本文展示了一种用于研究小鼠心肌冷冻损伤后心脏重塑的模型。
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本文内容
摘要
摘要
动物模型的使用对于开发急性冠状动脉综合征及其并发症的新型治疗策略至关重要。本文中，我们展示了一种小鼠冷冻损伤心肌梗死模型，该模型可产生精确且高度可重复和可复制的心肌梗死范围。简言之，在动物插管并进行胸骨切开术后，将心脏从胸腔中取出，使用手持式液氮递送系统的探头作用于心肌壁，以诱导冷冻损伤。可通过超声心动图或光学标测技术监测心室功能障碍和电传导异常。梗死区域的心肌透壁性重塑表现为胶原沉积和心肌细胞丢失。与其他模型（例如左前降支结扎模型，LAD-ligation）相比，该模型采用手持式液氮递送系统，可产生更为均一的梗死范围。
引言
急性冠脉综合征（ACS）是西方国家死亡的主要原因1,2。冠状动脉急性闭塞可引发缺血级联反应，导致受累心肌组织发生坏死3。受损心肌逐渐被无收缩功能的瘢痕组织所取代，临床上表现为心力衰竭4,5。尽管近年来ACS的治疗取得了进展，但ACS及其相关心力衰竭的患病率仍在上升，且治疗选择有限6,7。因此，建立用于研究ACS及其并发症的动物模型具有重要意义。
迄今为止，研究急性冠脉综合征（ACS）及ACS诱导的心肌重构最常用的动物模型是结扎左冠状动脉前降支（LAD）。LAD结扎可导致心肌急性缺血，类似于人类在ACS期间的心肌组织变化 。然而，梗死面积不一致仍是LAD结扎模型的薄弱环节。手术操作差异以及LAD解剖结构的个体差异会导致梗死面积不一致，从而影响该操作的可重复性和再现性8,9,10。此外，LAD结扎具有较高的术中和术后死亡率。尽管近年来已有诸多努力以提高可重复性并降低死亡率11,12，但仍需使用大量动物才能有效评估抗重构疗法。
近年来，已提出并研究了多种急性冠状动脉综合征（ACS）的替代模型，包括射频13、热损伤14或低温损伤15,16,17,18。目前的低温损伤方法是将预先在液氮中冷却的金属棒接触受试对象的心脏组织以造成损伤15,16。然而，该操作需要重复多次才能产生足够大小的梗死区域。由于金属棒的导热性高且热容量低，相较于组织会迅速升温，导致组织冷却（从而形成梗死）不均匀。为克服这些局限性，本文描述了一种采用手持式液氮递送系统的低温梗死模型。该模型可重复性强、操作简便，能够快速且可靠地建立。该方法可产生与冠状动脉解剖无关的可重复透壁梗死病灶，最终导致心力衰竭。此方法特别适用于研究心脏重塑过程，以评估新型药物治疗及基于组织工程的治疗策略。
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方案
动物饲养和实验遵循由实验动物资源研究所制定、美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》中的原则，给予人道护理。所有动物实验方案均经相关地方主管部门（加州大学旧金山分校（UCSF）动物护理与使用委员会）批准。
1. 动物护理
- 获取约14周龄、体重约27 g的小鼠（例如，来自实验动物研究所）。
注意：本文使用BALB/c小鼠。 - 将小鼠饲养在通风柜内的常规条件下，自由摄取标准小鼠饲料和高压灭菌水。
2. 小鼠准备
- 使用诱导室以异氟烷（3.5%）对小鼠进行麻醉。
- 使用毛发修剪器去除胸部和颈部的毛发。
- 将小鼠仰卧位放置于加热垫上，并通过覆盖口鼻的面罩维持麻醉。
- 通过夹捏后肢足部和尾巴检查麻醉深度，确认无反射反应。
- 皮下注射布托啡诺（0.03 mg/kg）以提供镇痛。
- 展开小鼠的前肢和后肢，并用胶带固定其位置。
- 使用聚维酮碘对剃毛区域进行消毒，随后用80%乙醇擦拭；重复此步骤两次。
- 使用小剪刀从胸骨下三分之一处至下颌做正中皮肤切口。
- 使用弯头镊子小心分离颈部周围的肌肉，暴露气管。
- 使用显微剪刀在第二和第三软骨环之间行气管切开术。
- 将呼吸机设置为通气频率110次/分钟，潮气量0.5 mL。
- 移除面罩，将连接至呼吸机的塑料套管（20 G）插入气管，开始通气。
注意：通过确认双侧肺通气，确保通气套管未插入过深。 - 使用电凝设备将右胸大肌从第三至第七肋间的胸骨起点处分离。
- 使用侧角弹簧剪刀尽可能靠近胸骨切断第四至第六肋骨。
- 若可见出血，电凝乳腺动脉 。
- 将异氟烷浓度降低至2.5%。
- 解剖下方结缔组织，以清晰暴露胸腔内部。
- 使用钝头镊子打开心包膜，暴露心脏。
- 使用微型Goldstein牵开器撑开肋骨，保持胸腔开放。
- 用钝棒将心脏从胸腔中轻轻提起。
- 减小牵开器的张力，缩小胸腔开口，防止心脏回缩。
- 预冷冷冻探针（直径3 mm）10秒。
- 将冷冻探针置于左心室前壁，冷冻10秒，以制造左心室冷冻损伤性梗死。
注意：可根据科学问题和实验需求，将冷冻探针应用于心脏的不同壁面。 - 用室温生理盐水冲洗冷冻探针，使其从左心室壁脱离。
- 使用牵开器扩大胸腔开口。
- 用钝棒将心脏轻柔复位至胸腔内。
- 移除牵开器，并使用6-0缝线单结缝合胸骨切口。
- 使用6-0连续缝合关闭胸腔；在打结前，用10 mL注射器抽出胸腔内残留空气。
- 调整皮肤至尾侧边缘，并使用连续缝合（5-0）将其缝合至气管切口处。
- 将异氟烷浓度调至1.5%，等待动物恢复自主呼吸。
- 移除气管插管，重新将面罩覆盖于动物口鼻以维持麻醉。
- 使用一根8-0缝线缝合气管切口。
- 将颈部腹侧肌肉复位，覆盖气管。
- 完成皮肤缝合。
- 在饮水中添加安乃近（每100 mL水含50 mg安乃近），连续3天用于镇痛，并每日监测动物状态。
注意：本模型的观察期为8周。请务必遵循所在机构关于镇痛方案的指导原则。
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结果
冷冻损伤梗死模型适用于研究急性冠脉综合征（ACS）及其并发症。该模型表现出较低的死亡率和高效的术后恢复。冷冻损伤引起的心肌损害可导致心脏功能下降、电耦联中断以及透壁性重构。
超声心动图可用于无创性地在活体中监测心脏功能。在冷冻损伤的心脏中，超声心动图显示射血分数和面积变化率显著降低（图1a-c）。功能损害从术后第7天持续至观察终点第56天。
可通过压力-容积环（PV环）分析对心脏功能进行有创性评估。将一根1.2 Fr的导电性导管插入左心室，绘制左心室压力与左心室容积的关系曲线。可计算包括每搏输出量、每搏功、心输出量以及前负荷校正的最大功率在内的血流动力学参数。如图1d-h所示，冷冻心肌梗死会导致左心室（LV）功能受损，表现为每搏输出量、每搏功、心输出量以及前负荷校正的最大功率下降。
为了...
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讨论
本文介绍了一种用于研究急性冠状动脉综合征（ACS）及相关药理学和治疗方案的小鼠冷冻损伤模型。
最关键的步骤是将冷冻探针应用于心肌组织。必须严格控制接触时间，以获得最佳梗死面积并确保结果具有可重复性。心肌冷却时间过长会导致梗死面积过大或心室穿孔；而冷却时间过短则只能形成局限性的表层心外膜损伤，无法完全消除所有定居细胞。因此，在研究再生细胞移植时，这种情况可能造成干扰。
与其他冷冻梗死方法20相比，本文所述的开胸方法具有可在心脏不同部位自由诱导梗死的优势。此外，由于梗死边界清晰可见，可据此选择细胞移植部位，因此该方法便于进行治疗性细胞注射或贴片应用。
该模型的一个缺点是心肌损伤的病因学问题。冷冻损伤导致细胞死亡的原因是冰晶形成并破坏细胞膜，而非直接的缺血所致。此外，损伤通常从心外膜向内发展，而缺血性梗死则倾向于从心内膜向外扩展至心外膜层。因此，该模型在研究心肌缺血的病理生理机制或模拟缺血-再灌注情况方面具有局限性。<...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Christiane Pahrmann提供的技术支持。D.W. 获得了马克斯·卡德基金会的资助。T.D. 收到来自Else Kröner基金会（2012_EKES.04）和德国研究基金会（DE2133/2-1_）的资助。S.S. 收到了德国研究基金会（DFG；SCHR992/3-1，SCHR992/4-1）的研究资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 ml 注射器 | 赛默飞世尔科技 | 03-377-23 | |
| 5-0 Prolene 缝线 | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 Prolene 缝线 | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon 缝线 | Ethicon | 2808G | |
| 吸收探针 | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | 杰克逊实验室 | 品系编号 000651 | |
| Bepanthen 眼鼻软膏 | 拜耳 | 1578675 | 眼膏 |
| 聚维酮碘溶液 | Betadine 普渡制药 | NDC：67618-152 | |
| 钝头镊子 | 精细科学工具 | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC 编码： 12496-0757-1, 12496-0757-5 | 布托啡诺 |
| Cryoprobe 3mm | Brymill 低温系统 | Cry-AC-3 B-800 | |
| 70% 乙醇 | Th. Geyer | 2270 | |
| 弯头镊子 | S&与 | 00284 | |
| 精细镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 标准镊子 | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| 大体解剖探针 | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| 理发剪 | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| 高温电灼套装 | Bovie | 18010-00 | |
| 异氟烷 | Henry Schein 动物健康 | 029405 | |
| 20G 静脉导管 | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein拉钩 | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 产品编号：3570160 | 生理盐水 |
| 持针器 | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| 持针器，弯型 | 哈佛仪器公司 | 72-0146 | |
| 诺瓦明磺酮 | Ratiopharm | PZN 03530402 | 安乃近 |
| 操作板 | Braintree Scientific | 39OP | |
| 可更换精细尖头 | Bovie | H101 | |
| 剪刀 | 精细科学工具 | 14028-10 | |
| 小型动物呼吸机 | Kent Scientific | RV-01 | |
| 弹簧剪 - 侧向倾斜 | 精细科学工具 | 15006-09 | |
| 手术显微镜 | Leica | M651 | |
| Transpore 外科手术胶带 | 3M | 1527-1 | |
| 万纳斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| 蒸发器 | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
参考文献
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重印与许可
