本研究介绍了一种从鲟鱼物种的鳍和颌骨中提取皮质醇的实验方案。通过比较两种洗涤溶剂并结合酶联免疫吸附测定（ELISA），进一步检测了鳍和颌骨中的皮质醇水平。本研究初步验证了将颌骨皮质醇作为新型应激指标的可行性。
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摘要
摘要
本研究旨在建立一种使用两种洗涤溶剂（水和异丙醇）从鲟鱼鳍中提取皮质醇的技术，并量化三种主要鲟鱼物种之间鳍中皮质醇水平的差异。鳍组织取自19尾被安乐死的鲟鱼，其中包括7尾欧洲鳇（Huso huso）、7尾西伯利亚鲟（Acipenser baerii）和5尾小体鲟（A. stellatus）。这些鲟鱼在中国台湾的伊朗养殖场饲养了两年（2017–2018年），皮质醇提取分析于2019年1月至2月在韩国完成。此外，还采集了5尾H. huso的颌骨用于皮质醇提取。数据采用SAS软件中的广义线性模型（GLM）过程进行分析。批内和批间变异系数分别为14.15%和7.70%。简而言之，皮质醇提取方法包括：将样品（300 ± 10 mg）用3 mL溶剂（超纯水和异丙醇）各洗涤两次，在80 rpm条件下旋转2.5分钟，洗涤后的样品在室温（22–28 °C）下晾干7天，随后使用珠磨仪在50 Hz条件下进一步干燥32分钟并研磨成粉末，向干燥粉末（75 ± 5 mg）中加入1.5 mL甲醇，并在室温下缓慢旋转（40 rpm）18小时，持续混合。提取完成后，样品以9,500 × g离心10分钟，取1 mL上清液转移至新的微量离心管（1.5 mL）中，在38 °C孵育以蒸发甲醇，然后通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）进行分析。不同物种间的鳍皮质醇水平以及不同洗涤溶剂处理下的鳍与颌骨皮质醇水平均未观察到显著差异。本研究结果表明，鲟鱼颌骨基质可作为固体基质中一种有前景的替代性应激指标。
引言
皮质醇是动物应激反应的可靠指标。皮质醇提取为研究人员监测应激水平及应激源的一般模式提供了有效的研究框架。例如，以往研究已采用多种方法对人类1,2、猴子3,4、牛5、绵羊6和金鱼7,8的毛发皮质醇检测方法进行了方法学验证。在鱼类中，已证明通过鳞片、皮肤黏液、粪便和血液9等基质中的皮质醇测定可提供有关鱼类健康状况的信息。当采血存在困难或缺乏鳞片时，就需要采用其他替代基质进行皮质醇提取。在鱼类中，可替代的基质包括颌骨，这是一种类似于人类牙齿的硬组织 10。
开发新型基质及经过验证的技术来测定鱼类的应激水平，对鱼子酱产业具有特别重要的意义，因为鲟鱼可能长期暴露于各种环境应激因素中11。鲟鱼在两岁之前无法确定性别，且体表无鳞片。由于皮质醇在生长阶段会逐渐在固体基质中累积2,7,12，因此从鳍条和颌骨等硬组织中获取的长期皮质醇累积数据，可反映鲟鱼在不同生长阶段的应激水平。相比之下，血液中的皮质醇水平仅能反映个体死亡时的瞬时应激状态，无法准确代表长期养殖过程中的应激情况13,14。随着鱼子酱市场竞争加剧，如何改善长期养殖（8–12年或更长时间）过程中鲟鱼的应激状况，以生产更健康的卵子，已成为日益重要的研究方向。由于鲟鱼养殖成本高昂，采集样本的费用极为昂贵（每尾性成熟个体根据种类和生长阶段不同，价格在8,000至15,000美元之间），这成为科研项目的限制因素。然而，若能建立适用于从鲟鱼鳍条和颌骨中提取皮质醇的适当技术，该方法不仅可用于养殖系统，也可应用于野生鱼类，从而提升鲟鱼卵在食用和保育方面的品质与收获效率。
除了提供可靠的结果外6，选择合适的皮质醇提取方法至关重要，以确保样品制备过程中基质中存在的其他化合物不会干扰检测结果，从而导致结果不一致。同样重要的是确定鳍条和颌骨中的皮质醇水平是否受到周围水中激素水平的影响。Heimbürge 等人15指出，多种因素可能影响皮质醇水平，包括年龄、性别、妊娠状态、季节、体色12以及皮质醇提取部位16。然而，关于洗涤溶剂对鱼类组织基质中皮质醇提取效果的影响，目前可用的信息较少8，且在鲟鱼中除鱼卵外，尚无相关研究报道17。
尽管分析鲟鱼鳍条和颌骨中的基础皮质醇水平需要对鱼类实施安乐死，但该方法无需对活体鲟鱼进行侵入性采血。鳍条和颌骨样本易于采集，且可快速完成组织中的激素提取。同样，激素的提取与分析过程简便，所需专业设备较少。
本研究介绍了一种新颖且易于操作的技术，用于从鱼类鳍条和颌骨中提取、洗涤并测定皮质醇，旨在确定从这些基质中测得的皮质醇水平是否可作为可靠的应激指标。该技术的优点包括操作简便且无创8、数据变异较小以及结果可靠1,6,8,17；该方法适用于无鳞鱼类（如鲟鱼）。该技术需屠宰鱼类，选择合适的洗涤溶剂2,4，对样品进行充分研磨3,5，规范地应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）5,7，并具备关于皮质醇来源如何整合进入固体基质的深入知识6。
我们采用两种不同的清洗溶剂（超纯水和异丙醇）处理三种鲟鱼的鳍条，以获取基础皮质醇水平：欧洲鳇 (Huso huso）、西伯利亚（Acipenser baerii）和塞弗鲁加（sevruga）A. stellatus），在每种物种的标准环境条件下。颌骨的 H. huso 也用于评估鲟鱼的应激状态。这是首次测量鲟鱼颌骨中皮质醇水平的研究。本研究结果将为性腺分化前早期生长阶段（约1年）的鲟鱼物种提供皮质醇的比较数据。
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方案
以下实验程序和方法已获得韩国春川江原国立大学动物福利与伦理委员会的批准。
1. 鳍条采集
- 使用网具轻柔地捕获鲟鱼，以尽量减少损伤和应激。
- 用清水小心冲洗鱼体，然后在处死前用吸水毛巾擦拭体表。
- 使用塑料锤击打鱼头，使其昏迷或失去意识，随后用刀切除头部。
- 测量鱼体体重（g）和体长（cm）。
- 处死后，使用灭菌的手术剪尽可能靠近身体处剪取鳍组织样本。
注意：每条鱼必须使用单独的、不可重复使用的吸水毛巾。本研究中所用物种的描述性统计如下：欧洲鳇（H. huso）：年龄 = 18 ± 2.1 月龄，体重 = 2,700 ± 300 g，体长 = 55 ± 5 cm；西伯利亚鲟（A. baerii）：年龄 = 9.6 ± 2.4 月龄，体重 = 1,750 ± 250 g，体长 = 45 ± 5 cm；小体鲟（A. stellatus）：年龄 = 14 ± 1.3 月龄，体重 = 1,000 ± 100 g，体长 = 65 ± 5 cm。
2. 皮质醇提取的鳍组织制备
- 将鳍条样本（每种组织一个样本：约 3 g）置于实验室称量纸上（107 mm × 210 mm），在室温下干燥数天，直至完全干燥。
- 用铝箔纸包裹样本，放入标记好的塑料袋中，并转移至实验室。
- 将样本储存于冰箱中以备后续使用，包括清洗、皮质醇提取、干燥及ELISA分析（图2）。
3. 鳍条皮质醇分析
- 校准电子分析天平（精度：0.0001），使用称量纸在天平托盘上称取 300 ± 10 mg 的样品。
- 清洗样品。
- 将每个样品转移至一个 15 L 的锥形聚丙烯管中。使用 5,000 µL 单通道移液器向每根管中加入 3 mL 异丙醇。
- 以 80 rpm 转速旋转管子 2.5 分钟，以洗脱皮质醇并去除任何可能的外部污染。重复此步骤两次。
- 将清洗后的样品在室温（22–28 °C）下空气干燥 7 天。
- 使用超纯水作为清洗剂，重复上述清洗步骤。
- 使用骨剪钳从组织中取出下颌骨。对下颌骨样品执行步骤 1.5–3.2.4。
- 称取 (75 ± 5 mg) 干燥的鳍条或下颌骨样品，使用珠磨机在 50 Hz 条件下研磨 32 分钟。
- 使用 1000 µL 移液器向每根含有粉末状鳍条或下颌骨的管中加入 1.5 mL 甲醇。将样品置于管式旋转仪上，在室温下以慢速（40 rpm）旋转 18 小时，通过持续混合提取皮质醇。
- 完成皮质醇提取后，在室温下以 9,500 x g 离心 10 分钟。离心后，从每个样品中收集含有皮质醇的上层有机相（1 mL），并转移至单独的 1.5 mL 微量离心管中。
- 在 38 °C 下孵育样品以干燥并蒸发甲醇。将提取的皮质醇样品置于通风橱中过夜，使甲醇充分挥发。
注意：含皮质醇的层通常呈淡黄色。
- 在 38 °C 下孵育样品以干燥并蒸发甲醇。将提取的皮质醇样品置于通风橱中过夜，使甲醇充分挥发。
4. 鳍条皮质醇检测
- 使用ELISA试剂盒前，将干燥的鳍条或颌骨样品在室温下解冻1.5小时。
- 加入400 µL磷酸盐缓冲液，涡旋混匀，并在1,500 × g条件下离心15分钟。
- 每个样品取25 µL进行双复孔检测，以提高检测的准确性和可靠性。剔除标准曲线范围之外的数据，视为异常值。
- 将酶标仪设定为450 nm波长，单位设为µg dL-1，读取酶标板的光密度值。
- 使用酶标仪配套软件，采用四参数非线性回归曲线拟合。利用以下公式将软件获得的样品皮质醇浓度转换为pg mg-1：
F = 10,000E (A/B) (C/D)，
其中F = 鳍条皮质醇水平的最终值（pg mg-1），E = 用于溶解干燥提取物的检测缓冲液体积（mL），A = 检测输出提供的浓度（µg dL-1），B = 用于提取的鳍条重量（mg），C = 加入到鳍条粉末中的甲醇体积（mL），D = 从提取物中回收并经干燥处理的甲醇体积（mL）3。
- 使用酶标仪配套软件，采用四参数非线性回归曲线拟合。利用以下公式将软件获得的样品皮质醇浓度转换为pg mg-1：
5. 统计分析
- 在洗涤步骤之前，将每个样品分为两个子样品，然后在ELISA试剂盒检测中进行重复测定（每个样品共4个观测值，即2 × 2），以提高检测效能和结果的可靠性。
- 采用SAS软件环境中的广义线性模型（GLM）过程，对测量数据进行分析，比较两种洗涤溶剂的效应及其相互作用18。
- 使用Tukey检验在显著性水平p < 0.05下检验均值间的差异。若0.05 < p < 0.10，则视为存在趋势性差异，而非显著差异。
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结果
本研究采用三种鲟鱼建立了鳍条皮质醇提取技术并进行了验证。比较了使用超纯水和异丙醇作为洗涤溶剂所获得的皮质醇水平（图2）。通过检测 H. huso 的颌骨组织，探讨了鲟鱼颌骨是否可作为鳍条之外的替代基质。洗涤溶剂、鲟鱼种类及其交互作用的影响见表1。使用异丙醇洗涤的鳍条样本中皮质醇水平较使用水洗涤的样本有升高趋势（p = 0.089）。不同鲟鱼种类之间的鳍条皮质醇水平无显著差异（p = 0.525）。洗涤溶剂与鲟鱼种类之间亦无显著交互作用（p = 0.947）。在 H. huso 鲟鱼中，洗涤溶剂对皮质醇水平无显著影响（p = 0.45）（表2）。批内和批间变异系数分别为14.15和7.70。数据表明，三种鲟鱼鳍条之间（表1）以及 H. huso 颌骨组织之间（表2）具有高度相似性。由于颌骨样本仅来自 H. huso
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讨论
鲟鱼有时被称为“"活化石"，因其在过去的数千年中形态变化极小。鲟属Acipenser包含27种可生产鱼子酱的物种；然而，全球大部分鱼子酱供应来自其中三个物种（欧洲鳇、西伯利亚鲟和小体鲟）。鲟鱼易受过度捕捞及自然栖息地干扰的影响，因此其濒危程度超过其他任何物种类群。鲟鱼属于现存最古老的脊椎动物类群，已存在约1.5亿年。Acipenser属物种性成熟晚且生长缓慢；部分种类（如H. huso）寿命可达100年，体重超过2,000 kg。鲟鱼为无鳞的软骨鱼类，其特征为体表具有五排大型骨板（称为硬鳞），以及位于口部前方的触觉须（图1）。与其他鱼类相比，这类物种的生理差异包括血浆（皮质类固醇）对环境应激源的反应较弱。我们对鳍部皮质醇的测定结果表明，鲟鱼颌骨中皮质醇的积累量与循环中的浓度成正比。
鱼类对物理性、化学性及感知性应激源会表现出多种反应。这些反应作为适应性机制已被广泛认知，可使鱼类应对环境干扰并维持稳态。如果应激源持续时间过长或程度过重，导致鱼类无法通过自身...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了农业科学协同研究计划的支持 & 技术开发（项目名称：气候变化下的畜牧业生产率变化分析，项目编号：PJ012771），韩国农村振兴厅。此外，本研究还得到了动物营养项目资助（编号：PJ01344604） & 生理学团队，韩国农村振兴厅国家畜产科学研究所，首尔，大韩民国。作者衷心感谢波斯手势公司（Persian Gesture）首席执行官 Mohammad Hassan Salmanzadeh 及其团队，他们为本研究中检测的三种鲟鱼物种提供了实验鱼类。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 一次性乳胶外科手套 | Ansell | 63754090 | |
| 电子平台秤，称重范围100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| 可移液至24 mL的血清学移液管 | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| 配备450 nm及490至492 nm参考滤光片的酶标仪 | BioTek | 8041000 | |
| 试剂储液槽 | BrandTech | 703459 | |
| 拉链式塑料储存袋 | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| 异丙醇 | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| 甲醇 | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| 试管旋转混合仪 - MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| 可移液1.5和10 mL的精密移液器 | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| 可移液15和25 μL的精密移液器 | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| 称量纸（107 x 210 mm） | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| 珠磨机，50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| 轨道式平板旋转仪，转速可达500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| 一次性聚丙烯管，容量至少24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| 通风橱 | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| 可达到1500 × g的微型离心机 | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| 微型涡旋混合器 | LMS | VTX-3000L | |
| 乐天铝箔卷 | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| 电子天平 | Mettler Toledo | ME204 | |
| 超纯水 | MDM | MDM-0110 | |
| 移液器吸头 | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| 大型渔网 | Pond H2O | Hoz135 | |
| 唾液皮质醇检测试剂盒 | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| 骨剪钳 | Sankyo | 26-188A | |
| 可移液50 μL和200 μL的多通道精密移液器 | VITLAB | 18A68756 | |
| 毛巾 | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| 纸巾（107 × 210） | Yuhan Kimberly | 41117 |
参考文献
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