方法文章

一种基于强健聚合酶链反应的测定法，用于定量易碎 X 智力迟钝-1 基因中的细胞氨酸-鸟-鸟-鸟- 三核苷酸重复

DOI：

10.3791/59963

⸱

2019年9月16日

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1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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精确和强大的聚合酶链反应测定，用于量化易碎 X 智力迟钝-1 基因中细胞氨酸-瓜氨酸-鸟-鸟三核苷酸重复，有助于分子诊断和筛选易碎 X 综合征和易碎 X 相关周转时间较短，设备投资时间缩短。

摘要

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易碎 X 综合征 （FXS） 和相关疾病是由易碎 X 智力迟钝-1（FMR1）基因启动子的 5' 未翻译区域 （UTR） 中细胞氨酸-瓜氨酸 -鸟-鸟苷 （CGG） 三核苷酸重复的扩展引起的。按照惯例，基因分析仪上的毛细血管电泳片段分析用于FMR1的CGG重复大小，但当重复数高于200时，需要额外的南方印斑分析才能进行精确测量。在这里，我们提出了一种准确和强大的聚合酶链反应（PCR）为基础的方法，用于定量FMR1的CGG重复。本测试的第一步是使用易碎 X PCR 试剂盒对FMR1启动子的 5'UTR 中的重复序列进行 PCR 扩增，然后对 PCR 产品进行纯化和微流体毛细管电泳仪器上的片段大小，以及随后通过使用分析软件引用已知重复项的标准来解释 CGG 重复次数。这种基于PCR的测定是可重复的，能够识别FMR1启动子的全部CGG重复，包括重复数超过200（分类为完全突变）、55至200（预突变）、46至54（中间）和10至45（正常）。它是一种经济高效的方法，有助于对 FXS 和易碎 X 相关疾病进行分类，具有鲁棒性和快速报告时间。

引言

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易碎 X 综合征 （FXS） 和易碎 X 相关疾病，例如震颤和失流综合征 （FX-TAS），以及原发性卵巢功能不全 （FX-POI） 主要是由 5' 未翻译的细胞氨酸-瓜氨酸 -瓜氨酸 （CGG） 三核苷酸重复扩张引起的Xq27.31，2. 脆弱 X 智力迟钝 -1（FMR1）基因的区域 （UTR）FMR1编码蛋白（FMRP）是一种多核体相关的RNA结合蛋白，通过调节mRNA的替代拼接、稳定性和树突状传输或调制合成，在神经元发育和突触可塑性方面发挥作用部分贴午后蛋白3，4，5，6，7。

CGG重复大小为>200的动态变异被描述为完全突变，导致FMR1启动子8的异常超甲基化和随后转录沉默。由此产生的FMRP蛋白的缺失或缺乏会破坏正常的神经元发育，并导致FXS9，其特征是各种临床症状，包括中度至....

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方案

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香港中文大学-新界东集群临床研究伦理委员会获伦理批准（参考编号:2013.055）

1. PCR扩增

  1. 开始之前，从-20°C冷冻室中取出PCR缓冲液混合物、样品稀释剂和DNA样品（包括测试和参考DNA）（参见材料表），并将其保持在室温下20-30分钟，以确保所有试剂和DNA完全解冻。涡旋，并在使用前短暂旋转。
  2. 使用分光光度计测量DNA样品的浓度（见材料表）。DNA浓度应为25纳克/μL;必要时用样品稀释至适当的浓度稀释。
    注:应提取和纯化DNA以去除干扰物质，如蛋白质和高盐浓度。非降解、高质量的DNA应用于后续PCR扩增和分析（A260/A280:1.8_2.0和A260/A230:>1.0）。
  3. 标记 PCR 板或 0.2 mL PCR 管的孔，以识别参考和测试的 DNA 样本。
  4. 计算测试样品、2 个参考样品和阴性对照样本所需的 PCR 反应数。通过加入15μL的PCR缓冲液混合物、2.6 μL的样品稀释剂和0.4μL的聚合酶，制备PCR主混合物。
    注:使用样品稀释剂的负对照对于监测PCR性能至关重要。在室温下准备 PCR 主混合物，不要在冰上移液器。PCR 缓冲液混合体是粘性的。混合管子，然后在使用前短暂旋转。
  5. 从步骤 1.4 涡....

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结果

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预突变母参考样本（NA20240，重复尺寸30和80）和全突变母参考样本（NA20239，重复尺寸为20和200）的大小调整结果分别如图1A和图1B所示。通常，片段大小配置文件中包括两个标记峰（下标记 50 基对 [bp] 和上标记 10，380 bp）。通常有一个底漆复合峰，其大小接近 95 bp。通过参考样本，可以构造一个包含四个点的线性回归标准曲线，如图1C所示。

临床正常、中间、预突变和完全突变样本的代表性大小特征如图2A+D所示。特别是，具有两个展开片段峰和一个正常峰的马赛克全突变在图2E中呈现。在某些女性情况下，微流体电泳结果中只显示一个峰值，如图2F所示。这可以解释正常同源性等位子.......

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讨论

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FXS是仅次于三联体21的第二大智力障碍原因，占X相关智力迟钝30的近一半，这可能影响大约四千名男性中的一个和八千名女性中的一个。更重要的是，近1在250-1，000女性携带预突变，这个频率是1在250-1，600男性26，31，32，33。由于 CGG 重复扩张到完全突变的风险在将预突变等位基因传输到后代时显著上升，例如，当母体重复大小为 55-59 时的 4% 到 98%， 当大小为 100–20014时，CGG 的确定在更广泛的范围内重复大小可以促进FXS的诊断和预突变携带者的生殖规划的筛查。此处介绍的基于 PCR 的方法准确、快速、可靠，可放大FMR1启动器 5'UTR 中的重复序列，并量化微流体毛细管电泳仪器上 CGG 重复数的全谱，从而可以以更少的周转时间和设.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项研究得到了国家自然科学基金应急管理项目（第81741004号赠款）、国家自然科学基金（第81860272号）、广西省科技基金重大研究计划（第81741004号）的资助。授予号AB16380219），中国博士后科学基金资助（批号2018M630993）和广西自然科学基金（批号2018GXNSFAA281067）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Agilent 2100 生物分析仪：0.2 mL PCR 管AxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 生物分析仪：1x TE 缓冲液，pH 值 8.0，不含Rnase 的 AmbionAM9849
Agilent 2100 生物分析仪：2100 生物分析仪AgilentG2939AA
Agilent 2100 生物分析仪：96 孔 PCR 板Thermo FisherAB0800
Agilent 2100 生物分析仪仪器：电极柱Agilent供应 2100 生物分析仪设备
Agilent 2100 生物分析仪仪器：IKA 涡旋混合器Agilent供应 2100 生物分析仪设备
Agilent 2100 生物分析仪仪器：尺寸分析软件 2100 Expert 软件Agilent2100 生物分析仪的备件设备
安捷伦 2100 生物分析仪仪器：测试芯片安捷伦2100 生物分析仪设备的
安捷伦 DNA 7500 试剂盒安捷5067-1506用于片段大小的
捷伦 DNA 7500 试剂盒：DNA 7500 分子量标准（黄色盖子）安捷伦试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒：DNA 7500 标记物（绿色帽）安捷伦试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒：DNA 芯片安捷试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒：DNA 染料浓缩物（蓝色帽）安捷伦试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒：DNA 凝胶基质样品瓶（红帽）安捷伦试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒：电极清洁剂安捷伦试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
捷伦 DNA 7500 试剂盒：安DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）捷伦
芯片引物站安捷伦5065-44012100 生物分析仪设备
立方体微型离心机GeneReachAQBD-i
滤板真空歧管：MultiScreenHTS 真空歧管Merck MilliporeMSVMHTS00用于过滤板真空的真空仪器 用于PCR产品净化的歧管
滤板真空歧管： 硅胶塞Merck MilliporeXX2004718滤板真空 歧管
滤板真空： 真空泵Merck MilliporeWP6122050滤板真空 歧管
滤板真空： 废物收集容器Merck MilliporeXX1004705真空过滤板 多装置
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010用于 PCR 扩增
备件 伦 安伦安捷伦 安捷伦 DNA 7500 试剂盒的离心过滤器安捷伦备件：的注射器安备件

参考文献

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  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al.

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