头的微量注射器，在小鼠侧腹部皮下注射布托啡诺（0.6 mg/kg）。
  7. 用70%乙醇擦拭腹部，并将毛发向上下方向拨开。拨开毛发后，确认左肋下区域皮肤更易观察，便于切口。不要剃除腹部毛发。
    注意：术后毛发可遮盖切口部位，防止小鼠抓挠伤口。但根据机构标准，也可剃除毛发以降低切口感染风险。
  8. 涂抹碘伏，并使其充分吸收至皮肤内。
  9. 在小鼠体表覆盖无菌手术巾，中央留出直径2 cm的开口。
  10. 使用弯头超细镊提起腹壁皮肤，用弯剪做一条长约1 cm的横向左肋下皮肤切口。
  11. 将弯剪尖端插入切口皮下，轻轻张开剪刃以分离腹膜与皮肤，然后闭合剪刃并从切口退出。
    注意：切忌在小鼠体内张开或闭合剪刀，以免造成组织损伤和出血。
  12. 在腹膜下定位肝脏，透过腹膜观察其呈深红褐色。
  13. 使用弯剪在腹膜上做一条长约1 cm的横向切口。若切缘处腹膜动脉出血，应立即使用电凝止血。
  14. 一手用弯头超细镊夹住脂肪组织，另一手将棉签边缘插入左肝叶下方，并向下滚动棉签，将肝脏引出。
    注意：夹住脂肪组织至关重要，可防止脂肪组织黏附于棉签上。
  15. 将肝脏置于棉签上外翻，并放置于无纺吸收布片上。
    注意：该布片具有两个关键作用：稳定肝脏位置并吸收术中出血。
  16. 使用无菌11号手术刀片，在轻压切口部位的同时，于肝实质内做一处宽5 mm、深5 mm的切口，形成一个囊袋。
    1. 将刀片平行于肝脏表面水平切入。
    2. 用棉签按压切口部位以止血。
      注意：切勿使刀片垂直切入，否则会穿透肝脏并损伤肝中央的大血管。
  17. 向上滚动棉签以撑开切口，用弯头超细镊将一块1 mm3的肿瘤组织植入囊袋内。在撤出镊子的同时，反向滚动棉签并向下按压。
    注意：撤出镊子时用棉签按压切口部位，有助于防止肿瘤组织在囊袋内移位。
  18. 植入完成后，轻柔地将棉签从切口处移开，并尽快进入步骤3.19。
  19. 在切口处放置可吸收止血材料。
  20. 确认止血完全。若仍有出血，应在切口处追加止血材料。
  21. 使用镊子（建议使用钝头镊）将肝脏从布片上剥离，并将其放回腹腔内。
  22. 使用5-0可吸收缝线行双重结扎缝合腹膜。
  23. 使用5-0可吸收缝线行三重结扎缝合皮肤。
    注意：三重结扎有助于预防手术切口裂开。
  24. 观察小鼠直至其完全清醒，然后将其放回笼中。
  25. 测量术后沾有血液的棉签和布片重量，并与术前原始重量进行比较，以计算术中出血量。应将术中出血量控制在小鼠循环血量的10%以下。

4. 培养的人类葡萄膜黑色素瘤肝转移细胞系的收集与处理

  1. 准备培养的细胞。
  2. 收集细胞，并使用细胞计数仪计算细胞数量。
  3. 在15 mL离心管中制备含有10.0 × 106 个细胞的适量细胞悬液。
  4. 在室温下，将离心管以300 ×g 离心5分钟。
  5. 移除15 mL离心管中的上清液，保留管底的细胞沉淀。
  6. 向1.7 mL离心管中加入50 μL RPMI 1640培养基。
  7. 用剪刀剪去200 μL吸头的尖端，以扩大开口。
  8. 使用剪切过的吸头，将60 μL基底膜基质加入含有RPMI的1.7 mL离心管中。
  9. 在1.7 mL离心管中混合RPMI与基质，涡旋混匀。
  10. 将110 μL混合液加入15 mL离心管中的细胞沉淀中，然后将细胞悬液转移至新的1.7 mL离心管中。
  11. 在针头注射前将离心管置于冰上保存。

5. 将培养的人肝转移性葡萄膜黑色素瘤细胞系植入肝脏的手术针植入法

  1. 按照上述步骤 3.1 至 3.15 的方案进行操作。
  2. 使用带有 27 G 针头的微量注射器收集细胞悬液。
  3. 沿肝脏表面插入针头，并将针尖向深处推进 5 mm。
  4. 向肝脏内注射 20 μL 细胞悬液。
  5. 烧灼肝脏穿刺部位，防止注射的细胞外漏，并确认止血完全。
  6. 按照上述步骤 3.21 至 3.24 的方案进行操作。

6. CT 扫描

  1. 将小鼠在清醒状态下放入固定器中。
  2. 用无菌酒精棉片擦拭尾部，以进行消毒和扩张血管。
  3. 使用1 mL注射器连接27 G针头，经尾静脉注射100 µL CT造影剂。
  4. 注射后等待4小时再进行CT扫描。
    注意：造影剂需4小时才能被肝脏库普弗细胞充分摄取。
  5. 注射后4小时，将荷瘤小鼠置于诱导室中，使用3–5%气化异氟烷进行麻醉。
  6. 待小鼠完全麻醉后，将其俯卧位放置于CT设备上，并将异氟烷面罩置于小鼠鼻部，以吸入1.5–3%异氟烷维持麻醉状态。
  7. 用超细镊子轻刺小鼠足部，若无反应则确认麻醉状态适当。
  8. 进行持续15分钟的CT扫描。
  9. 扫描结束后，密切观察小鼠直至其完全苏醒，然后将其放回饲养笼中。
  10. 在CT图像上评估肿瘤是否存在，并测量肿瘤大小。
    注意：造影剂可增强正常肝实质，从而使未增强的肿瘤易于识别。注意不要将胆囊和胃误判为肿瘤。

7. 组织的收获与处理

  1. 使用 CO2 处死小鼠，随后通过将食指和拇指置于颅骨后方并拉住尾根部进行颈椎脱位。尽快进入步骤 7.2。
  2. 将小鼠置于仰卧位，并用 70% 乙醇喷洒腹部。
  3. 使用无菌镊子和无菌剪刀在剑突下方做一条 3 cm 的横向切口，以暴露腹腔器官。
  4. 切除肿瘤组织，并执行步骤 2.1 至 2.2。
  5. 在培养皿中将剩余的肿瘤组织切成 2 mm 的立方体。
  6. 将其转移至含有冻存液的冻存管中，用于冻存后重新移植。
  7. 将冻存管放入装有异丙醇的冻存盒中。
  8. 将冻存盒转移至 -80 °C 超低温冰箱中进行临时保存。切勿将含有冻存液的冻存管直接放入液氮罐中。需以 -1 °C/min 的冷却速率缓慢冷冻，以保存肿瘤组织。
  9. 次日，将冻存管转移至液氮罐中进行长期保存。

8. 再植入

  1. 在准备移植组织前，将冻存管置于装有液氮的液氮罐中保持冷冻状态。尽量减少组织在室温下的暴露时间，以维持其活性并提高移植成功率。
  2. 在37 °C水浴中解冻冻存的冻存管。
  3. 执行步骤2.2–2.4。
  4. 按照步骤3.1–3.24所述方法将解冻后的肿瘤植入小鼠体内。

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结果

采用肝袋法的手术原位移植可在六个月内以80%的高成功率将人源肝脏转移性葡萄膜黑色素瘤移植到小鼠肝脏中。移植瘤在肝脏内以单发肿瘤形式生长，不形成子灶结节（图1 和 图3A）。使用微针将培养的人源肝脏转移性葡萄膜黑色素瘤细胞直接注射至肝脏的手术原位接种技术在所有实验案例中均成功实现了肿瘤植入（图2 和 图3B）。然而，部分案例中观察到主瘤周围存在播散灶。CT成像中使用对比剂可检测肝脏内的肿瘤，包括直径低至1 mm的小肿瘤（图3B）。冷冻保存后的肿瘤再次移植可高效地在小鼠肝脏中重建肿瘤模型。经冷冻保存后重新移植的异种移植瘤保留了原始患者来源肿瘤及冷冻前肿瘤的生物学特性。

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讨论

目前的原位异种移植模型构建过程费力、耗时且成本高昂。肝癌的原位肿瘤异种移植小鼠模型早在二十多年前就已建立19,20,21。然而，该技术操作复杂，需要在显微镜下使用特殊的设备，例如微型持针器以及6-0至8-0的细缝线。必须小心缝合肿瘤和正常肝组织，以避免缝线损伤脆弱的肝组织。传统技术容易引发血肿和坏死等并发症22。近年来，一种改进的技术被开发出来以解决这些问题23。该改进技术采用可吸收止血材料代替缝线覆盖肝表面的肿瘤。然而，这种改进方法并不能完全将肝实质内的肿瘤完全包裹，部分肿瘤仍暴露于外部。我们开发了一种外科原位植入技术——肝袋法，可将肿瘤完全置于肝实质内部18。该方法在肝组织内创建一个“袋状”结构，为肿瘤提供天然的生长环境。与传统技术相比，肝袋法操作更简便，从手术开始起仅需几分钟即可完成肝内植入。该方法可在肝...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 M. Ohara、K. Saito 和 M. Terai 对手稿的审阅。作者感谢福克斯蔡斯癌症中心的 R. Sato 博士在编辑和英文润色方面提供的关键性审阅。本研究所描述的工作得到了邦妮·克罗尔研究基金、马克·温齐尔研究基金、托马斯杰斐逊大学眼黑色素瘤研究基金、大阪社区基金会以及大阪市立大学 JSPS KAKENHI 资助编号 JP 18K15596 的支持。A. Aplin 博士实验室的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助 R01 GM067893 的支持。本项目还获得了院长变革性科学奖和托马斯杰斐逊大学计划性倡议奖的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>材料、组织与动物
布托啡诺
CO2 储液罐
冻存液
Exitron nano 12000（基于碱土金属的纳米颗粒对比剂）Miltenyl Biotec130-095-700
含钙 HBSS 1x &镁康宁21-020-CM
人肝转移性葡萄膜黑色素瘤细胞系
肝脏中的人眼葡萄膜黑色素瘤组织所有组织操作均应在生物安全二级通风柜中进行。处理人体组织时需谨慎，务必佩戴手套并避免皮肤直接接触。应假设患者可能感染了人类免疫缺陷病毒（HIV）或其他高传染性病原体。不得处理已知携带感染性病原体的样本。
碘
异氟烷普渡产品67618-150-17
异丙醇Fisher ScientificA416-1避免麻醉剂与皮肤、眼睛直接接触及吸入麻醉剂。
液氮
Matrigel HCBD354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 小鼠杰克逊实验室55574至8周龄
PBS 1x，不含钙和镁康宁21-031-CM
RPMI 1640康宁10-013-CV
无菌酒精消毒垫（70%异丙醇）Nice-Pak 产品B603
4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液和光163-20145
70% 乙醇溶液Fisher Scientific04-355-122
<强>名称<强>公司<强>目录编号<强>评论
<强>仪器
可吸收性止血剂强生公司63713-0019-61
高压灭菌
体重测量
电灼Bovie MedicalMC-23009
细胞计数仪
离心机
棉签
冷冻容器NALGENE5100-0001
冻存管SARSTEDT72.379
弯头剪刀World Precision Instruments503247
弯曲超细镊子World Precision Instruments501302
无纺吸收性织物片
冷冻机
F/AIR 过滤罐哈佛仪器600979
加热垫
异氟烷蒸发器Artisan Scientific66317-1
液氮
液氮罐赛默飞世尔科技2123
微型计算机断层扫描西门子
持针器World Precision Instruments501246
培养皿Fisher ScientificFB0875713
移液器
喷雾瓶
无菌操作台生物安全二级柜
无菌11号手术刀AD外科手术A300-11-0
直头镊子World Precision Instruments14226
手术巾
尾静脉固定器Braintree ScientificTV-150-STD
水浴
1 mL TB 注射器配 27 G 针头BD309623
1.7 mL 离心管BioexpressC-3260-1
5-0 PDO缝合线AD 外科手术S-D518R13
15 mL 圆锥形离心管AZER SCIENTIFICES-9152N
27 G 针头BD780301
27 G 针头Hamilton7803-01
50 mL 圆锥形离心管AZER SCIENTIFICES-9502N
50 µL 微量注射器BD80630
50 µL 微量注射器Hamilton7655-01
100 mL 容器Fisher Scientific12594997
200μL形尖端

参考文献

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