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慢性植入多通道柔性聚合物电极阵列

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DOI：

10.3791/59957

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2019年10月4日

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1Medical Scientist Training Program and Neuroscience Graduate Program, University of California San Francisco, 2Kavli Institute for Fundamental Neuroscience, Center for Integrative Neuroscience, and Department of Physiology, University of California San Francisco, 3Bioengineering Graduate Program, University of California San Francisco, 4Center for Micro- and Nanotechnology, Lawrence Livermore National Laboratory, 5Neuralink Corp., 6Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

以下介绍一种在自由活动的大鼠中，将多个聚合物电极阵列植入解剖位置相距较远的脑区以进行长期电生理记录的方法。文中详细描述了电极的制备与手术植入过程，并重点阐述了设计原则，以指导将该方法适应性地应用于其他物种。

摘要

对分布在大脑多个区域的大规模单个神经元进行持续数月乃至数年的同步记录，将为科学和临床发展开辟新的途径。柔性聚合物电极阵列可用于实现长期记录，但赋予其长期稳定性的相同力学特性也使得多次植入以及与慢性植入装置的整合变得困难。本文介绍了一种方法，可将多个聚合物电极阵列精准植入相对空间位置不受限的一组脑区。

该方法利用薄膜聚合物器件，因其具有生物相容性以及实现长期稳定性能的能力而被选用 电生理记录接口。该植入装置可实现对解剖位置相距较远区域的精确且灵活的靶向定位，具备长达数月的物理稳定性，并对电噪声具有较强的抗干扰能力。该方法支持在八个不同的解剖靶点上依次植入最多十六个装置。如先前研究所证实，该方法能够实现1024通道的记录。在本演示中，其中用于单神经元记录的512个通道，在六个记录位点共获得了375个单细胞单位。重要的是，该方法还可实现至少160天的单细胞单位稳定记录。

这种植入策略包括使用可伸缩的硅胶插入推杆暂时支撑每个装置，将装置在其目标深度处固定到粘附于颅骨的塑料基座上，该基座针对每组记录目标进行个性化设计，并将装置置于充满硅胶的定制塑料外壳内以实现稳定和保护。本文还涵盖了植入前装置的准备，以及在适应不同脑区组合或阵列设计时应遵循的设计原则。

引言

理想的神经植入物应能够在数周至数月的时间内，从分布于多个脑区的大量单个神经元中记录信号。柔性聚合物电极阵列能够进行长期的电生理记录，持续时间可达数月，并具有稳定追踪单个神经元的能力1,2,3。然而，这些聚合物材料所具备的机械特性虽然有助于减少剪切损伤4，并赋予其良好的生物相容性和记录能力2,3,5,6,7,8，却也使其相较于刚性电极更难植入脑组织。以往的研究最多实现了四组32通道的阵列植入，但并未报告成功分离出的单神经元总数2,3,9。相比之下，基于硅的电极阵列已被用于高密度、多脑区的植入，但这些技术要么无法在数月时间尺度上持续记录神经元的动作电位（缺乏长期记录能力），要么无法稳定追踪同一群神经元（缺乏稳定性），或缺乏足够的通道密度以同时记录多个脑区中的数百个单神经元。本文所介绍的方法克服了当前聚合物电极阵列技术在植入数量上的限制，从而实现了在多个解剖位置相距较远的脑区中，长期（数月）稳定地记录大量单个神经元电活动的能力，能够在多天甚至更长时间内持续追踪相同的单个神经元。

关于使用聚合物基底而非微丝或硅基策略的重要性，目前仍存在一些争议。Dhawale 等人的研究10表明，微丝确实能够在啮齿类动物中实现持续数月的稳定记录，但其植入装置仅限于在单一脑区植入16个四极电极。微丝植入装置在规模扩展方面具有相对较高的上限，在非人灵长类动物中已实现多达1792个植入通道11。然而，微丝阵列的制备无法与硅基纳米加工工艺兼容，因此极为耗时，在制造过程中需要对每个通道进行单独的手动操作12,13,14。因此，尚不清楚该技术是否能够支持记录通道数量在一个数量级上的增长。

目前的硅基器件可在单个单片装置上放置数百个甚至超过一千个电极15,16,17,18,19。最新的硅制造工艺可生产出横截面积更小的器件，无论材料如何，均能减少胶质细胞激活20,21,22,23,24，并提高器件的柔顺性。关于硅探针单个神经元信号记录寿命的报道存在差异，部分研究表明相对较大的硅探针可实现长期记录25,26。值得注意的是，最新上市的商用硅器件17已具备持续数月的记录能力，其横截面积与本文所述方法中使用的探针柄部非常相似（Jun 等，201717：70 µm × 20 µm；本文及 Chung 等，20191中描述的器件：68 µm – 80 µm × 14 µm）。但由于稳定性差异，该探针尚未被证实可在数周内持续记录同一神经元的活动。这可能归因于使用了刚性硅材料以及直接固定于颅骨，已知这些因素会导致微小运动、不稳定以及在阵列-脑组织界面处引发胶质增生27,28。为了构建能够随神经组织移动的器件，需要使用柔软5,29且柔韧7的材料。许多现有的聚合物（参见 Geddes 和 Roeder30、Fattahi 等31以及 Weltman 等32的综述）具备与微丝相当的柔韧性和稳定性，同时兼容纳米制造工艺，从而实现硅器件的高密度集成。

柔性聚合物电极阵列的神经植入存在若干特有问题。首要问题便是阵列的插入，因为柔性阵列缺乏足够的刚性，无法像基于硅材料或微丝的策略那样直接推进至脑组织内。目前大多数柔性器件的插入策略依赖于基底的临时增强刚性，本方法即采用此种方式（详见Weltman等人的综述32）。目前有五种显著的无需刚性导引针（rigid shuttle）的策略。第一种是使用在植入后由刚性转变为柔顺状态的材料33,34。该策略的缺点在于，根据欧拉屈曲力计算公式35，为在发生屈曲前提供穿透脑组织所需的足够力学强度，必须具有相对较大的横截面积。而横截面积的增加将对周围组织的健康产生负面影响20,21,22,23,24。第二种策略是在脑组织上方使用可移除的支撑结构36，但该方法需要耗时地移除或溶解支架，以维持尽可能短的无支撑长度（从而获得较高的屈曲力）；否则就必须以更长的无支撑长度插入阵列，从而要求阵列基底更硬或具有更大的横截面积。第三种是预先穿刺以打开通道，随后将柔性阵列插入其中35。该方法需要精确的重新对准，或采用相对较大的预穿刺直径，并要求电极阵列本身具备足够的刚性和横截面积，以实现无支撑插入。第四种是使用可溶解涂层来增强柔性器件的刚性。即使采取特殊措施以保持器件尖端的锐利性，该方法仍会显著增加插入时的横截面积及急性损伤37。第五种是将聚合物阵列直接注射植入。该策略已成功实现最多四次32通道的植入2，但插入时需使用更大横截面积的装置——外径为250 µm – 1.5 mm的玻璃毛细管9，从而导致更严重的急性损伤。相比之下，使用可移除导引针虽然在急性插入阶段增加了横截面积，但允许采用尽可能刚性的材料，因此在插入任意柔性器件时，理论上可实现最小尺寸的植入。因此，目前使用刚性导引针仍是插入柔性器件最具吸引力的选择。

任何插入式载体方法都有两个要求：合适的刚性基底，以及将柔性器件与基底耦合的方式。插入式载体材料通常为硅38,39,40,41、不锈钢8,42或钨43,44,45，其中刚性越高的材料可实现更小的横截面积。这些材料通常使用聚乙二醇（PEG）8,38,39,42,43等粘合剂、静电作用力40或直接物理耦合45,46进行固定。在所有情况下，挑战均在于插入前电极阵列与插入式载体的对准和耦合，以及插入后两者的分离。以下叙述的是Felix等人39所提出方法的一种改进：使用聚乙二醇（PEG）将硅制插入式载体与电极阵列连接，以在插入过程中暂时支撑阵列，并在阵列到达目标深度后移除该载体。

柔性器件在慢性植入过程中面临的第二个挑战是在允许器件与固定于颅骨的植入体整合的同时，实现其在脑内的稳定。由于自然搏动、创伤后水肿改变、冲击及其他因素，脑组织相对于颅骨会发生移动，因此电极阵列必须能够在一定程度上相对于其固定于颅骨及记录设备的位置自由移动。这一目标通过一个3D打印的塑料基座部件实现，该部件针对每组植入靶点进行个性化设计，具备多种功能：在植入过程中作为盐水储液池、用于固定聚合物阵列的锚定点，以及硅胶的容纳腔。位于颅骨上方的锚定位置与硅胶共同作用，使阵列形成更大的弯曲半径，从而允许阵列承受更大的压缩力。这进而使得脑组织相对于阵列锚定点（颅骨）的移动能够转化为阵列的屈曲载荷。

其他挑战包括需要容纳多个阵列，并为动物提供充分的应变缓解，使其能够自由活动，而不会将振动或冲击力传递至电极阵列，否则可能导致阵列相对于神经组织发生移动。针对类似应用中脑组织需相对于刚性记录窗口保持稳定的解决方案已对此挑战进行了改进。一种人工硬脑膜封闭用硅胶（材料表），此前已被证明无毒且可防止脑脊液泄漏47，可对脑组织提供反向压力，防止脑组织向外膨出，并稳定电极阵列在脑表面的位置。此外，在装置带状部分外还增加了一层中等黏度的外科级硅橡胶，该材料此前已证实可用于密封慢性神经电极植入物48。最后，采用硅胶缓冲的植入体与前置放大器组件被封装在定制设计的3D打印部件中，以保持较低的重心，最大程度减少对动物正常活动能力的影响。

本方案从安装在硅质插入载体上的柔性聚合物微电极阵列开始，接着将阵列-载体装置固定到3D打印的插入部件上，详细描述了成功植入动物所需的手术技术及植入构造步骤，可支持在单只大鼠体内八个解剖位置相距较远的区域植入十六个聚合物多电极阵列1。

本方案假设起始材料为通过生物可降解粘合剂聚乙二醇（PEG）固定在硅质插入载体上的聚合物电极阵列，如 Felix 等人39所述，并至少配备两个可独立移动的插入部件：一个用于粘接硅质载体，另一个用于固定电极阵列的连接器。本方案还使用第三个插入部件，以更牢固地将上述两个插入部件连接至微米级的微操作器。所有用于3D打印的文件均可在以下网址获取：https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3DParts

本方法中使用的每个聚合物电极阵列均由两到四个记录探针、用于传导电信号的带状连接线以及位于带状线末端的硬件连接器或印刷电路板组成。电极阵列和带状线通过聚乙二醇（PEG）固定在硅基插入护套的顶部。每条带状线上均通过紫外固化环氧树脂连接有一个长2 cm、厚1 mm的聚酰亚胺管，该管垂直于带状线的长度方向延伸。 每个装置（电极阵列和插入护套）必须装载到3D打印的插入部件上，以便将阵列插入脑组织并回撤护套（图1）。在此设计中，液压驱动的插入显微操作器（绿色，材料表）将整个插入装置（部件1、部件2及回撤用显微操作器，橙色）推进至目标深度。当电极阵列从插入装置上脱离并固定后，第二个回撤显微操作器（橙色）将独立于插入装置其余部分，回撤部件1及其连接的护套，从而在不移动电极阵列的情况下移除护套。

包含定制组件和光谱测量装置的光学实验装置示意图。
图1：插入器组件。
（A）组件1和组件2通过可拆卸螺钉临时固定在一起，之后将与回缩式显微操作仪的活塞（橙色）对接。（B）电极阵列和插入滑道粘附在组件1上，阵列连接器则使用双面胶带固定在组件2上。组件3将回缩式显微操作仪与组件1和组件2连接至插入式显微操作仪（绿色）。插入式显微操作仪固定在立体定位适配器上，用于植入定位。图中展示了组件1至组件3的相对尺寸。组件4为稳定部件，用于确保插入滑道的正确对齐。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

本手稿中所述所有涉及动物的实验方案均已获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 插入前聚合物电极阵列的制备（约30分钟）

  1. 通过将螺钉插入对齐的垂直方向孔中，将部件1与部件2连接，以锁定两部件（图2）。将这两个部件固定在台钳上。在部件2的顶部贴上双面胶带（材料表）。将稳定部件4连接到部件1的末端，其将通过摩擦力固定到位。

光谱比色皿支架组件示意图，步骤A和B，用于吸光度测量的光学装置。
图2：阵列-穿梭对准组件。
(A) 组件1、组件2及稳定件的组装，用于准备插入穿梭装置的连接。(B)) 使用拇指螺钉将组件1和组件2固定在一起。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 手动对齐电极阵列，并将插入推车与部件1的窄端部分连接。当探针与部件1的纵轴对齐后，将阵列连接器粘附到部件2平坦区域上的聚酰亚胺双面胶带上。
  2. 使用塑料尖镊子，仅接触连接在阵列带状部分上的聚酰亚胺翼，将插入推车-电极阵列装置的尖端从部件1抬起，移至稳定部件的外部（图3A）。
  3. 在部件1的末端涂抹少量氰基丙烯酸酯（材料表）或其他粘合剂（约10 µL）。粘合剂过少会导致插入推车与部件1粘附不牢，在插入或回撤过程中可能发生脱落；过多则可能导致胶水溢出推车，使阵列本身粘附到部件1上。
  4. 使用塑料尖镊子，仅接触连接在阵列带状部分上的聚酰亚胺翼，重新将装置与部件1的窄段对齐，使插入推车的方形标签（仅限推车部分）准确置于胶水之上（图3B）。通过调整硅胶推车侧面或PEG部分进行微调对齐。避免对带状部分或探针臂施加过大压力。

用于神经研究的带有稳定部件、聚酰亚胺翼和插销的微电极组件示意图。
图3：阵列-推进器的对齐、固定与灭菌。
（A）将胶水涂在1号部件对接站时，插入推进器-电极阵列装置的正确朝向。图示为双束阵列-推进器。（B）已安装在插入部件上的聚合物电极阵列与插入推进器，并配有用于对齐的临时稳定部件。图示为双束阵列-推进器。（C）插入装置封装于塑料盒中，以便在灭菌过程中提供保护。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 用镊子在固定部件的两侧施加轻柔的向下压力，并在不移动阵列的情况下将其从组件中移除。
  2. 将已安装的装置组件（部件1和2、阵列、插入导引器及阵列连接器）从台钳中取出，并用双面胶带粘附到小型塑料盒底部，以便进行环氧乙烷灭菌（图3C）。这些装置不适用于蒸汽灭菌。

2. 基础部件的设计

  1. 根据选定的立体定位目标确定颅骨切除的尺寸，以及颅骨螺钉和接地螺钉的位置。颅骨切除范围由阵列底座的轮廓决定，周围预留数百微米（约300 µm）的余量，以便调整位置，避免损伤脑表面血管。
  2. 使用设计软件（例如CAD）设计基座部件的轮廓，使其包围计划的颅骨切除区域，并适配于颞嵴和颅骨螺钉所定义的边界范围，最大化基座外部的颅骨表面积，以利于粘接固位水泥将植入物牢固粘附于颅骨。
  3. 对基座部件的底面进行轮廓修整，使其能够无缝贴合颅骨表面，减少感染风险，并防止生理盐水或硅胶弹性体渗漏。
  4. 将基座部件的高度设置为3–7 mm，足够容纳生理盐水和硅胶弹性体，同时又足够低，以免在插入阵列时遮挡视野。
    注意：基座部件可设计带有垂直支柱或其他类似结构，用于将聚酰亚胺翼片固定在高于颅骨的某一位置。但固定点不得遮挡操作视野。
  5. 3D打印基座部件（图4），并在植入前对基座部件进行灭菌处理。

使用固定装置进行骨愈合实验，5mm刻度，手术部位，研究方法。
图4：准备植入物的颅骨。
硬脑膜切除已完成，颅骨螺钉、基底丙烯酸层以及基底部件已固定于颅骨上。

3. 颅骨制备（约2小时）

  1. 选择体重400 g或以上的实验大鼠，以承受植入物的重量。本实验使用6-12月龄的雄性Long-Evans大鼠。
  2. 对大鼠进行麻醉。将动物放入麻醉诱导舱中，开启5%异氟烷。
  3. 腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）、赛拉嗪（6 mg/kg）和阿托品（0.14 mg/kg）。
    1. 在整个手术过程中，每20分钟监测一次麻醉深度，通过检查是否无足部夹捏回缩反应以及呼吸频率是否维持在50-75次/分钟来确认。
  4. 为大鼠涂抹眼膏。
  5. 剃除大鼠头部的毛发。
  6. 将动物固定于立体定位仪中。
  7. 使用聚维酮碘外科洗手液和无菌生理盐水交替擦洗手术区域三次，以准备手术部位。
  8. 在头皮下注射0.2 cc的0.5%利多卡因。
  9. 在颅骨中线处做矢状切口，暴露前囟前至少3 mm及后囟后3 mm的区域。
  10. 使用棉签去除骨膜。
  11. 使用立体定位仪，以前囟为笛卡尔坐标系原点，在颅骨上划痕标记插入点和开颅位置。
  12. 钻开颅骨区域，保留一层薄骨，可用镊子去除。切勿暴露硬脑膜。此操作可在不破坏硬脑膜的前提下清除骨屑。
  13. 逐一钻孔并植入骨螺钉，以防止骨屑进入孔中。使用大量等渗液冲洗以清除骨屑。对于约50克重的植入物，使用10-12枚螺钉。钛合金螺钉可实现骨整合49。
    1. 将螺钉旋入至完全穿透颅骨但不接触脑组织的深度。
  14. 将至少一枚骨螺钉连接至导电导线，作为电路接地端。
  15. 完成所有钻孔后，用生理盐水冲洗清除颅骨上的骨屑。
  16. 用棉签或其他吸水材料将颅骨干燥，并在螺钉周围涂布一层初始粘接固位水泥（材料表）（切勿在啮齿类动物颅骨上使用牙釉质酸蚀剂）。该初步粘接层可增强植入物的粘附力，并减少后续粘接步骤的工作量。
  17. 去除各开颅部位残留的薄层骨质。
  18. 使用带弯头的30号针头切开硬脑膜，避免损伤任何血管。切口长度应与插入导引器的尺寸相匹配。
    1. 若出现出血，手动以温和的生理盐水滴注冲洗，直至出血停止前不得继续操作。
  19. 若进行多个硬脑膜切开术，应使用明胶海绵或其他方法（如每隔几分钟用体温生理盐水定期冲洗）保持各部位湿润。
  20. 再次用棉签或其他吸水材料将颅骨干燥，为基座与颅骨之间的固位水泥粘接做准备。
  21. 放置无菌基座。若基座将覆盖前囟，应在已知距离外标记另一位置作为替代参考点。
  22. 在基座周围边缘涂抹粘接固位水泥。将生理盐水注入已粘接的基座内，检查并用粘接固位水泥封堵基座与颅骨界面处的任何渗漏（图5）。
    注意：必须确保基座完全牢固地固定于颅骨，以防止人工硬脑膜密封硅胶渗漏，否则将影响植入物与颅骨的充分粘附。此时动物已准备好进行阵列插入。

4. 阵列的连续插入与推杆的回撤（每个阵列约需1小时）

注意：此操作应先使用不可行设备进行预试验，特别是在多阵列植入时，其中一个设备可能会干扰后续设备的植入。

  1. 将部件1和部件2装载到回缩显微操作仪的活塞上。将部件1的显微操作仪设置为伸出位置，将部件3的显微操作仪设置为回缩位置。活塞将滑入部件1内部的终端深度。部件2适配于部件3的上部区域，且孔位对齐。
    1. 将部件3装载到插入显微操作仪的活塞上，并用位于部件3底面的螺丝固定（图5A,B）。
    2. 将部件2和部件3装载并拧紧在一起，使得移动插入显微操作仪时可带动整个插入装置（图5C）。
    3. 拆除连接部件1和部件2的螺丝。部件1将独立于部件2移动，以便从装置中单独回撤插入推车。
    4. 将此螺丝插入部件1的侧孔中，方向垂直于活塞轨道，直至螺丝对活塞施加压力。这可确保部件1随回缩活塞同步移动，如图5D所示。当装置安装在立体定位仪上时，应选择不会妨碍视野的侧孔。

用于生物研究应用的显微操作仪装置，可实现精确插入与回撤。
图5：插入器的组装。
(A将部件3安装到显微操作器上. (B) 将部件1和部件2安装到插入装置上。C) 带有安装电极阵列的插入件—插入推进装置。D) 固定部件1和部件2的拇指螺丝已移除。 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 清除颅骨开窗处的所有明胶海绵。使用真实的或替代的前囟点进行立体定位瞄准。移动装置至植入位点时，应保持装置高于颅骨数厘米的高度。
    1. 避免阵列-推进装置在颅骨或脑组织附近停留过长时间，以降低冷凝水在植入前或植入过程中使阵列从推进装置上脱落的风险。若发生此类情况，应立即将阵列-推进装置抬高至颅骨上方足够高度，等待其干燥并重新粘附。
  2. 调整植入坐标，避开表面血管。在进行颅骨开窗和硬脑膜切开时，同样应避免直接穿透血管。
  3. 迅速插入装置（约 25 µm/s），使用立体定位仪将装置下放，直至其进入脑组织。装置不会立即穿透脑组织。所遇阻力及脑表面凹陷程度取决于靶向位置和装置设计（例如两臂或四臂结构、尖端角度），但通常凹陷不超过 1 mm（图 6）。

神经接口植入，特写示意图，电极阵列插入脑组织。
图 6：阵列-推进装置插入。
将阵列-推进装置推进至脑内目标深度。图示为四叉阵列-推进装置。

  1. 进入脑组织后，使用显微操作器缓慢下降，在接近目标深度时逐步降低下降速度：
    1. 使用立体定位臂以 25 µm/s 的速度开始插入。
    2. 当距离目标深度还有 2 mm 至 1 mm 时，改用显微操作器以 10 µm/s 的速度插入。
    3. 当距离目标深度还有 1 mm 至 500 µm 时，进一步减缓插入速度至 5 µm/s。
    4. 在最后 500 µm 到达目标位置的过程中，将插入速度进一步降低至 1–2 µm/s。
  2. 在下降过程中，观察装置的翼状结构（水平聚酰亚胺管）及插入点，以避免过早发生穿梭阵列脱落。
  3. 当达到目标深度时（图7A），使用光固化丙烯酸树脂或其他粘合剂（如氰基丙烯酸酯）将聚酰亚胺翼状结构双侧固定于基座的连接位点（材料表）。如有必要，应将翼状结构或基座上的连接点干燥，因为冷凝水可能积聚在这些表面并影响粘附效果。若视野受限或空间不足，通常仅固定一侧聚酰亚胺翼即可满足要求。
  4. 在聚乙二醇（PEG）溶解前，其表现为位于阵列与插入穿梭接口上方的球状团块（图7A）。通过在阵列与穿梭体粘连处轻轻滴加体温生理盐水来溶解 PEG。所需溶解时间取决于所选 PEG 的分子量，可通过直接观察确认是否完全溶解。当 PEG 完全溶解后，阵列与穿梭体及部件1之间的边界将清晰可辨（图7B）。

手术电极放置、脑部研究、高分辨率手术装置，显示电探针定位。
图7：插入套管的回撤。
(A) 回撤前翅膀的固定。图示双叉阵列和插入套管。(B) 聚乙二醇（PEG）溶解后翅膀粘附情况，箭头所示特征（圈出，蓝色）可用于在回撤过程中视觉确认阵列与套管成功解耦。(C) 插入套管回撤后，阵列成功植入。(D) 基底部件填充硅胶，用于单次双叉阵列植入。所用低黏度硅胶带有蓝色色调。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用回撤式显微操作器缓慢撤出插入导引装置。在撤出阵列的同时持续以约每秒一滴的速度灌注生理盐水。在距离目标深度的不同位置，回撤速度应与插入时的速度保持一致：
    1. 从目标深度至 -500 µm 范围内，以 1–2 µm/s 的速度通过显微操作器进行回撤。
    2. 当回撤至 -500 µm 至 -1 mm 范围时，将显微操作器速度提高至 5 µm/s。
    3. 当回撤至 -1 mm 至 -2 mm 范围时，将显微操作器速度进一步提高至 10 µm/s。
    4. 从目标深度上方 -2 mm 开始及以上的阶段，使用立体定位臂以 25 µm/s 的速度进行回撤。
  2. 在回撤过程中观察阵列与插入导引装置之间的界面。随着导引装置在插片分支的半圆形连接处被撤出，聚合物阵列将明显与导引装置分离，并呈现半透明状态（图 7B）。
  3. 将阵列连接器从部件 2 上取下，并移至不会干扰后续插入操作的位置。此时聚合物电极阵列已留置于脑组织中，且不再与立体定位装置相连（图 7C）。移除插入导引装置及其他插入用硬件组件。
  4. 若需进行多次插入，请重复步骤 4.1–4.9；在所有期望的阵列插入完成前，不要进入下一节操作。不建议将两个装置插入间距小于 250 µm 的区域，因为在应力释放区，装置带状部分从脑组织至翼部之间可能产生轻微弯曲，其延伸范围至少可达此距离。

5. 植入物构建（约 2 小时）

  1. 最后一次阵列插入后，使用移液器或棉签将基座部分的生理盐水吸出，注意不要扰动已植入的阵列或导线带。
  2. 用低粘度硅胶弹性体或其他人工硬脑膜封闭剂填充颅骨开窗区域和基座部分，静置使其固化（图7D）。进行多次插入时，将硬件连接器放置在不会产生干扰的位置（图8A）。正确对齐阵列连接器方向，并构建植入结构，使导线带处于最终期望的位置。
  3. 用中等粘度硅胶弹性体覆盖阵列、阵列导线带和连接器。特别注意聚合物与连接器之间的界面，因为这种软硬材料交界处容易受损。完全包覆阵列导线带，确保中等粘度硅胶固化后导线带被牢固固定。
  4. 将被弹性体包裹的装置放入设计好的外壳中。
  5. 使用牙科丙烯酸树脂加固植入基座。避免丙烯酸树脂直接接触阵列导线带，因其在固化过程中会发生膨胀，可能损坏导电迹线。
  6. 在切口周围涂抹布比卡因和杆菌肽软膏。
  7. 使用4-0尼龙缝线和皮肤胶水关闭切口。

6. 恢复与植入物护理

  1. 将动物从立体定位仪中取出，并侧卧置于加热垫上。
  2. 皮下注射温热的林格氏液（5–10 mL）以补充动物体液。
  3. 待动物恢复自主活动后（10–60 分钟），将其转移至饲养笼中，笼子一半区域置于37 °C加热垫上，持续2–3天。
  4. 在加热垫上提供软化食物和饮水，确保动物可自由取用。
  5. 根据需要，每24小时为动物注射一次2 mg/kg美洛昔康（皮下或口服给药），持续1周，用于疼痛控制。
  6. 让大鼠恢复1–2周，以适应植入物的重量（图8B）。
  7. 定期使用氯己定清洗植入物周围组织，并每日检查是否有刺激、感染或伤口裂开情况。

神经科学实验；啮齿动物头部的微电极阵列；脑活动记录装置。
图8：多次插入的电极阵列及植入后恢复的大鼠。（A）硬件连接器的位置设计避免干扰后续的插入操作。（B）一种1,024通道的慢性聚合物电极阵列植入物。经Neuron期刊许可转载[补充图1H]1。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

按照本方案，一次1,024通道的神经植入记录获得了375个单细胞单位1 （使用 MountainSort 排序）50，噪声重叠 < 0.03，分离 > 0.96，用于单细胞记录的512个通道， 图9A）。该方案可用于将不同数量、不同通道数和规格的装置植入至不同的记录靶区组合。采用相同方案，已证明单个神经元记录的长期稳定性至少可达160天1 来自三只不同大鼠的19个装置的数据（18个32通道装置位于前额叶皮层，1个64通道装置位于眶额皮层）图9B）。其中一只动物因数字电控系统故障，导致无法从四个装置获取记录。在其余15/19个装置中，平均每通道记录到约1个单细胞单位。各个装置的记录产量差异较大，从仅记录到少数几个单细胞单位，到每通道约2个单细胞单位不等。在同一动物相同脑区植入的装置之间记录产量存在显著差异，这种情况较为常见。

此外，另一支外科团队按照本文所述方案，对另外六只动物分别植入了4-6个32通道装置，靶向部位为眶额皮层和伏隔核，并同时植入了一个四极体微型驱动装置（总植入重量约为50 g）。其中一只动物在术后一个月内发生植入物脱落。另一只动物在术后恢复期间死亡，可能与本方案所述操作步骤无关。其余四只动物健康状况良好，植入物稳定，实验持续时间为4至11个月。单细胞记录数量与既往报道的32通道装置结果相似。

图A：聚类与噪声重叠示意图，显示分离度指标。图B：mPFC、OFC每日记录的神经元数量图。
图9：单神经元记录数量与记录持久性。
（A）来自512个通道（来自1,024通道植入电极）的潜在单神经元聚类数量，按质量指标阈值分层。使用MountainSort进行自动筛选（噪声重叠0.03，分离度0.96，右上角黑框）后，从512个通道中识别出375个单神经元。经许可转载自Neuron [图2A]1。（B）大鼠植入后160天内（x轴），聚合物电极阵列每通道（左侧y轴）或每16通道探针（右侧y轴）记录到的单神经元数量。实线表示8个探针的平均细胞数量，虚线表示±1标准误（SE）。每个探针的各个时间点以按脑区着色的圆点表示。经许可转载自Neuron [图3A]1。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方法用于将多个聚合物电极阵列植入大脑的多个区域，以实现持续数月的单细胞单位记录。与目前规模最接近的基于聚合物阵列的系统相比，该方法的记录通道数量增加了8倍，植入次数增加了4倍2,3。该系统在小鼠中采用了基于聚合物网状注射的技术，但未报告明确的单细胞单位数量，因此无法进行单个神经元记录效率的比较。

柔性装置植入方法基于Felix等人先前的方案39，并进行了重要改进：采用三部件插入装置，可在回撤过程中独立控制硅胶载体的运动；并在回撤载体前，将阵列在其目标深度位置进行固定。这两项改进共同消除了原方案中所描述的快速撤出步骤的需要。这些改进可最大限度减少组织损伤，并在载体回撤过程中维持阵列的稳定性。其他柔性装置植入策略，例如使用可生物降解材料暂时增加装置刚性，也与本方案后续步骤兼容。为确保装置在植入体内的固定，需整合此前已验证的有效策略，用于覆盖脑组织并保护脆弱的装置带状部分。

由于其易碎性，在操作过程中需要格外小心，避免直接接触或以其他方式对聚合物电极阵列和硅质插入载体施加外力。特别是当同时操作多个器件时，应在显微镜下观察插入过程，以防止器件之间相互干扰。通常情况下，可以使用塑料尖头镊子轻柔地夹持电极阵列，但需避开导线部分。例如，当聚合物电极阵列随插入载体发生回缩时，该操作策略尤为适用。这种情况可能由聚乙二醇（PEG）未完全溶解，或聚合物与硅材料之间残留的生理盐水或脑脊液表面张力所致。

最常见的可恢复错误之一是阵列从插入导引装置上脱落。这种情况可能发生在插入过程中，当脑组织凹陷且装置尖端压力增大时，如果阵列与导引装置未完全对齐，或聚乙二醇（PEG）因冷凝而部分溶解，就可能发生脱落。为重新粘附阵列，应将其尽可能抬高至脑表面以上，并等待其干燥（约5分钟）。

规划多阵列植入手术的一个关键方面是设计基座部件，以容纳所有植入目标，并紧密贴合颅骨轮廓，不留缝隙。基座是一个小型塑料部件，在完成颅骨清理、螺钉放置和部分颅骨切除后、插入阵列之前，将其固定于颅骨上。它具有三个功能：1）在阵列插入后、硅胶推进针回撤前，容纳用于溶解聚乙二醇（PEG）的生理盐水；2）在颅骨表面之上提供一个位置，使阵列可通过聚酰亚胺翼片固定，从而在阵列进入脑组织的插入点上方对柔性带实现应力释放；3）容纳人工硬脑膜封闭剂，以稳定并保护阵列和脑组织。基座部件可手工制作，也可通过3D打印制备。观察发现，在设备插入前将基座内的生理盐水充分引流并彻底干燥至关重要。这些步骤可防止冷凝水形成以及阵列与插入推进针之间的分离。此外，干燥基座对于后续用人工硬脑膜封闭剂填充基座也极为关键。还需确保基座无泄漏，因为一旦硅胶凝胶薄膜沾染颅骨，很难清除，并会阻碍牙科丙烯酸树脂的黏附，从而影响植入物与颅骨之间长期稳定的固定。预计任何低黏度、生物相容性的硅橡胶均可用于填充颅骨切除区域和基座内部，而其外围及暴露在外的聚合物阵列带部分则应使用高黏度硅橡胶包裹。

聚合物纳米制造技术的进步将推动聚合物基电极阵列的发展，使特征尺寸减小，并使阵列中可容纳的电极数量更接近硅基器件的水平15,16,17,18,19。同样，随着特征尺寸的缩小，聚合物器件的横截面积也将减小，从而进一步提高生物相容性8。此外，正如硅基器件目前所实现的那样，与放大、数字化和多路复用芯片的集成17将进一步推动大规模神经信号记录的实现。

披露

J.E.C 和 L.M.F 是一项与本文所述工作相关的待批准专利的发明人。

致谢

本工作获得了NINDS基金U01NS090537（授予L.M.F和V.M.T.）、NIMH基金F30MH109292（授予J.E.C）以及NIMH基金F30MH115582（授予H.R.J.）的支持。J.E.C.和H.R.J.还获得了NIGMS MSTP基金#T32GM007618的支持。Flatiron研究所是西蒙斯基金会的一个分支机构。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>3D打印立体定位仪适配器部件（3）和底座（1）N/AN/A3D打印部件，建议 <30 μm 分辨率，以便对零件进行最少的手工修整。文件可从以下网址获取：
https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3dParts
<强>牙科丙烯酸树脂（Hygenic Repair Resin，Coltene II型快速固化型）Colten/Whaledent8886784, 8881627用于种植体制作过程中的牙科丙烯酸树脂
<强>液压显微操作器（x2）Narishige 集团MO-101轴显微操作器
<强>聚酰亚胺胶带（Kapton）BertechPPTDE-1/2双面胶带
<强>Kopf 立体定位臂 Kopf Instruments103088R, 103088L标准啮齿类动物立体定位术
<强>光固化牙科丙烯酸树脂，Vivid FlowColtene/WhaledentD33-01-00用于种植体制作过程中的光固化牙科丙烯酸材料
<强>Loctite Gel Control Henkel Corp. 234790 1364076 1735574 1752699使用氰基丙烯酸酯将硅胶穿梭装置粘附至相应的3D打印部件
<强>Metabond 快干水泥ParkellS380用于直接应用于颅骨，以在颅骨与植入物之间形成牢固连接
<强>聚合物电极阵列与硅插入式载体劳伦斯利弗莫尔国家实验室N/A在美国劳伦斯利弗莫尔国家实验室制造的聚酰亚胺电极阵列、硅插入式推车
<强>硅胶试剂盒，低粘度道康宁03/80用于填充3D打印基底部件的低粘度硅胶
<强>硅胶，中等黏度套装世界精密仪器公司 Kwik-Sil用于保护聚合物电极阵列的中等黏度硅胶

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慢性神经植入多区域记录长期电生理记录立体定位装置植入聚合物阵列稳定化高通道神经记录单细胞追踪硅胶封装方法可伸缩植入推注器
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