方法文章

用于管状结构组织工程的核/壳打印支架

10.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59951

⸱

2019年9月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Institute for Development of Advanced Applied Systems (IRNAS), 3Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, University of Maribor

本文内容

摘要

本文展示了一种易于使用的核/壳式三维生物打印装置，可一步法制备中空支架，适用于血管及其他管状结构的组织工程。

摘要

三维（3D）打印核/壳结构丝材可直接制造具有稳定壳层的通道结构，该壳层在与液态芯材的界面处发生交联。后者在打印完成后被去除，从而留下中空管状结构。将增材制造技术（例如本文所述的、使用定制化[生物]墨水的技术，其在结构和生化特性上模拟天然细胞外基质[ECM]）相结合，是迈向先进组织工程的重要一步。然而，精确制造结构明确的构型需要针对所用材料优化的定制化制造策略。因此，采用一种可定制、操作简便且适用于广泛材料和应用的初始设置是合理的选择。本研究展示了一种易于制造且具有鲁尔兼容性的核/壳喷嘴，用于探索木堆结构的核/壳打印，并采用一种结构明确的海藻酸盐基支架材料配方进行了验证测试。

引言

可以说，组织工程（TE）的最终目标是在体外制造出功能性组织或器官，用于再生或替代人体受损或病变的部分1,2,3目前，组织工程（TE）领域的研究主要集中在该领域的各个独立方面（支架材料、制备工艺、细胞来源等）4,5，以及开发能够模拟其体内对应物基本特征的简单体外组织和器官模型。这类模型在许多应用中已具有实用价值，例如药物筛选和毒性研究，特别是在传统二维细胞培养无法模拟天然组织动态反应的情况下。6,7,8,9三维体外模型通常通过组合细胞构建10，物理化学信号11以及具有生物活性的分子12,13 在支架上，这些支架来源于脱细胞组织或人工构建 从头合成 来自生物或生物相容性材料14,15,16,17,18.

支架必须重现天然组织复杂的三维微结构和层级结构，才能使工程化组织具备类似于体内组织的功能19。尽管组织工程（TE）领域已取得显著技术进步，开发出具有生理相关性的类人工组织结构仍是一项挑战。较厚的组织（厚度 >200 µm）尤其成问题，主要受限于氧气和营养物质的扩散能力20。虽然在构建更大尺寸的组织结构方面已取得进展，但仍需重现细胞与血管之间高度接近的特性，以实现氧气和营养物质的输送，并促进代谢废物的清除。组织的血管化（或在组织结构内构建相互连通的三维血管网络）对于维持细胞活力以及促进体外工程化组织的功能至关重要，而在长期实验模型中实现这一目标尤为困难21,22。此外，目前尚未同时实现所需的分辨率、结构完整性和生物相容性23。

已有多种组织工程方法被提出，旨在构建类似血管的结构，并促进体外血管化。例如，接种内皮细胞（也可与成纤维细胞等其他细胞类型共培养），使其自组装形成微血管网络24；利用可促进内皮细胞生长的血管祖细胞和周细胞21,25；递送可诱导血管生成的促血管生成生长因子20,26；采用细胞片技术以实现对血管分层的控制20；以及构建高孔隙率的支架结构以促进血管生成27。上述方法主要聚焦于诱导血管生成，通常需要大量额外的生长因子（如VEGF）并耗费较长时间才能形成。然而，这些方法最大的缺点在于其可重复性有限，且对血管模式的空间控制能力不足，通常导致组织构建物内血管分布随机，未必能有效支持灌注。

增材制造技术（AM，例如3D生物打印）正越来越多地用于利用生物材料或生物相容性材料制备三维结构，以构建适用于组织工程（TE）的支架。目前多种增材制造方法正在并行发展和应用（例如基于喷墨和微挤出的方法、不同类型的光刻技术），旨在制造在结构、生化特性和功能方面模拟天然组织的支架。各种具体技术均具有特定的优势与局限性28，因此研究人员正在探索多种改进策略（如微图案化、诱导血管生成等），以提升构建大尺寸、复杂且稳定的血管网络的能力22,29,30。

在这些技术中，挤出式生物打印是最常用的方法，尤其因其可兼容的材料范围广泛（通常对细胞友好的过程28,31,32）以及在应用方面的极高灵活性（例如嵌入式打印和牺牲式打印23,33、中空结构的构建34,35等）。当前研究面临的主要挑战包括从二维向三维结构的转化、高空间分辨率下致密中空管网络的形成，以及在细胞培养条件下流体流动过程中整体的机械完整性与形状保真度30。

实现可灌注组织最直接的方法是在构建体中制造相互连通的通道网络。在组织支架内创建此类可灌注通道有望解决上述诸多问题，因为它可立即实现营养物质和氧气的扩散，同时清除代谢废物，从而避免构建体内形成坏死区域36。这些通道还可接种内皮细胞（ECs），在三维组织模型中充当人工血管37。从最基本的角度来看，血管结构可由一个中空通道、一层柔软的内皮细胞层以及一个较硬的外壳组成。近年来，利用同轴针头以核/壳方式挤出两种不同材料的3D打印技术受到广泛关注38,39,40,41，因其能够制造中空管状结构。

与传统的微挤出3D打印类似，核壳结构打印采用同轴喷嘴（例如., 两根不同直径的针沿同一轴线同轴排列，较粗的针包裹较细的针。由此可同时挤出两种材料，其中一种形成中心丝状“内核”，另一种则形成“外层”包壳41迄今为止，同轴生物打印已被用于制造具有实心结构的材料42核/壳43，以及中空纤维40,44然而，所使用的材料尚未在细胞活性和打印结构的机械强度之间达到最佳平衡。如前所述，该技术能够结合具有不同力学性能的生物材料，其中较硬的材料可为较软的材料提供支撑。更重要的是，若将支架材料（如海藻酸钠、羧甲基纤维素）作为壳层挤出，而由交联剂（如氯化钙）组成的芯层从内层毛细管中释放，随后在打印后将其冲洗去除，则可一步法制造出连续的中空管状结构。45.

基于此，开发了一种简单且可重复的一步法，用于构建结构明确且可灌注的支架，以用于血管结构及其他管状组织的工程化构建。为了实现一种成本效益高的技术，理想情况下制备过程应为单步操作。因此，将一种同轴（芯-壳）结构装置进行改造并整合到3D生物打印机中。该装置的基本设计包含一个由金属制成的中心喷嘴，以避免注射过程中发生形变，其外围环绕设置一个直径更大的第二喷嘴。这种同轴喷嘴结构可实现两种流体的同时挤出，并使挤出的水凝胶通道立即发生交联。该方法能够直接制备多层中空纤维，随后通过更高浓度的氯化钙（CaCl2）从外部进行交联，从而实现更持久的结构稳定。

因此，该方法能够同时打印支架和微通道，其中中空水凝胶丝既可作为支架以维持三维结构的机械完整性，又可同时充当内置微通道，为细胞生长输送营养物质。本方案详细介绍了基于自制同轴喷嘴的核壳式三维生物打印策略，通过调控交联过程形成中空丝状结构，从而构建出带有内置通道的水凝胶三维结构，且该通道在细胞培养过程中保持可灌注性。

本研究所采用的3D打印装置配置如Banović和Vihar先前所述46，可分为三个主要组成部分：A）一个三轴数控机械装置，在X、Y和Z方向上的定位精度为50 μm；B）两个适配一次性5 mL鲁尔锁型注射器的挤出装置，具有1.2 μL的体素分辨率；C）控制电子元件及软件。

为了实现核/壳结构的打印，开发了一种合适的喷嘴，可安装在其中一个挤出机上（主挤出机用于打印核层），并与G27平头针兼容。该喷嘴还具备鲁尔锁扣兼容性，以便与第二挤出机（用于打印壳层）连接。最初的原型是将一根G27平头针（内径 = 210 μm，外径 = 410 μm）插入G21针（内径 = 510 μm，外径 = 820 μm）或G20锥形针头（内径 = 600 μm）中，然后从侧面插入第二根针以供给壳层材料。然而，由于针管存在轻微弯曲，无法制备出内针与外针同心对齐的喷嘴尖端。

为了解决这一问题，设计了一种满足以下条件的新喷嘴：1）可使用三轴数控铣床进行加工；2）可由多种材料制成（如高性能塑料PEEK或金属）；3）具有鲁尔锁（luer-lock）兼容性，可用于施加壳层材料；4）可兼容G27钝头针，并能在两个位置固定该针，使其针尖与中心轴对齐。图1展示了该喷嘴原型的示意图。

方案

1. 水凝胶和交联溶液的制备

  1. 简而言之，通过剧烈搅拌，将海藻酸钠（ALG）和羧甲基纤维素钠（CMC）粉末溶解于超纯水中，得到总浓度为3 wt%的ALG和3 wt%的CMC溶液。
    注意：本研究中使用5 mL注射器进行打印，因此最终材料用量需调整至该体积。然而，对于其他挤出式 cartridge 及打印样品尺寸，应相应地按比例调整所制备材料的用量。
  2. 向ALG-CMC混合物中加入1.5 wt%的纤维素纳米纤维，以增强机械性能并达到适合打印的所需黏度。
  3. 使用顶置式搅拌器搅拌水凝胶悬浮液，直至形成均匀体系。
    注意：水凝胶中不应存在任何纤维团聚或气泡。
  4. 用超纯水配制10 mL浓度为100 mM的氯化钙（CaCl2）溶液，作为打印过程中主要的交联溶液。
  5. 用超纯水配制10 mL浓度为5 wt.%的CaCl2 溶液，用于支架后处理过程中的二次交联。
    注意：通常情况下，所有适用于即时化学交联的水凝胶配方均可实现中空管的一步法制备，并可用于此类核-壳结构的打印系统。打印与交联机制需相应优化。水凝胶的黏度会因目标组成不同而变化；但可通过调节聚合物浓度或添加增稠剂（如纳米纤维）进行调整。理想的3D打印黏度应足够高，以确保挤出后的丝材能够保持形状，并在交联前支撑支架自身重量。

2. 可灌注支架的核/壳打印

  1. 打印前，用70%乙醇彻底喷洒生物打印机进行消毒，并暴露于紫外线下1小时。
  2. 打开生物打印机，运行随3D打印机配套提供的控制软件。
  3. 通过点击回原点图标执行归位操作。
  4. 使用工具栏命令文件 | 导入G代码，导入生成的支架G代码。
  5. 将水凝胶转移至无菌5 mL注射器中，并将其安装到3D打印机的一个挤出装置支架上。通过鲁尔锁接头和一段短管，将其连接至同轴喷嘴的侧向鲁尔接口。
  6. 将交联溶液（100 mM CaCl2）转移至另一支带有G27钝端针头的无菌5 mL注射器中，并插入同轴喷嘴顶部的针头固定座。内针应略微突出（约1 mm）于外层同轴喷嘴。手动调整对齐位置，并将第二支注射器插入挤出装置支架中。
  7. 为正确将注射器插入支架（装置如图2所示），通过点击A和B以及上和下箭头手动控制两个挤出装置支架。
  8. 在开始打印前，分别挤出水凝胶和交联溶液，以清除同轴喷嘴中的所有多余气泡，并确保水凝胶连续流动。
  9. 使用Z和上和下箭头，手动调节喷嘴与打印基底之间的距离。建议使用平整的玻璃打印基底，因其具有良好的粘附性。喷嘴不应与基底接触，以保证水凝胶的顺畅流动。喷嘴与基底之间的最佳距离（层高）通常等于外喷嘴直径的宽度，但需根据所用材料和具体打印参数进行调整。根据实际需求调整起始打印高度。
  10. 按下开始按钮以启动打印过程。
    注意：建议在支架周围打印一圈裙边（图3），以确保在正式打印支架前形成均匀的中空丝状结构。为实现最佳水凝胶流动并打印出理想的支架，需调整配方组成、交联溶液组成以及打印参数（如打印速度、挤出压力、打印温度、基底与挤出喷嘴之间的距离等）。
  11. 打印完成后，小心取下带有打印支架的基底，并将二次交联溶液（5 wt.% CaCl2）倾倒于整个支架上，确保支架整体充分交联。在室温（RT）下孵育1分钟。
    注意：确保整个支架完全浸没在交联溶液中。此步骤对获得支架所需的力学性能至关重要，但具体条件会因所用材料和交联方法的不同而有所变化。
  12. 使用手术刀手动切除多余的裙边材料。
  13. 将支架置于紫外线下消毒30分钟。小心翻转支架并重复消毒过程。
  14. 通过轻轻侧向拉扯，小心地将支架从基底上剥离。若支架与基底粘附较紧，可插入锋利边缘将其分离。
  15. 将支架转移至无色细胞培养基（含5 wt.% FBS、100 U/mL青霉素和1 mg/mL链霉素的DMEM）中，并在37 °C、含5 wt.% CO2的环境中孵育至少24小时。

3. 内皮细胞的准备及活/死细胞染色液的配制

  1. 进行细胞培养时，配制添加酚红的高糖DMEM细胞培养基，并补充5 wt.% 胎牛血清（FBS）和2 mM L-谷氨酰胺。加入100 U/mL青霉素和1 mg/mL链霉素。
  2. 启动人脐静脉内皮细胞（HUVEC）系，并按照文献所述HUVEC培养方案进行传代47。
    注意：建议在细胞培养基中添加酚红，以便在将细胞注入白色半透明支架时便于观察。
  3. 进行细胞计数时，吸取100 μL悬浮于细胞培养基中的细胞，加入900 μL 0.1 wt.% 台盼蓝溶液进行染色。
  4. 使用自动细胞计数仪或手动血细胞计数板对悬浮液中的细胞数量进行计数并估算。
  5. 进行活/死细胞染色实验时，配制含有4 mM 钙黄绿素-AM（Calcein-AM）和2 mM 碘化丙啶（propidium iodide）的无菌PBS溶液。
    注意：活/死细胞染色溶液应在实验前即刻配制。

4. 将细胞接种至支架材料中

  1. 将支架从细胞培养基中取出，并转移至一个足够大的玻璃培养皿中。
  2. 在将细胞注入支架之前，立即使用0.25 wt.%胰蛋白酶处理，使HUVECs从培养瓶中解离。
    1. 简要操作：弃去细胞培养基，加入0.25 wt.%胰蛋白酶（约2 mL），在37 °C下孵育5分钟。
    2. 孵育后，向消化后的细胞中加入约3 mL细胞培养基，并将所有脱落的细胞转移至离心管中。
    3. 在200 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。
    4. 用新鲜的细胞培养基重悬细胞。
  3. 按照前述方法计数细胞，并根据具体实验需求调整总细胞浓度。本研究中采用的起始浓度为340,000 个细胞/mL。
  4. 将细胞重悬于带有钝头G27针头的无菌注射器中。
  5. 寻找合适的进针点，小心地将细胞注入支架中。细胞悬液流经半透明支架时应可见。确保整个支架均被细胞悬液充满。
  6. 将支架完全浸没于细胞培养基中，并在37 °C、含5 wt.% CO2 的气氛中孵育，最长可达10天。
  7. 根据实验需要更换细胞培养基。

5. 活/死细胞检测与细胞成像

  1. 孵育后，用 PBS 冲洗支架。
  2. 使用钝端针头，将先前配制的活/死染色液（含 4 mM 钙黄绿素-AM 和 2 mM 碘化丙啶的 PBS 溶液）小心注入支架中，并将支架置于 PBS 中于 37 °C 孵育 30 分钟。确保染色液流经整个支架的全长。
  3. 用 PBS 冲洗支架。
  4. 小心地将支架转移至载玻片上。
  5. 在荧光显微镜下直接观察支架内染色的细胞。
    注意：活细胞呈现绿色荧光，死细胞发出红色荧光。

结果

本研究旨在开发一种易于制造且具有鲁尔兼容性的核/壳喷嘴，用于木堆结构的核/壳打印。此外，还描述了一种简单直接且可重复的一步打印方案，该方案易于修改，可适配多种材料及不同的化学交联机制，用于构建结构明确且可灌注的支架，以用于血管及其他管状组织结构的工程化构建。

核/壳喷嘴
该喷嘴由一根G27平头针（用于挤出内轴丝材）和喷嘴主体组成，后者用于固定针头，并形成带有材料输入连接口的外部喷嘴，以输送壳层丝材。示意图见图1。两个5 mL注射器分别安装在独立的挤出机中，提供核层和壳层材料。软管将喷嘴主体与注射器连接，用于输送壳层材料。

核心/壳层喷嘴与注射器装置的完整组装如图2所示。喷嘴本体的首个功能原型通过数控铣削聚甲醛（POM）块制成。通过将元件、G27针头和管路安装至Vitaprint中，测试了其兼容性与密封性。在喷嘴、鲁尔锁接头或本体与针头之间的连接处均未观察到壳层材料泄漏。喷嘴本体与针座（鲁尔接头）紧密贴合，确保整个喷嘴与挤出装置同步运动。

支架构建
制备支架最直接的方法是逐层沉积材料，每层连续改变打印方向，通常以90°夹角进行。由于水凝胶具有粘弹性和吸湿性，保持打印结构的形状保真度仍然具有挑战性。本方案部分的主要目的是使用两种聚合物进行可灌注核/壳支架的3D打印，这两种聚合物此前在支架构建中已显示出良好效果（ALG和CMC），并添加纤维素纳米纤维（NFC）以提高机械稳定性。ALG和CMC均为带负电荷的水溶性线性共聚物48，均含有羧基，可通过加入二价阳离子实现交联。Ca2+离子可同时与两个功能基团形成离子键，从而在聚合物链之间建立连接，增加凝胶刚性。

可灌注支架的打印
该步骤的目的是3D打印简单的木堆状支架结构，该结构跨越多层，并在完全交联前保持良好的形状保真度和可灌注性。这要求芯层和壳层均匀共挤出，且不能有交叉或回抽动作，以免中断流体流动。因此，传统的CAD建模和切片方法较不适用。本研究采用手动设计的g代码，并开发了一种基于Python的g代码生成器，以实现快速制备g代码。

支架结构呈木堆状网格形，构建于平坦的玻璃表面。制备过程采用逐层堆积方式，将每一后续层的交叉线以一定角度沉积 90° 与前一层相比，每一后续层在X和Y方向上均缩小2%，以确保由前一层持续提供纤维支撑。通过考虑挤出纤维的外径（0.8 mm）以及网格线之间的距离（3 mm），可在g代码中精确设计纤维之间的间距（大孔尺寸）。

支架必须满足关键的纳入标准，方可进入后续评估。首先，支架在打印过程中需至少达到4层高度，并保持其结构完整性和几何形态（例如大孔尺寸），才有资格进行后续开发。其次，支架在37 °C的细胞培养基中孵育7天后，仍需保持可灌注性（即微通道稳定）。在适当的时间点（1、2、5和7天），将支架从培养基中取出，检测其是否仍具备可灌注性。在图4A中，一个 freshly printed 并经过后处理的支架横截面显示出丝材内部清晰可见的中空通道。在图4B中可以明显看出，即使在37 °C的细胞培养基中孵育72 h后，该丝材在整个支架长度方向上仍保持中空结构。

多种配方均可打印，保持结构稳定，维持打印几何形态，并具备可灌注性；但最终仅选择其中一种进行后续测试（即 3 wt.% ALG + 3 wt.% CMC + 1.5 wt.% NFC），该配方可实现最多10层的可灌注支架打印。使用定制喷嘴的打印过程如图5A所示。较稀的配方可实现核/壳打印；然而，浓度较高的凝胶则无法在喷嘴中实现连续流动。打印过程中，初级交联（核材料）采用100 mM CaCl2，可充分稳定中空丝材的连续形成，同时避免凝胶在喷嘴内固化。打印完成后，将支架浸入5 wt.% CaCl2溶液中，以实现水凝胶的完全交联，确保长期的形状保真性。完成的支架样品如图5B所示。在配方优化过程中，核溶液中添加了人工染料，以便直观评估挤出丝材的质量。最终制备用于细胞接种与培养的支架时未使用该染料。

活/死细胞检测
孵育后，采用活/死细胞检测对内皮细胞进行可视化，以区分孵育支架中存活的（绿色）和死亡的（红色）细胞。该检测主要有两个目的：A）确定支架是否能提供一种生物相容性环境，以促进细胞生长和黏附，且不对细胞产生有害影响；B）更详细地观察管状结构及其内部管腔系统的结构完整性。

活/死细胞检测结果如图6所示。在活细胞内酯酶的作用下，可穿透细胞膜的Calcein-AM被转化为Calcein，发出绿色荧光；而凋亡细胞则通过不能穿透细胞膜的碘化丙啶（propidium iodide）进行观察，当其嵌入DNA双螺旋结构时发出红色荧光。将活/死染色图像与明场图像叠加，有助于观察空心通道内的细胞分布。在支架与细胞共孵育48 h后，将染色液注入3D打印的支架中，直接进行检测。

需要注意的是，本研究中内皮细胞（ECs）的接种密度相对较低（340,000 个细胞/mL），因为本研究仅作为可灌注支架核心/壳层打印的概念验证。活/死细胞染色实验最重要的结论是，即使在 48 小时后，也未观察到死亡细胞（红色），证明支架材料本身及其降解产物均未表现出毒性作用。此外，ECs 确实能够黏附并持续附着在支架内部，并在通道内生长时呈现出均匀分布的聚集体。这表明，所述的制备方法和支架配方为构建体内相关的管状组织形态提供了适宜的框架。除了模拟细胞-细胞外基质（ECM）相互作用以及三维空间中的紧密细胞间通讯外，复杂的组织工程还需要细胞持续暴露于新鲜培养基中以维持其活性。这可以通过在连续灌注条件下建立密集的通道网络来实现，这有待未来进一步研究，并需要优化材料和生长参数，以促进血管组织的长期组织工程构建。

用于微胶囊化核心-壳层喷嘴装置的针头组件示意图，标注了材料流动方向。
图1：核心/壳层喷嘴原型。（A） 显示了喷嘴主体原型的整体设计及主要组件。通过从顶部插入钝端G27针头完成喷嘴组装。顶部和底部针头固定器可固定并重新对齐针头，使其与喷嘴轴线一致，确保针尖从喷嘴中心伸出。为将喷嘴与来自次级注射器挤出的“壳层”材料连接，使用带鲁尔锁接头的管路连接至侧向入口。材料由此经由狭窄通道输送至喷嘴。所述通道的制备需在两个位置进行钻孔，钻孔完成后需对孔口进行封堵。（B） 为插入G27针头后喷嘴的局部放大图，针头从喷嘴中伸出。请点击此处查看该图的放大版本。

用于生化分析的注射器系统流体注射装置示意图。
图 2：最终的核/壳结构装置。（A）图中为已完成的核/壳喷嘴，配有正确连接的注射器，右侧注射器装有形成“壳”层的水凝胶，左侧注射器装有作为“核”层挤出的交联溶液。（B）图中为安装至Vitaprint系统的核/壳装置，配备两个挤出器。请点击此处查看该图的放大版本。

CAD软件中带有轴标签的3D坐标系渲染图；显示的编程列表。
图3： 管状支架的G代码。 此处展示了打印机软件的截图，分别为路径预览（A）和第一层的原始G代码（B）。G代码是一组指令，包含在绝对空间方向（X、Y、Z）上的目标坐标，以及在相对方向上的挤出量（A、B）。G指令决定指令类型，其中G1表示向目标坐标进行线性移动，G92用于设定初始起始位置。此外，后续指令的进给速率由F指令设定，单位为mm/min。 请点击此处查看此图的放大版本。

植物根瘤的显微图像，突出显示在1 mm尺度下的结构差异，用于分析。
图 4：具有中空内部结构的支架丝状物的横截面。（A）显示的是刚打印完成并经过后处理的支架的横截面切片。（B）显示的是支架在细胞培养基中孵育72小时后的横截面切片。虽然喷嘴形状决定了具有圆形横截面的管状挤出结构，但丝材在沉积后略有压扁。然而，内部通道在孵育过程中保持完整并维持其原有形态。请点击此处查看该图的高清版本。

3D 生物打印过程；创建水凝胶结构。逐层制造示意图。
图 5：支架的同轴打印。 此处展示了三层中空管状支架的制备过程（A）及其最终形态（B）。为便于观察，核心中的交联溶液用红色染料染色。该配方具有足够的机械稳定性，即使制造更厚的结构（最多达10层，数据未显示），也能保持支架的稳定。最终结构的外部尺寸约为 27 mm × 27 mm × 3.5 mm。请点击此处查看此图的放大版本。

荧光显微镜图像、神经元定位、样本A与B的比较、2mm比例尺。
图6：在支架中直接进行的活/死细胞检测。将HUVECs悬液注入支架内侧通道，孵育48小时后用活/死染料处理。活的HUVECs发出绿色荧光，表现为图像中的明亮斑点。死细胞也发出绿色荧光；但在观察到的支架中未见明显死细胞。细胞的分布还反映了通道的形状及其保持的灌注能力。在较小程度上，活/死检测溶液也染色了支架材料，导致在显微镜下产生微弱荧光。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

喷嘴设计
使用已开发的同轴喷嘴，并将其集成到双挤出Vitaprint系统中，通过一步法成功制备了中空管状支架。为了使所制备支架的管壁厚度在大部分区域保持均匀，需将针头精确地定位于外层挤出环的轴线中心。标准规格的针头通常存在轻微但显著的偏心现象。因此，喷嘴本体被设计为在两个位置固定针头：一处位于顶部（固定针座），另一处在核心/壳层最终混合腔之前（直接固定针管本身），从而校正其轴向对齐。两个固定点之间的距离越大，轴向对齐的精度越高。然而，针头长度与可用喷嘴腔体积之间存在权衡。为进一步提升装置的功能性，可对喷嘴实施若干改进：A）采用稳定性更优的喷嘴安装结构；B）增加适配不同针头规格的多种喷嘴；C）引入用于精确调节针头与喷嘴相对位置的调节机构；D）集成额外的进样口和微流控装置，以实现材料的在线实时制备。

水凝胶优化
为了确定最佳的 ALG:CMC 比例，评估了多种材料配比方案。通常情况下，当两种组分的浓度均高于 3 wt.% 时，无法实现核壳打印，因为这会导致水凝胶无法连续流动或造成喷嘴堵塞。具体而言，ALG 浓度超过 3 wt.% 会显著增加黏度，从而引起喷嘴堵塞；而 ALG 浓度过低或 CMC 浓度过高（>3 wt.%）则会延缓交联时间，因而无法为支架提供足够的结构支撑。虽然较低黏度的配方可实现核壳打印，但挤出凝胶的黏度必须足以长期维持形状保真度。最终，1:1 的 ALG:CMC 比例被证明是最合适的选择，这一结果也验证了 Maver 等人先前的研究49。添加 NFC 显著改善了核壳打印支架的可打印性和结构刚性，但对材料的交联性能无显著影响。

针对特定细胞类型和实验设置的定制化应用需要高度匹配的支架材料，这些材料在组成和交联机制上各不相同。本研究中描述的方法基于海藻酸-纤维素混合聚合物溶液，通过Ca2+离子进行离子交联。海藻酸本身是一种线性聚合物，由(1,4)连接的β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）残基组成，可通过Ca2+及其他二价阳离子（如Sr2+、Ba2+、Mg2+）实现可逆的离子交联。然而，目前最广泛用于海藻酸交联的离子仍是CaCl2形式的Ca2+。Ca2+也可来源于CaSO4或CaCO3；但CaSO4相对于CaCl2溶解度较低，导致凝胶速度较慢。而CaCO3引发的凝胶速度更慢，可能导致机械性能较弱且不一致。

较长的凝胶时间通常会产生更均匀的结构，但某些应用（如核/壳打印）需要较快的凝胶速率50。Mg2+离子也能诱导凝胶形成，但其交联效率比Ca2+低约5至10倍，交联时间长达2至3小时。此外，镁离子对古洛糖醛酸单元更具选择性，因此交联过程更依赖于海藻酸钠（ALG）的化学组成51。在此情况下，快速的凝胶速率对于在中空结构塌陷前确保连续中空通道的形成至关重要。CaCl2可实现最快的凝胶速率，这对于中空丝材的直接沉积尤为关键。实验中采用了100 mM的CaCl2，可在不引起喷嘴内凝胶固化的前提下，充分稳定中空丝材的连续形成。

支架的打印与后处理
在该步骤中应考虑以下事项：1）确保所有溶液和材料（包括3D生物打印机）在打印前均已正确灭菌。2）配制水凝胶时，材料的均一性对连续打印至关重要，应避免引入杂质或气泡，因其可能堵塞喷嘴和/或干扰挤出过程。3）注射器应通过鲁尔锁紧装置正确连接至同轴喷嘴，并准确插入挤出装置的安装位，如图2A、B所示。4）在打印复杂结构前，建议预先挤出少量凝胶和交联溶液，以清除同轴喷嘴中残留的气泡，并确保水凝胶流动的连续性。此步骤可直接整合至g代码中，以提高重复性。5）在支架周围添加裙边有助于在正式开始打印支架前，确保均匀中空丝材的稳定沉积。

此外，6）为了改善打印丝材与基底之间的粘附性，建议使用具有优良粘附性能的平整表面（例如载玻片或培养皿）。7）挤出喷嘴不应与基底直接接触，以确保水凝胶能够持续顺畅地流出。初始距离会显著影响打印质量，但挤出丝材的厚度可作为初始设置的良好参考值。8）g代码中的起始打印高度应根据具体需求进行调整。在打印参数优化完成后，应将支架的g代码导入Planet CNC软件，并按照实验方案所述启动打印过程。9）为了控制并优化水凝胶的流动，以实现最佳支架的打印，应调整配方组成和打印参数（例如打印速度、挤出压力、打印温度、基底与挤出喷嘴之间的距离、层高、支架尺寸等）。

通常，打印黏度较高的材料需要更高的流速。如前所述，所有适用于立即进行化学交联的水凝胶配方均可用于一步法制备中空管，并可与所述的同轴（core/shell）打印装置配合使用。打印与交联过程需相应优化。打印完成后，所有支架均需经过后续处理：使用5 wt.%的CaCl2溶液进行二次交联，以确保ALG-CMC组分完全交联，并在紫外光下双侧灭菌至少30分钟。应确保交联溶液完全浸没支架，并孵育足够时间以完成交联过程。后续处理步骤将根据所用材料及交联机制的不同而有所差异，应在实验前予以充分考虑。后处理完成后，应小心地将支架从基底上取下，转移至细胞培养基中，并在受控环境下孵育至少24小时，然后再进行细胞接种。使用无色培养基有助于在将细胞悬液注入支架时提高观察清晰度。

活/死细胞检测
活/死细胞检测溶液应在检测前现配，并在检测前避光保存，因为其中含有易发生荧光淬灭的荧光染料。达到预定的孵育时间后，应小心弃去支架周围的细胞培养基，并用 PBS 缓冲液冲洗。理想情况下，应使用与细胞接种时相同的入口将活/死细胞检测溶液注入支架中。

结果的重要性
ALG 和 CMC 均已被用于在体外促进血管生成。基于其模拟细胞外基质（ECM）的特性、物理交联能力以及良好的生物相容性，ALG 常被用作递送和控释促血管生成生长因子的载体成分（例如 bFGF、HGF、VEGF164 和 Ang-1* 分别）52,53,54。此外，CMC 与明胶联用时，因其在生理条件下可快速交联，已被用于包载血管内皮细胞55。添加 NFC 是为了进一步提高支架的机械稳定性和形状保真度。需要强调的是，本研究的目的并非增强血管化，而是证明能够制造出可灌注的中空 ALG-CMC 支架，该支架以核壳结构打印，同时有利于人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的黏附与增殖。选择 ALG-CMC 混合材料是基于对常用、易得且具有良好生物相容性的基础材料的研究结果，这些材料能够实现中空通道的核壳打印。尽管其他许多材料可能更适用于促进血管生成，但其中一些并不适用于核壳打印，因其无法实现快速凝胶化或交联，而这一点在本方法中至关重要。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨此感谢斯洛文尼亚研究署（资助编号：P3-0036 和 I0-0029）以及科学、教育与体育部（资助编号：5442-1/2018/59）为本项目提供的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
海藻酸钠Sigma-Aldrich（德国）180947粉末；Mw ~80,000
ATTC HUV-EC-C [HUVEC]LGC 标准（英国）ATCC-CRL-1730内皮细胞生长补充剂（ECGS）以及来自牛垂体、下丘脑或全脑提取物的未明因子对该细胞系具有促有丝分裂作用；该细胞系的预期寿命为50至60次群体倍增。
Axiovert 40 倒置光学显微镜卡尔蔡司显微镜有限公司（德国）同一目标下的三种对比技术 – 例如明场、相差和微分干涉差（PlasDIC）
氯化钙Sigma-Aldrich（德国）C1016无水；颗粒状； ≤7.0 mm； ≥93.0%
纤维素纳米原纤悬浮液（NFC，3% (w/v)）美国缅因大学工艺开发中心（缅因，美国）标称纤维宽度为50 nm；长度可达数百微米
ELGA Purelab 水纯化系统Veolia Water Technologies (UK)
EVOS FL 细胞成像系统ThermoFisher Scientific Inc. (德国)AMF4300一种完全集成的数字化倒置成像系统，适用于四色荧光及透射光应用
Gibco Advanced Dulbecco’s 改良伊格尔’s 培养基（Advance DMEM）赛默飞世尔科技公司（德国）12491015高葡萄糖；无谷氨酰胺；酚红
Gibco Dulbecco’改良型伊格尔培养基’s 小培养基（DMEM）ThermoFisher Scientific Inc. (德国)21063029高葡萄糖；L-谷氨酰胺；HEPES；无酚红
Gibco 胎牛血清（FBS），经鉴定合格ThermoFisher Scientific Inc.（德国）10270106FBS 来源：巴西；5 %（w/v）FBS
Hypodermic Sterican 针头B. Braun Melsungen AG（德国）91801170.40 × 25 mm，27G × 1''
L-谷氨酰胺Sigma-Aldrich（德国）G3126ReagentPlus®, ≥99%（HPLC）
活细胞/死细胞双染试剂盒Sigma-Aldrich（德国）4511含有钙黄绿素-AM 和碘化丙啶（PI）溶液；适用于荧光检测
Nunc EasYFlask 细胞培养瓶赛默飞世尔科技公司（德国）156367Nunclon Delta 经认证适用于单层形成、克隆效率高，无细胞毒性、无致热原性且无菌；带滤膜瓶盖；培养面积为 25 cm²2
Omnifix 注射器B. Braun Melsungen AG（德国）4617053V5 mL 鲁尔锁
青霉素G钠盐Sigma-Aldrich（德国）P3032粉末；生物试剂；适用于细胞培养
磷酸盐缓冲液Sigma-Aldrich（德国）P4417片剂；一片溶解于 200 mL 去离子水中，得到 0.01 M 磷酸盐缓冲液、0.0027 M 氯化钾和 0.137 M 氯化钠，pH 7.4（25 ℃） °C
羧甲基纤维素钠Sigma-Aldrich（德国）419338粉末；平均分子量 ~700,000
硫酸链霉素盐Sigma-Aldrich（德国）S9137粉末；生物试剂；适用于细胞培养
超纯水Veolia Water Technologies (UK)18.2 mΩ·cm（25°C时）
VitaPrint 3D 生物打印机IRNAS（斯洛文尼亚）

参考文献

  1. Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
  2. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering complex tissues. Science Translational Medicine. 4 (160), (2012).
  3. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in tissue engineering. Scientific American. 300 (5), 64-71 (2009).
  4. Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
  5. Park, K. M., Shin, Y. M., Kim, K., Shin, H. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2017: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (5), 327-344 (2018).
  6. Mattei, G., Giusti, S., Ahluwalia, A. Design criteria for generating physiologically relevant in vitro models in bioreactors. Processes. 2 (3), 548-569 (2014).
  7. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three‐dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
  8. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  9. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  10. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  11. Di Nardo, P., Minieri, M., Ahluwalia, A. Stem Cell Engineering. , Springer. 41-59 (2011).
  12. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. Journal of the Royal Society Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  13. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled growth factor delivery for tissue engineering. Advanced Materials. 21 (3233), 3269-3285 (2009).
  14. Caddeo, S., Boffito, M., Sartori, S. Tissue Engineering Approaches in the Design of Healthy and Pathological In Vitro Tissue Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 40(2017).
  15. Chang, H. -I., Wang, Y. Regenerative medicine and tissue engineering-cells and biomaterials. , InTech. (2011).
  16. Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced Healthcare Materials. 2 (1), 57-71 (2013).
  17. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocols. 11 (10), 1775-1781 (2016).
  18. Yu, Y., Alkhawaji, A., Ding, Y., Mei, J. Decellularized scaffolds in regenerative medicine. Oncotarget. 7 (36), 58671-58683 (2016).
  19. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  20. Lovett, M., Lee, K., Edwards, A., Kaplan, D. L. Vascularization strategies for tissue engineering. Tissue Engineering Part B: Reviews. 15 (3), 353-370 (2009).
  21. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  22. Bae, H., et al. Building vascular networks. Sci Transl Med. 4 (160), (2012).
  23. Štumberger, G., Vihar, B. Freeform Perfusable Microfluidics Embedded in Hydrogel Matrices. Materials. 11 (12), 2529(2018).
  24. Ibrahim, M., Richardson, M. K. Beyond organoids: In vitro vasculogenesis and angiogenesis using cells from mammals and zebrafish. Reproductive Toxicology. 73, 292-311 (2017).
  25. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of adult mesenchymal stem cells on in vitro vascular formation. Tissue Engineering Part A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining neovascularization of a scaffold through staged release of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-BB. Tissue Engineering Part A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Li, X., He, J., Zhang, W., Jiang, N., Li, D. Additive manufacturing of biomedical constructs with biomimetic structural organizations. Materials. 9 (11), 909(2016).
  28. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773(2014).
  29. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  30. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Advanced Materials. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  31. Huang, Y., Zhang, X. F., Gao, G., Yonezawa, T., Cui, X. 3D bioprinting and the current applications in tissue engineering. Biotechnology Journal. , (2017).
  32. Wang, X., et al. 3D bioprinting technologies for hard tissue and organ engineering. Materials. 9 (10), 802(2016).
  33. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758(2015).
  34. Rocca, M., Fragasso, A., Liu, W., Heinrich, M. A., Zhang, Y. S. Embedded Multimaterial Extrusion Bioprinting. SLAS Technology. 23 (2), 154-163 (2018).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758(2015).
  36. Huang, S., Yang, Y., Yang, Q., Zhao, Q., Ye, X. Engineered circulatory scaffolds for building cardiac tissue. Journal of Thoracic Disease. 10 (Suppl 20), S2312-S2328 (2018).
  37. Hoch, E., Tovar, G. E., Borchers, K. Bioprinting of artificial blood vessels: current approaches towards a demanding goal. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 46 (5), 767-778 (2014).
  38. Yeo, M., Lee, J. S., Chun, W., Kim, G. H. An Innovative Collagen-Based Cell-Printing Method for Obtaining Human Adipose Stem Cell-Laden Structures Consisting of Core-Sheath Structures for Tissue Engineering. Biomacromolecules. 17 (4), 1365-1375 (2016).
  39. Liu, W., et al. Coaxial extrusion bioprinting of 3D microfibrous constructs with cell-favorable gelatin methacryloyl microenvironments. Biofabrication. 10 (2), 024102(2018).
  40. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3D bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  41. Akkineni, A. R., Ahlfeld, T., Lode, A., Gelinsky, M. A versatile method for combining different biopolymers in a core/shell fashion by 3D plotting to achieve mechanically robust constructs. Biofabrication. 8 (4), 045001(2016).
  42. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Advanced Materials. 28 (4), 677-684 (2016).
  43. Kim, G., Ahn, S., Kim, Y., Cho, Y., Chun, W. Coaxial structured collagen–alginate scaffolds: fabrication, physical properties, and biomedical application for skin tissue regeneration. Journal of Materials Chemistry. 21 (17), 6165-6172 (2011).
  44. Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
  45. Mistry, P., et al. Bioprinting Using Mechanically Robust Core-Shell Cell-Laden Hydrogel Strands. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  46. Banović, L., Vihar, B. Development of an extruder for open source 3D bioprinting. Journal of Open Hardware. 2 (1), (2018).
  47. HUV-EC-C [HUVEC] (ATCC® CRL-1730™) Homo sapiens umbilical vein. , Available from: http://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1730.aspx?geo_country=si#documentation (2019).
  48. Habib, A., Sathish, V., Mallik, S., Khoda, B. 3D printability of alginate-carboxymethyl cellulose hydrogel. Materials. 11 (3), 454(2018).
  49. Maver, T., et al. Combining 3D printing and electrospinning for preparation of pain-relieving wound-dressing materials. Journal of Sol-Gel Science and Technology. , 1-16 (2018).
  50. Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: Part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
  51. Topuz, F., Henke, A., Richtering, W., Groll, J. Magnesium ions and alginate do form hydrogels: a rheological study. Soft Matter. 8 (18), 4877-4881 (2012).
  52. Perets, A., et al. Enhancing the vascularization of three-dimensional porous alginate scaffolds by incorporating controlled release basic fibroblast growth factor microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 65 (4), 489-497 (2003).
  53. Ruvinov, E., Leor, J., Cohen, S. The effects of controlled HGF delivery from an affinity-binding alginate biomaterial on angiogenesis and blood perfusion in a hindlimb ischemia model. Biomaterials. 31 (16), 4573-4582 (2010).
  54. Peirce, S. M., Price, R. J., Skalak, T. C. Spatial and temporal control of angiogenesis and arterialization using focal applications of VEGF164 and Ang-1. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H918-H925 (2004).
  55. Kageyama, T., et al. In situ cross-linkable gelatin-CMC hydrogels designed for rapid engineering of perfusable vasculatures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (6), 1059-1066 (2016).

重印与许可

标签

3D
用于管状结构组织工程的核/壳打印支架
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。