一种基于聚合酶链式反应的准确且稳健的检测方法，可用于定量脆性X智力低下基因-1（Fragile X mental retardation-1 gene）中的胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤（CGG）三核苷酸重复序列，有助于以更短的周转时间和更低的设备投入，实现对脆性X综合征及相关脆性X障碍的分子诊断和筛查。
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方法文章
一种基于聚合酶链式反应的稳定检测方法，用于定量脆性X智力低下-1基因中的胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤三核苷酸重复序列
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
脆性X综合征（FXS）及相关疾病是由脆性X智力低下基因-1（FMR1）启动子区5’非翻译区（UTR）中胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤（CGG）三核苷酸重复序列扩增所致。传统上，采用遗传分析仪进行毛细管电泳片段分析来测定FMR1基因CGG重复数，但当重复数超过200时，需额外进行Southern印迹分析以获得精确测量结果。本文介绍一种准确且可靠的基于聚合酶链式反应（PCR）的方法，用于定量FMR1基因的CGG重复序列。该检测的第一步是使用脆性X PCR试剂盒对FMR1启动子5’UTR中的重复序列进行PCR扩增，随后对PCR产物进行纯化，并在微流控毛细管电泳仪器上进行片段大小分析，再通过分析软件比对已知重复数的标准品，确定CGG重复次数。该基于PCR的检测方法具有良好的重复性，能够识别FMR1启动子全部范围的CGG重复数，包括重复数超过200（归类为完全突变）、55至200（前突变）、46至54（中间型）以及10至45（正常型）。该方法成本效益高，具有良好的稳健性且报告速度快，有助于对FXS及脆性X相关疾病进行分类诊断。
引言
脆性X综合征（FXS）以及脆性X相关疾病，例如震颤共济失调综合征（FX-TAS）和原发性卵巢功能不全（FX-POI），主要由位于Xq27.3的脆性X智力低下-1（FMR1）基因5’非翻译区（UTR）中的胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤（CGG）三核苷酸重复序列扩增所致1,2。FMR1基因编码的蛋白质（FMRP）是一种与多聚核糖体结合的RNA结合蛋白，通过调控mRNA的可变剪接、稳定性及树突运输，或调节部分突触后蛋白的合成，在神经元发育和突触可塑性中发挥功能3,4,5,6,7。
CGG重复长度的动态变化 >200 被定义为完全突变，可导致异常的高甲基化，进而引发转录沉默 FMR1 启动子8FMRP蛋白的缺失或缺乏会破坏正常的神经元发育，从而导致脆性X综合征（FXS）9，其特征为多种临床症状，包括....
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方案
伦理批准由香港中文大学—新界东联合临床研究伦理委员会授予（参考编号：2013.055）
1. PCR 扩增
- 开始前，从 -20 °C 冰箱中取出 PCR 缓冲液混合物、样本稀释液以及 DNA 样本（包括测试和参考 DNA）（参见材料表），在室温下放置 20–30 分钟，确保所有试剂和 DNA 完全解冻。使用前充分涡旋振荡并短暂离心。
- 使用分光光度计测定 DNA 样本的浓度（参见材料表）。DNA 浓度应为 25 ng/µL；如需要，用样本稀释液稀释至适当浓度。
注意：DNA 应经过提取和纯化，以去除可能干扰的物质，如蛋白质和高浓度盐。后续 PCR 扩增与分析应使用未降解的高质量 DNA（A260/A280：1.8–2.0，A260/A230：>1.0）。 - 标记 PCR 板的孔位或 0.2 mL PCR 管，以区分参考样本和待测 DNA 样本。
- 计算测试样本、2 个参考样本及阴性对照样本所需的 PCR 反应数。每反应加入 15 µL PCR 缓冲液混合物、2.6 µL 样本稀释液和 0.4 µL 聚合酶，配制 PCR 主混合液。
注意：使用样本稀释液作为阴性对照对于监测 PCR 性能至关重要。PCR 主混合液应在室温下配制，切勿....
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结果
前突变女性参考样本（NA20240，重复次数分别为30和80）和全突变女性参考样本（NA20239，重复次数分别为20和200）的片段大小分析结果分别如图1A和图1B所示。通常，片段大小图谱中包含两个标记峰（下标记为50碱基对[bp]，上标记为10,380 bp）。通常还会出现一个大小接近95 bp的引物复合物峰。通过该参考样本，可构建包含四个数据点的线性回归标准曲线，如图1C所示。
临床正常、中间型、前突变和全突变样本的代表性片段大小特征如图2A–D所示。特别是，嵌合型全突变样本在微流控电泳图谱中呈现两个扩增片段峰和一个正常峰，如图2E所示。在部分女性样本中，微流控电泳结果仅显示一个峰，如图2F
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讨论
脆性X综合征（FXS）是继21三体综合征之后智力障碍的第二大常见原因，占X连锁智力障碍病例的近一半30，其发病率约为每4,000名男性中有1例，每8,000名女性中有1例。更重要的是，大约每250至1,000名女性中就有1人为前突变携带者，而在男性中的携带频率约为每250至1,600人中有1例26,31,32,33。由于前突变等位基因在遗传给后代时，CGG重复序列扩增为全突变的风险显著升高，例如，当母源重复数为55–59时，扩增风险为4%，而当重复数达到100–200时，风险则升至98%14，因此，在更广泛的范围内测定CGG重复数有助于脆性X综合征的诊断以及对前突变携带者的筛查，从而支持其生育规划。本文介绍的基于PCR的方法可准确、快速且稳健地扩增FMR1基因启动子区5’.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金应急管理项目（项目编号：81741004）、国家自然科学基金（项目编号：81860272）、广西壮族自治区科技计划重大项目（项目编号：AB16380219）、中国博士后科学基金（项目编号：2018M630993）以及广西自然科学基金（项目编号：2018GXNSFAA281067）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：0.2 mL PCR 管 | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：1x TE 缓冲液，pH 8.0，RNase-free | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：2100 Bioanalyzer 仪器 | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：96 孔 PCR 板 | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：电极盒 | Agilent | 提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：IKA 涡旋混合器 | Agilent | 提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：Sizing 软件 2100 Expert 软件 | Agilent | 提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：检测芯片 | Agilent | 提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备 | |
| Agilent DNA 7500 试剂盒 | Agilent | 5067-1506 | 用于片段大小分析 |
| Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 7500 Ladder（黄色盖） | Agilent | 包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506） | |
| Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 7500 标记物（绿色盖） | Agilent | 包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506） | |
| Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 芯片 | Agilent | 包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506） | |
| Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 染料浓缩液（蓝色盖） | Agilent | 包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506） | |
| Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 凝胶基质小瓶（红色盖） | Agilent | 包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506） | |
| Agilent DNA 7500 试剂盒：电极清洁剂 | Agilent | 包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506） | |
| Agilent DNA 7500 试剂盒：离心过滤柱 | Agilent | Agilent DNA 7500 试剂盒的耗材（目录号：5067-1506） | |
| Agilent DNA 7500 试剂盒：注射器 | Agilent | Agilent DNA 7500 试剂盒的耗材（目录号：5067-1506） | |
| 芯片预处理站 | Agilent | 5065-4401 | 提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备 |
| Cubee 小型离心机 | GeneReach | aqbd-i | |
| 滤板真空装置：MultiScreenHTS 真空装置 | Merck Millipore | MSVMHTS00 | 用于 PCR 产物纯化的滤板真空装置 |
| 滤板真空装置：硅胶塞 | Merck Millipore | XX2004718 | 滤板真空装置 |
| 滤板真空装置：真空泵 | Merck Millipore | WP6122050 | 滤板真空装置 |
| 滤板真空装置：废液收集瓶 | Merck Millipore | XX1004705 | 滤板真空装置 |
| FragilEase Fragile X PCR 试剂盒 | PerkinElmer | 3101-0010 | 用于 PCR 扩增 |
参考文献
- Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
- Fu, Y. H., et al.
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重印与许可
