方法文章

一种基于强健聚合酶链反应的测定法，用于定量易碎 X 智力迟钝-1 基因中的细胞氨酸-鸟-鸟-鸟- 三核苷酸重复

DOI：

10.3791/59963

⸱

2019年9月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

精确和强大的聚合酶链反应测定，用于量化易碎 X 智力迟钝-1 基因中细胞氨酸-瓜氨酸-鸟-鸟三核苷酸重复，有助于分子诊断和筛选易碎 X 综合征和易碎 X 相关周转时间较短，设备投资时间缩短。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

易碎 X 综合征 （FXS） 和相关疾病是由易碎 X 智力迟钝-1（FMR1）基因启动子的 5' 未翻译区域 （UTR） 中细胞氨酸-瓜氨酸 -鸟-鸟苷 （CGG） 三核苷酸重复的扩展引起的。按照惯例，基因分析仪上的毛细血管电泳片段分析用于FMR1的CGG重复大小，但当重复数高于200时，需要额外的南方印斑分析才能进行精确测量。在这里，我们提出了一种准确和强大的聚合酶链反应（PCR）为基础的方法，用于定量FMR1的CGG重复。本测试的第一步是使用易碎 X PCR 试剂盒对FMR1启动子的 5'UTR 中的重复序列进行 PCR 扩增，然后对 PCR 产品进行纯化和微流体毛细管电泳仪器上的片段大小，以及随后通过使用分析软件引用已知重复项的标准来解释 CGG 重复次数。这种基于PCR的测定是可重复的，能够识别FMR1启动子的全部CGG重复，包括重复数超过200（分类为完全突变）、55至200（预突变）、46至54（中间）和10至45（正常）。它是一种经济高效的方法，有助于对 FXS 和易碎 X 相关疾病进行分类，具有鲁棒性和快速报告时间。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

易碎 X 综合征 （FXS） 和易碎 X 相关疾病，例如震颤和失流综合征 （FX-TAS），以及原发性卵巢功能不全 （FX-POI） 主要是由 5' 未翻译的细胞氨酸-瓜氨酸 -瓜氨酸 （CGG） 三核苷酸重复扩张引起的Xq27.31，2. 脆弱 X 智力迟钝 -1（FMR1）基因的区域 （UTR）FMR1编码蛋白（FMRP）是一种多核体相关的RNA结合蛋白，通过调节mRNA的替代拼接、稳定性和树突状传输或调制合成，在神经元发育和突触可塑性方面发挥作用部分贴午后蛋白3，4，5，6，7。

CGG重复大小为>200的动态变异被描述为完全突变，导致FMR1启动子8的异常超甲基化和随后转录沉默。由此产生的FMRP蛋白的缺失或缺乏会破坏正常的神经元发育，并导致FXS9，其特征是各种临床症状，包括中度至重度智力残疾、发育迟缓、过度活跃行为、不良接触和孤独症表现10，11，12。女性FXS患者的表达通常比男性温和。CGG 重复大小从 55 到 200 和 45 到 54 分别归类为预突变和中间状态。由于高度不稳定，CGG重复大小在预突变或中间等位基因大概扩大时，从父母传给后代13，14。因此，具有预突变等位基因的携带者由于重复扩张而使儿童受FXS影响的风险很高，在某些情况下，中间等位基因可以将其重复大小扩展到两代15之间的全部突变范围。 16.此外，预变异的男性也增加患晚发病FX-TAS17、18、19的风险，而预突变女性则倾向于FX-TAS和FX-POI20， 21，22.最近，有报道称，患有发育迟缓和社会行为问题的自闭症谱系障碍在预突变FMR1等位基因23、24的儿童中出现。

确定确切的CGG重复大小对于FXS和易碎X相关疾病的分类和预测具有重要意义25，26。从历史上看，CGG重复区域特异性聚合酶链反应（PCR）具有片段大小加上南方斑点分析，是FMR1 CGG重复27分子分析的黄金标准。然而，传统的特异性PCR对超过100至130次重复的大型预突变不太敏感，并且无法扩增完全突变27，28。此外，用于重复尺寸的传统基因分析仪上的毛细血管电泳无法检测超过 200 CGG 重复的FMR1 PCR 产品。南方印斑分析能够区分更广泛的重复大小，从正常突变到完全突变重复数，并已广泛用于确认完全突变（在男性）和区分异质异位基因与完全突变明显具有正常重复大小的同源性等位子（在女性中）。但是，量化重复的分辨率是有限的。更重要的是，这种分步测试策略是劳动密集型、耗时且成本效益高的。

在这里，我们提出了一种准确和可靠的基于PCR的方法，用于定量FMR1的CGG重复。本测试的第一步是使用易碎 X PCR 试剂盒对FMR1启动器的 5'UTR 中的重复序列进行 PCR 扩增。PCR 产品经过纯化，片段大小在微流体毛细管电泳仪器上执行，随后使用分析软件对 CGG 重复次数进行解释，通过引用基于PCR 片段长度与 CGG 重复次数成正比。PCR系统包括促进高GC富分子三核苷酸重复区域扩增的试剂。这种基于PCR的测定是可重复的，能够识别FMR1启动子的所有CGG重复范围。这是一种经济高效的方法，可在FXS和易碎X相关疾病的分子诊断和筛查中得到广泛应用，周转时间少，设备投资更少，因此可用于更广泛的临床实验室。

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方案

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香港中文大学-新界东集群临床研究伦理委员会获伦理批准（参考编号:2013.055）

1. PCR扩增

  1. 开始之前，从-20°C冷冻室中取出PCR缓冲液混合物、样品稀释剂和DNA样品（包括测试和参考DNA）（参见材料表），并将其保持在室温下20-30分钟，以确保所有试剂和DNA完全解冻。涡旋，并在使用前短暂旋转。
  2. 使用分光光度计测量DNA样品的浓度（见材料表）。DNA浓度应为25纳克/μL;必要时用样品稀释至适当的浓度稀释。
    注:应提取和纯化DNA以去除干扰物质，如蛋白质和高盐浓度。非降解、高质量的DNA应用于后续PCR扩增和分析（A260/A280:1.8_2.0和A260/A230:>1.0）。
  3. 标记 PCR 板或 0.2 mL PCR 管的孔，以识别参考和测试的 DNA 样本。
  4. 计算测试样品、2 个参考样品和阴性对照样本所需的 PCR 反应数。通过加入15μL的PCR缓冲液混合物、2.6 μL的样品稀释剂和0.4μL的聚合酶，制备PCR主混合物。
    注:使用样品稀释剂的负对照对于监测PCR性能至关重要。在室温下准备 PCR 主混合物，不要在冰上移液器。PCR 缓冲液混合体是粘性的。混合管子，然后在使用前短暂旋转。
  5. 从步骤 1.4 涡旋 PCR 主组合 10-20 s 并旋转。缓慢地将18μL的混合物分配到每个井或管中。
  6. 漩涡和旋转下来的DNA样本。将每个DNA的移液器2μL放入适当的井或管中，最终PCR体积为20μL。通过上下移液5次混合。
    注:每次反应的DNA总量应为50~100纳克。每20μLPCR反应的DNA量大于150纳克，可能导致大重复等位子的扩增不良。对于低浓度DNA，PCR主混合物中的样品稀释剂量可以由DNA溶液取代。
  7. 用粘合板密封器或管盖密封板。
  8. 将密封的 PCR 板或管放入带加热盖的热循环器中。使用以下设置运行程序:95 °C 5 分钟，随后在 98°C 下进行 25 次变性，35 秒，在 59°C 退火 35 秒，在 72°C 下延长 4 分钟;在 72°C 下的最后一步 10 分钟，将 PCR 产品保持在循环器中的 4°C，直到拆卸以进行进一步处理。
  9. PCR扩增后，立即纯化和分析产品，或储存在+2至+8°C过夜。或者，产品可在-30至-16°C下储存长达30天。

2. PCR产品的净化

  1. 将培养箱摇床预热至 65°C。
  2. 对于每个PCR反应，从第1节向每个PCR产物的20μL中加入80μL的1x TE缓冲液（见材料表）。
  3. 使用多通道移液器将样品混合物转移到 PCR 清理板（参见材料表）。
  4. 保持板未覆盖，并将其放入孵化器摇床，并在 65°C 孵育，同时在 1，200 rpm 下摇动 10 分钟。
  5. 孵育后，将真空仪器设置为250 mbar（或 25 kPa，188 mmHg，7.4 英寸汞柱），并通过过滤器吸入溶液 15 分钟。Wells 应没有液体残留。
  6. 将培养箱摇床冷却至 25°C。
  7. 第一次吸气后，关闭真空，向每个井添加 50 μL 的 1x TE 缓冲液。不要混合。使用步骤 2.5 中的真空设置将溶液吸出 10 分钟。
  8. 将滤板底部牢固地压在一叠纸巾上，擦干滤板底部。
  9. 将 20 μL 的 1x TE 缓冲液添加到每个井的底部中心。将板放在培养箱摇床中，在 25°C 下孵育，同时以 1，200 rpm 摇动 5 分钟。
  10. 孵育后，将每个纯化PCRDNA的>15 μL从步骤2.9转移到新鲜的96孔PCR板。纯化的DNA可以直接分析，或者可以储存在-30至-16°C，直到需要。

3. PCR 产品的碎片大小

  1. 开始之前，允许DNA染料浓缩物、DNA凝胶基质、DNA标记、DNA阶梯和纯化DNA样本从步骤2到平衡到室温30分钟。
  2. 设置注油站。
    1. 使用新一批试剂时，更换注射器（见材料表）。
    2. 调整底板，松开注射器夹的操纵杆并将其滑到顶部位置。
  3. 启动尺寸调整软件（参见材料表），并准备凝胶-染料混合物。
  4. 涡流染料浓缩10s，然后向下旋转。将25μL的染料加入凝胶基瓶。涡旋混合溶液良好，并旋转下来。
    1. 将凝胶染料混合物转移到旋转过滤器。将旋转过滤器置于微型离心机中，在室温下以 1，500 x g ± 20% 旋转 10 分钟。
      注:用染料保护溶液免受光，使用后储存在4°C。凝胶-染料混合物可用于约15个芯片一旦准备。在使用前，让凝胶染料混合物每次与室温平衡30分钟。
  5. 加载凝胶-染料混合物。
    1. 在注油站上插入一个新的DNA芯片。将 9 μL 的凝胶染料混合物加入标有"G"的井中。请确保柱塞位于 1 mL 标记处，然后关闭注油站。
    2. 向下按注射器柱塞，直到夹子按住它。等待正好 30 s，然后释放剪辑。等待 5 s，然后缓慢地将柱塞拉回 1 mL 位置。
    3. 打开注油站，将 9 μL 的凝胶染料混合物加入标有"G"的井中。
  6. 在标有梯形符号的井中添加 5 μL 标记，并在 12 个样品井中每口加 5 μL 标记。不要将任何水井留空。
  7. 将 1 μL 的 DNA 梯子添加到标有梯形符号的井中。从步骤 3.1 或 1 μL 的超纯水（未使用的井）中加入 1 μL PCR 产品（使用井）到 12 个样品井中。将芯片水平放入涡旋混合器适配器和涡流适配器中 1 分钟，在指示设置（2，400 rpm） 下。
  8. 将芯片插入生物分析仪仪器，并在 5 分钟内将芯片运行到仪器中。
  9. 测定完成后，立即从仪器中取出用过的芯片。
  10. 缓慢地将 350 μL 的去离子水加入电极清洁剂的一口井中。打开生物分析仪的盖子，将电极清洁剂放入其中。合上盖子并孵育约10s。打开盖子并取出电极清洁剂。再等 10 s，让电极上的水蒸发，然后合上盖子。

4. 分析片段大小调整结果

注:参考样品应由同一批次中的同一热循环器和生物分析仪与未知样品进行放大和分析。

  1. 生物分析器运行完成后，将每次运行的峰值数据导出为 .csv 表文件，以便进行后续分析。
  2. 启动分析软件，从步骤 4.1 打开导出的 .csv 峰值表文件。
  3. 通过QC菜单选项卡，查看两个参考样本中拟合到四个点（图上显示为蓝色钻石）的回归线。回归线的 R2值应为 >0.98（典型值超过 0.999）。
  4. 通过"结果"菜单选项卡，检查每个样本的重复大小，其片段长度根据从参考样本派生的线性回归标准曲线自动绘制。该软件还根据不同的准则提供每个样品的分类。
  5. 通过"导出"菜单选项卡，导出每个样本的结果报告，其中带有重复编号和诊断分类，以及每次运行的示例信息和 QC 报告摘要。
    注:分析软件允许使用自定义分类指南，如美国医学遗传学学院 （ACMG） 或临床分子遗传学协会/欧洲人类遗传学协会 （CMGS/ESHG） 指南，以及预定义的分类标准。

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结果

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预突变母参考样本（NA20240，重复尺寸30和80）和全突变母参考样本（NA20239，重复尺寸为20和200）的大小调整结果分别如图1A和图1B所示。通常，片段大小配置文件中包括两个标记峰（下标记 50 基对 [bp] 和上标记 10，380 bp）。通常有一个底漆复合峰，其大小接近 95 bp。通过参考样本，可以构造一个包含四个点的线性回归标准曲线，如图1C所示。

临床正常、中间、预突变和完全突变样本的代表性大小特征如图2A+D所示。特别是，具有两个展开片段峰和一个正常峰的马赛克全突变在图2E中呈现。在某些女性情况下，微流体电泳结果中只显示一个峰值，如图2F所示。这可以解释正常同源性等位子...

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讨论

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FXS是仅次于三联体21的第二大智力障碍原因，占X相关智力迟钝30的近一半，这可能影响大约四千名男性中的一个和八千名女性中的一个。更重要的是，近1在250-1，000女性携带预突变，这个频率是1在250-1，600男性26，31，32，33。由于 CGG 重复扩张到完全突变的风险在将预突变等位基因传输到后代时显著上升，例如，当母体重复大小为 55-59 时的 4% 到 98%， 当大小为 100–20014时，CGG 的确定在更广泛的范围内重复大小可以促进FXS的诊断和预突变携带者的生殖规划的筛查。此处介绍的基于 PCR 的方法准确、快速、可靠，可放大FMR1启动器 5'UTR 中的重复序列，并量化微流体毛细管电泳仪器上 CGG 重复数的全谱，从而可以以更少的周转时间和设...

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究得到了国家自然科学基金应急管理项目（第81741004号赠款）、国家自然科学基金（第81860272号）、广西省科技基金重大研究计划（第81741004号）的资助。授予号AB16380219），中国博士后科学基金资助（批号2018M630993）和广西自然科学基金（批号2018GXNSFAA281067）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Agilent 2100 生物分析仪：0.2 mL PCR 管AxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 生物分析仪：1x TE 缓冲液，pH 值 8.0，不含Rnase 的 AmbionAM9849
Agilent 2100 生物分析仪：2100 生物分析仪AgilentG2939AA
Agilent 2100 生物分析仪：96 孔 PCR 板Thermo FisherAB0800
Agilent 2100 生物分析仪仪器：电极柱Agilent供应 2100 生物分析仪设备
Agilent 2100 生物分析仪仪器：IKA 涡旋混合器Agilent供应 2100 生物分析仪设备
Agilent 2100 生物分析仪仪器：尺寸分析软件 2100 Expert 软件Agilent2100 生物分析仪的备件设备
安捷伦 2100 生物分析仪仪器：测试芯片安捷伦2100 生物分析仪设备的
安捷伦 DNA 7500 试剂盒安捷5067-1506用于片段大小的
捷伦 DNA 7500 试剂盒：DNA 7500 分子量标准（黄色盖子）安捷伦试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒：DNA 7500 标记物（绿色帽）安捷伦试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒：DNA 芯片安捷试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒：DNA 染料浓缩物（蓝色帽）安捷伦试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒：DNA 凝胶基质样品瓶（红帽）安捷伦试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒：电极清洁剂安捷伦试剂盒：安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
捷伦 DNA 7500 试剂盒：安DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）
安捷伦 DNA 7500 试剂盒（目录号：5067-1506）捷伦
芯片引物站安捷伦5065-44012100 生物分析仪设备
立方体微型离心机GeneReachAQBD-i
滤板真空歧管：MultiScreenHTS 真空歧管Merck MilliporeMSVMHTS00用于过滤板真空的真空仪器 用于PCR产品净化的歧管
滤板真空歧管： 硅胶塞Merck MilliporeXX2004718滤板真空 歧管
滤板真空： 真空泵Merck MilliporeWP6122050滤板真空 歧管
滤板真空： 废物收集容器Merck MilliporeXX1004705真空过滤板 多装置
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010用于 PCR 扩增
备件 伦 安伦安捷伦 安捷伦 DNA 7500 试剂盒的离心过滤器安捷伦备件：的注射器安备件

参考文献

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