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方法文章

使用 CRISPR/Cas9 系统将基因敲除直接引入克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的无鞭毛体阶段

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DOI：

10.3791/59962

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2019年7月31日

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统在克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的胞外无鞭毛体中实现基因敲除的实验方案。可通过无血清培养的无鞭毛体细胞计数，或通过检测无鞭毛体侵入宿主细胞后的胞内增殖情况，来追踪其生长表型。

摘要

Trypanosoma cruzi 是一种致病性原生动物寄生虫，主要在拉丁美洲引起恰加斯病。为了鉴定针对 T. cruzi 的新型药物靶点，验证目标基因在寄生虫哺乳动物阶段（即无鞭毛体）中的必需性至关重要。T. cruzi 的无鞭毛体在宿主细胞内进行复制，因此在不经历其他发育阶段的情况下难以开展基因敲除实验。最近，我们课题组报道了一种培养条件，可在该条件下无鞭毛体体外无细胞培养中持续复制长达10天，同时保持其无鞭毛体样特性。利用这种短期无细胞培养的无鞭毛体，我们成功将gRNA直接导入表达Cas9的无鞭毛体中，实现基因敲除，并专门在无鞭毛体阶段分析其表型。本报告中，我们详细描述了一种体外获得胞外无鞭毛体的实验方案，以及如何在CRISPR/Cas9介导的基因敲除实验中应用该无细胞培养体系。基因敲除后无鞭毛体的生长表型可通过无细胞培养体系中的细胞计数，或通过其侵入宿主细胞后胞内无鞭毛体的复制能力进行评估。该方法避免了通常在获得转基因或基因敲除无鞭毛体过程中所必需的寄生虫阶段转化步骤。利用这种短期无细胞培养的无鞭毛体体系，有望拓展对 T. cruzi 发育阶段特异性研究的实验自由度。

引言

Trypanosoma cruzi 是恰加斯病（Chagas病）的致病因子，该疾病主要流行于拉丁美洲1。T. cruzi 在昆虫媒介与哺乳动物宿主之间传播时具有独特的生活史阶段2。在吸血锥蝽的中肠内，T. cruzi 以增殖性的前鞭毛体（epimastigote）形式进行复制，并在其后肠分化为具有感染性的循环型三鞭毛体（metacyclic trypomastigote），随后被排至人类或动物宿主体表。当三鞭毛体通过叮咬部位或黏膜进入宿主体内后，寄生虫侵入宿主细胞，并转化为一种无鞭毛的圆形形式，称为无鞭毛体（amastigote）。无鞭毛体在宿主细胞内进行复制，最终再分化为三鞭毛体，后者破裂宿主细胞进入血液循环，以感染其他宿主细胞。

由于目前可用的化学治疗药物（苄硝唑和硝呋莫司）会产生不良副作用，且对恰加斯病的慢性期无效3，因此寻找针对T. cruzi的新药物靶点具有重要意义。近年来，CRISPR/Cas9系统已成为在T. cruzi中有效实现基因敲除的有力工具，可通过转染包含gRNA和Cas9的独立或单个质粒4、通过稳定表达Cas9后引入gRNA5,6,7或gRNA的转录模板8，或通过电穿孔导入预先形成的gRNA/Cas9核糖核蛋白复合物7,9等方式实现。这一技术进步有望显著加快恰加斯病药物靶点的研究进程。

为了推进药物开发，验证目标基因在T. cruzi无鞭毛体中的必要性或候选药物化合物的效力至关重要，因为无鞭毛体是该寄生虫在哺乳动物宿主内的复制阶段。然而，这一任务具有挑战性，由于宿主细胞的存在阻碍了对无鞭毛体的直接操作。在与T. cruzi亲缘关系相近的原虫寄生虫Leishmania中，已建立了一种无细胞培养的无鞭毛体方法，并已被用于药物筛选实验10,11,12,13。尽管无细胞培养的无鞭毛体与细胞内无鞭毛体对化合物的敏感性存在一些差异14，但维持无细胞培养的能力仍为研究Leishmania临床相关阶段的基本生物学提供了有价值的实验工具15,16。对于T. cruzi而言，有关天然存在的胞外无鞭毛体（EA）的文献17以及EA的体外生成方法17,18,19可追溯至数十年前。此外，已知EA具有感染能力20，尽管其感染能力低于上鞭毛体，近年来关于无鞭毛体侵入宿主的机制也已被阐明（Bonfim-Melo 等人综述21）。然而，与Leishmania不同，EA在T. cruzi中尚未被用作实验工具，主要原因是EA一直被视为专性细胞内寄生虫，因此在实际意义上未被认为是“可复制形式”。

最近，我们课题组提出将T. cruzi的细胞外无鞭毛体（EA）用作一种时间受限的无菌培养体系22。在37 °C条件下，T. cruzi Tulahuen株的无鞭毛体可在LIT培养基中脱离宿主细胞进行复制，持续长达10天，且无明显退化或丧失无鞭毛体样特性。在无宿主细胞的生长期间，已成功利用EA实现了外源基因通过常规电穿孔法的表达、利用锥虫杀灭化合物进行药物滴定实验，以及通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除并随后进行生长表型监测。在本报告中，我们详细描述了体外获得EA的制备方案，以及在基因敲除实验中使用无菌无鞭毛体的方法。

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方案

注意：整个实验流程的概述见图1。

锥虫基因编辑过程示意图：电穿孔、Cas9、无细胞复制、宿主细胞侵袭。
图1：使用EA的基因敲除实验概览。从组织培养中收获的上鞭毛体被诱导分化为EA。通过电穿孔将gRNA转染至表达Cas9的无鞭毛体中，随后通过无细胞复制或在侵入宿主细胞后的胞内复制来评估基因敲除无鞭毛体的生长表型。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 寄生虫培养准备

  1. Tulahuen 菌株 克氏锥虫 在本报告中始终使用。维持克氏锥虫无鞭毛体的 T. cruzi 在LIT培养基（10% FCS，参见 补充表1）。拧紧瓶盖，将培养瓶置于 28 °C.
  2. 生成转基因品系 T. cruzi 含有Cas9内切核酸酶的质粒。包含Cas9编码序列和G418（neo）的表达质粒示例r) 筛选标记可参见 Lander 等人的研究。4 和 Peng 等人5
    1. 通过电穿孔法将上述质粒转染至上鞭毛体，使用下述列表中的试剂盒 材料表. 对于1个比色皿，离心收集2 × 107 细胞，弃去上清液，并用 100 µL 含所提供补充液的电穿孔缓冲液。
      注意： 电穿孔缓冲液可用EM缓冲液替代24 细胞融合素（cytomix）3:1混合物25 和磷酸-蔗糖缓冲液）。
    2. 加入20-40 µg 质粒，并将混合物转移至2 mm间隙的电穿孔比色皿中。使用电穿孔仪施加电脉冲（参见 材料表），使用X-14程序26.
    3. 将比色皿中的内容物转移至含有5 mL LIT培养基（10% FCS）的T-25培养瓶中。将培养瓶置于 28 °C 24 h.
    4. 加入G418至终浓度 250 µg/mL 并在28 ˚C继续培养。大约需要1周时间以清除未转染的上鞭毛体。当G418抗性群体开始恢复生长时，每周传代一次或两次，以避免培养物饱和并稀释死亡细胞。稳定细胞系的建立通常共需4周时间。
      注意： 如果Cas9的组成型表达对细胞造成负担5，通过将amastin基因的3’-非翻译区（3’-UTR）连接至Cas9开放阅读框的下游，使表达特异性地局限于无鞭毛体阶段27利什曼原虫无鞭毛体特异性Cas9表达质粒的详细描述见Takagi等人的研究。22
  3. 建立表达 Cas9 的宿主-寄生虫共培养体系 T. cruzi 以及哺乳动物宿主细胞。本报告中使用3T3-Swiss Albino成纤维细胞作为宿主。
    1. 分化 T. cruzi 将上鞭毛体转化为循环型鞭毛体。使用血细胞计数板测定上鞭毛体培养物的细胞密度，并收集 5 x 107 细胞在2,100 x下离心15分钟 g. 弃去上清液，用10 mL RPMI培养基重悬细胞。将寄生虫在 28 °C 1 周28.
    2. 收集RPMI培养基中的后循环型上鞭毛体。轻轻倾斜培养瓶，用移液器吸取上清液，注意不要扰动附着在瓶底表面的寄生虫。将上清液转移至锥形管中，以2,100 x g离心15分钟。 g. 弃去上清液，用 5 mL DMEM（10% FCS）重悬寄生虫。
      注意： 寄生虫群体由混合的前鞭毛体、上鞭毛体及一些中间形态组成。尽管并非必需，但可通过DEAE离子交换层析法分离前鞭毛体。29或者，可通过将寄生虫与活性血清共同孵育，使其经历补体介导的裂解，从而清除上鞭毛体30.
    3. 将3T3-Swiss Albino成纤维细胞以60-70%汇合度接种，约1.7-2.0 x 10⁵个细胞接种于35 mm培养皿中，或按每平方厘米培养表面接种5,000至6,000个细胞的比例进行接种。6 在T-25培养瓶中加入5 mL DMEM（含10% FCS）的细胞。移除生长培养基，加入步骤1.3.2中制备的寄生虫混合液。于37 °C、5% CO₂条件下孵育24 h。2 在湿润的培养箱中孵育以建立感染。
    4. 通过用DMEM（10% FCS）洗涤共培养物两次，去除残留在宿主3T3细胞外的寄生虫。
    5. 当共培养物达到饱和时，通过胰蛋白酶消化传代感染无鞭毛体的宿主细胞。吸除培养基，并用 PBS 冲洗培养物一次。加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶溶液覆盖整个培养表面，在室温下孵育数分钟，直至贴壁的宿主细胞变松。用 3 mL DMEM（10% FCS）冲洗细胞，使细胞从培养瓶表面脱落。
    6. 将脱离的宿主细胞转移至锥形管中，300 x g 离心 3 分钟 g. 吸弃上清液，用3 mL新鲜DMEM（10% FCS）重悬细胞。此步骤有助于去除残留的上鞭毛体。将全部细胞转移至含9 mL DMEM（10% FCS）的洁净T-75培养瓶中。继续培养，直至培养上清液中释放出锥鞭毛体。
    7. 通过胰酶消化法每周传代两次以维持共培养。当70-80%的宿主细胞被感染后，需定期以5:1（带毒细胞:新鲜细胞）的比例添加未感染的宿主3T3细胞，以避免培养状态恶化。若宿主细胞与 T. cruzi 得到妥善维护。

2. 锥鞭毛体向EA的分化

  1. 实验前一天，移除宿主-寄生虫共培养物的生长培养基，并加入新鲜的DMEM（含10% FCS）以洗去此前数日内已从宿主细胞释放出的无鞭毛体（EA）和上鞭毛体（trypomastigotes）。常规实验至少需要两瓶T-75培养瓶的汇合共培养物。
  2. 将培养上清液收集至锥形管中，以收获新释放的上鞭毛体。在显微镜下（10倍或20倍物镜）检查样品质量。若存在宿主细胞碎片，可短暂离心样品，并将上清液转移至新管中。若存在大量无鞭毛体（EA），则需通过以下“游出法”分离上鞭毛体。
    1. 将上鞭毛体与无鞭毛体的混合物在2,100 × g条件下离心15分钟。弃去大部分上清液，管中保留0.5–1.0 mL培养基。
      注：减少体积为可选步骤，但可使后续操作更简便。
    2. 将沉淀物在37 °C孵育1–2小时，使活跃的上鞭毛体从沉淀中游出（图2）。
    3. 将含有上鞭毛体的上清液转移至1.5 mL微量离心管中。
  3. 将锥形管在2,100 × g条件下离心15分钟，以收集上鞭毛体。若此前已进行游出步骤，则将1.5 mL离心管在4,000 × g条件下离心2分钟，使上鞭毛体沉淀。弃去上清液。
  4. 用5 mL含20 mM MES（pH 5.0）缓冲的DMEM重悬沉淀，并添加0.4% BSA19。将寄生虫转移至T-25培养瓶中，瓶盖保持松动。细胞密度应约为或低于1 × 107 个细胞/mL，因过度饱和会增加细胞死亡风险。
    注：DMEM的颜色应为黄色，而非橙色。若原始DMEM缓冲能力较强，仅添加20 mM MES（pH 5.0）不足以降低pH值，此时需通过加入HCl调节培养基pH。酸性培养基可在4 °C保存，但不得超过1个月。
  5. 将培养瓶置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育。约24小时后，95%的寄生虫将分化为无鞭毛体。

3. EA 的电穿孔

  1. 为电穿孔准备gRNA。可通过体外转录制备，或直接从生产商购买合成RNA寡核苷酸。本报告中使用的是Integrated DNA Technologies, Inc.提供的crRNA和tracrRNA。
  2. 将EAs培养物在2,100 × g条件下离心15分钟，弃去上清液。
  3. 用含有配套补充液的电穿孔缓冲液重悬沉淀，调整细胞密度至最终浓度为1 × 108 个细胞/mL。
    注意：与材料表中所列电穿孔缓冲液相比，EM缓冲液会导致更高的细胞死亡率；因此不推荐用于无鞭毛体转染（补充图1）。
  4. 将100 µL重悬的寄生虫（1 × 107 个细胞）分装至1.5 mL微量离心管中，加入5–10 µg gRNA，并用移液器轻轻混匀。
  5. 将混合物转移至2 mm间隙的电穿孔比色皿中，使用电穿孔仪并选择X-14程序施加电脉冲。
  6. 将比色皿内容物转移至含有5 mL预热LIT培养基（含10% FCS）的T-25培养瓶中。瓶盖稍松，于37 °C、5% CO2条件下培养。
  7. 通过持续无细胞培养（第4节）或感染宿主细胞后作为胞内无鞭毛体（第5节）监测细胞生长情况。

4. 以无菌前鞭毛体形式监测基因敲除细胞的生长

  1. 虫体沉于培养基底部，因此需轻轻摇动培养瓶使其重新悬浮于溶液中。用移液器冲洗培养瓶内壁有助于使部分贴壁的细胞脱落。
  2. 取1 µL碘化丙啶（PI）溶液（20 µg/mL）与20 µL无鞭毛体培养物混合。
    注意：避免将培养瓶在孵箱外放置过久。温度是影响无鞭毛体体外增殖的因素之一22。
  3. 将样品滴加至血细胞计数板，在荧光显微镜下观察。PI可穿透受损细胞膜，但不能进入活细胞。计数未被PI染色的活无鞭毛体数量（激发/发射波长570 nm/602 nm）。

5. 监测基因敲除细胞作为细胞内无鞭毛体的生长情况

  1. 在12孔板中用DMEM（10% FCS）接种宿主3T3细胞。调整细胞密度至70–80%融合度，或每孔约3 × 105个细胞。
    注意：由于无鞭毛体不具运动性，使宿主细胞覆盖大部分生长表面可提高感染效率。
  2. 电穿孔后一天，通过离心收集步骤3.6中的基因敲除无鞭毛体。弃去上清液，用2 mL DMEM（10% FCS）重悬寄生虫。
  3. 移除宿主细胞培养基，加入重悬的无鞭毛体。感染复数应为20或更高。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育2天，使无鞭毛体建立感染。
    注意：感染时间可根据实验目的调整为1天。
  4. 用DMEM（10% FCS）洗涤两次，去除仍存在于宿主细胞外的无鞭毛体。
  5. 向宿主-寄生虫共培养体系中加入新鲜DMEM（10% FCS），继续在37 °C孵育额外2天。
  6. 为评估感染效率，对宿主细胞核及细胞内无鞭毛体进行荧光显微观察。
    注意：    在高密度共培养条件下，细胞核容易重叠。在固定和染色前将细胞以较低密度重新接种（例如1:5稀释），有助于更准确地计数细胞核。
    1. 移除培养基，加入1 mL含10%甲醛的PBS溶液固定细胞。室温孵育10分钟。
    2. 将甲醛溶液替换为含1 µg/mL Hoechst 33342和0.1% Triton X-100的1 mL PBS溶液。室温孵育5分钟。
    3. 移除Hoechst染色液，用PBS洗涤细胞一次。加入1 mL新鲜PBS。
  7. 在荧光显微镜下观察，识别与较小寄生虫核相关联的宿主细胞核（图4）。含有2个以上无鞭毛体的宿主细胞应被视为已感染，以排除非 productive 的初始感染或未洗去的胞外无鞭毛体。

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结果

通过游出法分离锥鞭毛体

为通过游离法从污染的老化上清液（EAs）中收获新鲜的锥鞭毛体，细胞沉淀需至少孵育1小时。将沉淀孵育超过2小时并不会显著增加溶液中游离的锥鞭毛体数量（图2B）。在本实验中，初始混合物中锥鞭毛体的比例为38%，而在游离操作后的任意时间点，其比例均超过98%。从两个T-75培养瓶的融合共培养物中，我们通常可通过此游离方案获得3-4 × 107个纯化的锥鞭毛体细胞。

无鞭毛体基因敲除株在无菌培养条件下的生长监测

与其他发育阶段的 T. cruzi 不同，无鞭毛的无鞭毛体几乎处于静止状态。因此，使用碘化丙啶（PI）染色有助于区分活的与死亡的无鞭毛体。PI 无法穿透完整的细胞膜，但可轻易进入死细胞（图 3A）。转染了针对必需基因

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讨论

我们证明了可以通过将gRNA直接电穿孔转入表达Cas9的EA细胞，利用无菌培养的T. cruzi无鞭毛体进行CRISPR/Cas9介导的基因敲除。该方法可在不经过其他发育阶段的情况下，特异性评估目标基因在无鞭毛体阶段的必需性。

无鞭毛体转染的另一个优势在于能够方便地对大量目的基因进行检测。一旦建立了表达Cas9的T. cruzi与宿主哺乳动物细胞的共培养体系，仅需数天即可将组织来源的上鞭毛体转化为早期无鞭毛体（EA），并转染gRNA以获得基因敲除的无鞭毛体。gRNA是唯一需要针对每个目的基因定制的材料，但合成gRNA可从多家厂商直接购买，获取十分便捷。另一种用于分析目的基因在特定阶段必需性的方法是构建可诱导的基因敲除系统32。该方法中，必须为每个目的基因构建质粒，并将其转染至前鞭毛体阶段的寄生虫中，以便通过药物筛选获得转染子，因为质粒的转染效率远低于gRNA（质粒的转染效率<15%26，而gRNA的转染效率>96%

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作部分由日本学术振兴会（JSPS）科研费资助，资助编号18K15141，授予Y.T.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20% 甲醛溶液FUJIFILM Wako Pure Chemical068-03863固定细胞
25 cm2 双密封盖培养瓶AGC Techno Glass3100-025
75 cm2 双密封盖培养瓶AGC Techno Glass3110-075
一体化荧光显微镜KeyenceBZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA（对照用）IDTcustom made靶序列 = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA（TcCGM1 用）IDTcustom made靶序列 = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA（TcPAR1 用）IDTcustom made靶序列 = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAIDT1072532与 crRNA 退火使用
Amaxa 核转染装置LONZAAAN-1001电穿孔
基础寄生虫核转染试剂盒 2LONZAVMI-1021电穿孔
BSASigma-AldrichA3294体外无鞭毛体转化培养基组分
Burker-Turk 一次性血细胞计数板Watson177-212C细胞计数
Corning 12 孔透明 TC 处理多孔板Corning3513
DMEMFUJIFILM Wako Pure Chemical044-29765培养基
定义型胎牛血清HycloneSH30070.03使用前需热灭活
G-418 硫酸溶液FUJIFILM Wako Pure Chemical077-06433转化子筛选
氯化血红素Sigma-AldrichH-5533LIT 培养基组分
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570细胞核染色
肝脏浸出肉汤，DifcoBecton Dickinson226920LIT 培养基组分
MESFUJIFILM Wako Pure Chemical349-01623体外无鞭毛体转化培养基组分
PBS (–)FUJIFILM Wako Pure Chemical166-23555
碘化丙啶Sigma-AldrichP4864-10ML死细胞染色
RPMI 1646Sigma-AldrichR8758前鞭毛体成熟转化培养基

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CRISPR Cas9 RNA
使用 CRISPR/Cas9 系统将基因敲除直接引入克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的无鞭毛体阶段
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