本研究介绍了一种从鲟鱼物种的鳍和颌骨中提取皮质醇的实验方案。通过比较两种洗涤溶剂并结合酶联免疫吸附测定（ELISA），进一步检测了鳍和颌骨中的皮质醇水平。本研究初步验证了将颌骨皮质醇作为新型应激指标的可行性。
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摘要
摘要
本研究旨在建立一种使用两种洗涤溶剂（水和异丙醇）从鲟鱼鳍中提取皮质醇的技术，并量化三种主要鲟鱼物种之间鳍中皮质醇水平的差异。鳍组织取自19尾被安乐死的鲟鱼，其中包括7尾欧洲鳇（Huso huso）、7尾西伯利亚鲟（Acipenser baerii）和5尾小体鲟（A. stellatus）。这些鲟鱼在中国台湾的伊朗养殖场饲养了两年（2017–2018年），皮质醇提取分析于2019年1月至2月在韩国完成。此外，还采集了5尾H. huso的颌骨用于皮质醇提取。数据采用SAS软件中的广义线性模型（GLM）过程进行分析。批内和批间变异系数分别为14.15%和7.70%。简而言之，皮质醇提取方法包括：将样品（300 ± 10 mg）用3 mL溶剂（超纯水和异丙醇）各洗涤两次，在80 rpm条件下旋转2.5分钟，洗涤后的样品在室温（22–28 °C）下晾干7天，随后使用珠磨仪在50 Hz条件下进一步干燥32分钟并研磨成粉末，向干燥粉末（75 ± 5 mg）中加入1.5 mL甲醇，并在室温下缓慢旋转（40 rpm）18小时，持续混合。提取完成后，样品以9,500 × g离心10分钟，取1 mL上清液转移至新的微量离心管（1.5 mL）中，在38 °C孵育以蒸发甲醇，然后通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）进行分析。不同物种间的鳍皮质醇水平以及不同洗涤溶剂处理下的鳍与颌骨皮质醇水平均未观察到显著差异。本研究结果表明，鲟鱼颌骨基质可作为固体基质中一种有前景的替代性应激指标。
引言
皮质醇是动物应激反应的可靠指标。皮质醇提取为研究人员监测应激水平及应激源的一般模式提供了有效的研究框架。例如，以往研究已采用多种方法对人类1,2、猴子3,4、牛5、绵羊6和金鱼7,8的毛发皮质醇检测方法进行了方法学验证。在鱼类中，已证明通过鳞片、皮肤黏液、粪便和血液9等基质中的皮质醇测定可提供有关鱼类健康状况的信息。当采血存在困难或缺乏鳞片时，就需要采用其他替代基质进行皮质醇提取。在鱼类中，可替代的基质包括颌骨，这是一种类似于人类牙齿的硬组织 10。
开发新型基质及经过验证的技术来测定鱼类的应激水平，对鱼子酱产业具有特别重要的意义，因为鲟鱼可能长期暴露于各种环境应激因素中11。鲟鱼在两岁之前无法确定性别，且体表无鳞片。由于皮质醇在生长阶段会逐渐在固体基质中累积
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方案
以下实验程序和方法已获得韩国春川江原国立大学动物福利与伦理委员会的批准。
1. 鳍条采集
- 使用网具轻柔地捕获鲟鱼，以尽量减少损伤和应激。
- 用清水小心冲洗鱼体，然后在处死前用吸水毛巾擦拭体表。
- 使用塑料锤击打鱼头，使其昏迷或失去意识，随后用刀切除头部。
- 测量鱼体体重（g）和体长（cm）。
- 处死后，使用灭菌的手术剪尽可能靠近身体处剪取鳍组织样本。
注意：每条鱼必须使用单独的、不可重复使用的吸水毛巾。本研究中所用物种的描述性统计如下：欧洲鳇（H. huso）：年龄 = 18 ± 2.1 月龄，体重 = 2,700 ± 300 g，体长 = 55 ± 5 cm；西伯利亚鲟（A. baerii）：年龄 = 9.6 ± 2.4 月龄，体重 = 1,750 ± 250 g，体长 = 45 ± 5 cm；小体鲟（A. stellatus）：年龄 = 14 ± 1.3 月龄，体重 = 1,000 ± 100 g，体长 = 65 ± 5 cm。
2. 皮质醇提取的鳍组织制备
- 将鳍条样本（每种组织一个样本：约 3 g）置于实验室称量纸上（107 mm × 210 mm），在室温下干燥数天，直至完全干燥。
- 用铝箔纸包裹....
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结果
本研究采用三种鲟鱼建立了鳍条皮质醇提取技术并进行了验证。比较了使用超纯水和异丙醇作为洗涤溶剂所获得的皮质醇水平（图2）。通过检测 H. huso 的颌骨组织，探讨了鲟鱼颌骨是否可作为鳍条之外的替代基质。洗涤溶剂、鲟鱼种类及其交互作用的影响见表1。使用异丙醇洗涤的鳍条样本中皮质醇水平较使用水洗涤的样本有升高趋势（p = 0.089）。不同鲟鱼种类之间的鳍条皮质醇水平无显著差异（p = 0.525）。洗涤溶剂与鲟鱼种类之间亦无显著交互作用（p = 0.947）。在 H. huso 鲟鱼中，洗涤溶剂对皮质醇水平无显著影响（p = 0.45）（表2）。批内和批间变异系数分别为14.15和7.70。数据表明，三种鲟鱼鳍条之间（表1）以及 H. huso 颌骨组织之间（表2）具有高度相似性。由于颌骨样本仅来自 H. huso
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讨论
鲟鱼有时被称为“"活化石"，因其在过去的数千年中形态变化极小。鲟属Acipenser包含27种可生产鱼子酱的物种；然而，全球大部分鱼子酱供应来自其中三个物种（欧洲鳇、西伯利亚鲟和小体鲟）。鲟鱼易受过度捕捞及自然栖息地干扰的影响，因此其濒危程度超过其他任何物种类群。鲟鱼属于现存最古老的脊椎动物类群，已存在约1.5亿年。Acipenser属物种性成熟晚且生长缓慢；部分种类（如H. huso）寿命可达100年，体重超过2,000 kg。鲟鱼为无鳞的软骨鱼类，其特征为体表具有五排大型骨板（称为硬鳞），以及位于口部前方的触觉须（图1）。与其他鱼类相比，这类物种的生理差异包括血浆（皮质类固醇）对环境应激源的反应较弱。我们对鳍部皮质醇的测定结果表明，鲟鱼颌骨中皮质醇的积累量与循环中的浓度成正比。
鱼类对物理性、化学性及感知性应激源会表现出多种反应。这些反应作为适应性机制已被广泛认知，可使鱼类应对环境干扰并维持稳态。如果应激源持续时间过长或程度过重，导致鱼类无法通过自身.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了农业科学协同研究计划的支持 & 技术开发（项目名称：气候变化下的畜牧业生产率变化分析，项目编号：PJ012771），韩国农村振兴厅。此外，本研究还得到了动物营养项目资助（编号：PJ01344604） & 生理学团队，韩国农村振兴厅国家畜产科学研究所，首尔，大韩民国。作者衷心感谢波斯手势公司（Persian Gesture）首席执行官 Mohammad Hassan Salmanzadeh 及其团队，他们为本研究中检测的三种鲟鱼物种提供了实验鱼类。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 一次性乳胶外科手套 | Ansell | 63754090 | |
| 电子平台秤，称重范围100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| 可移液至24 mL的血清学移液管 | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| 配备450 nm及490至492 nm参考滤光片的酶标仪 | BioTek | 8041000 | |
| 试剂储液槽 | BrandTech | 703459 | |
| 拉链式塑料储存袋 | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| 异丙醇 | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| 甲醇 | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| 试管旋转混合仪 - MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| 可移液1.5和10 mL的精密移液器 | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| 可移液15和25 μL的精密移液器 | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| 称量纸（107 x 210 mm） | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| 珠磨机，50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| 轨道式平板旋转仪，转速可达500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| 一次性聚丙烯管，容量至少24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| 通风橱 | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| 可达到1500 × g的微型离心机 | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| 微型涡旋混合器 | LMS | VTX-3000L | |
| 乐天铝箔卷 | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| 电子天平 | Mettler Toledo | ME204 | |
| 超纯水 | MDM | MDM-0110 | |
| 移液器吸头 | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| 大型渔网 | Pond H2O | Hoz135 | |
| 唾液皮质醇检测试剂盒 | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| 骨剪钳 | Sankyo | 26-188A | |
| 可移液50 μL和200 μL的多通道精密移液器 | VITLAB | 18A68756 | |
| 毛巾 | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| 纸巾（107 × 210） | Yuhan Kimberly | 41117 |
参考文献
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal S....
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