复杂的人类疾病在传统的实验室模型系统中可能难以模拟。本文介绍了一种外科手术方法，通过将人类骨骼肌活检组织移植到免疫缺陷小鼠体内来模拟人类肌肉疾病。
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本文内容
摘要
摘要
在动物研究中观察到的治疗效果常常无法在临床试验中得到重现。尽管这一问题具有多方面的原因，但其中一个原因是使用了不充分的实验室模型。在传统实验生物中模拟复杂的人类疾病具有挑战性，而通过研究人源异种移植组织可以规避这一问题。本文所述的手术方法可用于构建人源骨骼肌异种移植模型，进而用于肌肉疾病建模及临床前治疗试验。根据经机构审查委员会（IRB）批准的方案，从患者体内获取骨骼肌组织样本，并将其移植至NOD-Rag1null IL2rγnull（NRG）宿主小鼠体内。由于这类小鼠无法产生成熟的淋巴细胞，因而不能启动细胞介导和体液性的适应性免疫反应，是移植研究的理想宿主。通过异氟烷对宿主小鼠进行麻醉后，切除小鼠的胫骨前肌和趾长伸肌。随后将一块人源肌肉组织植入空置的胫骨肌腔室中，并缝合固定于腓骨长肌的近端和远端肌腱。移植后的人源肌肉可自发地由小鼠宿主实现血管化和神经支配，最终形成结构良好、再生充分的人类肌肉组织，可作为临床前研究的有效模型。
引言
据报道，所有进入临床试验的药物研发项目中，仅有13.8%最终成功并获得批准用于治疗1。尽管这一成功率高于此前报告的10.4%2，但仍存在显著的提升空间。提高临床试验成功率的一种方法是改进临床前研究中所使用的实验室模型。美国食品药品监督管理局（FDA）要求在开展一期临床试验之前，必须通过动物研究证明治疗的有效性并评估其毒性。然而，动物研究结果与临床试验结果之间往往存在有限的一致性3。此外，对于缺乏公认动物模型的疾病（如许多罕见病或散发性疾病），开展临床前动物研究的需求可能成为治疗开发中无法逾越的障碍。
模拟人类疾病的一种方法是将人类组织移植到免疫缺陷小鼠体内以建立异种移植模型。异种移植模型具有三个关键优势：第一，它们能够重现人类疾病中存在的复杂遗传和表观遗传异常，而这些异常在其他动物模型中可能永远无法复制；第二，只要有患者样本，异种移植模型可用于研究罕见或散发性疾病；第三，异种移植在完整的活体系统内模拟疾病。基于这些原因，我们假设异种移植模型中的治疗有效性结果更有可能转化为患者临床试验的结果。人类肿瘤异种移植模型已成功用于开发常见癌症的治疗方法，包括多发性骨髓瘤，以及为个别患者定制的个体化治疗方案4,5,
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方案
所有涉及人类受试者研究样本的使用均经约翰斯·霍普金斯大学机构审查委员会（IRB）批准，以保护参与者的权利与福利。所有动物实验均经约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》的要求。采用雄性 NOD-Rag1null IL2rγnull（NRG）宿主小鼠（8–12 周龄）进行异种移植实验。这些小鼠饲养于通风笼架中，提供经高效过滤器（HEPA）过滤、调温调湿的空气，以及经反渗透处理的高氯化水。小鼠可自由获取水和辐照抗生素饮食（材料表），饲养设施的光照周期由中央定时器控制，为 14 小时光照、10 小时黑暗。
1. 仪器准备
- 获取 8–12 周龄的 NOD-Rag1null IL2r γnull（NRG）小鼠。
- 对以下手术器械进行高压灭菌：剪刀、镊子、持针器、外科缝合器（材料表）、伤口夹、手术擦拭巾（材料表）以及烧杯（图 1A）。
- 配制 50 mL 肌肉组....
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结果
如 Yuanfan Zhang 等人所展示的，该手术方案是一种制备人骨骼肌异种移植组织的简便方法8。再生的异种移植组织可自发实现神经支配，并表现出功能性收缩能力。此外，来自面肩肱型肌营养不良症（FSHD）患者的肌肉异种移植能够重现FSHD患者中观察到的基因表达变化8。
根据我们的经验，约每8例对照组患者样本进行的异种移植中，有7例可显示出成功的肌肉植入。成功的异种移植表现为人类肌纤维的显著再生，可通过人特异性抗体进行鉴定（图4）。部分肌纤维中出现胚胎型肌球蛋白阳性染色，表明再生过程仍在持续。相反，手术技术不佳或组织样本质量不足可能导致肌纤维再生不良（图4）。
来自一名被诊断为特发性炎性肌病（IIM）患者的异种移植显示，在移植后4个月和6个月时可观察到中等数量的人类肌纤维再生，且胚胎型肌球蛋白染色在6个月时仍呈阳性（.......
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讨论
患者来源的异种移植是模拟肌肉疾病并开展临床前研究的一种创新方法。本文所述的骨骼肌异种移植构建方法快速、简便且可重复。单侧手术可在15至25分钟内完成，双侧手术则需30至40分钟。双侧异种移植可提供额外的实验灵活性。例如，研究人员可对其中一个移植物进行局部处理，而将另一侧作为对照。当在无病原体环境中饲养时，NRG小鼠对手术部位感染具有较强抵抗力；根据我们已完成的200多例异种移植手术经验，从未出现小鼠发生手术感染的情况。此外，宿主小鼠对胫骨前肌（TA）和趾长伸肌（EDL）的切除耐受性良好。术后一小时内，接受单侧或双侧异种移植的小鼠即可活跃地在笼内走动，甚至能用后肢站立。偶尔我们会观察到宿主小鼠出现足下垂现象，但通常仅发生在一段不活动期后（如刚苏醒时），且在清醒后数分钟内肢体功能即可恢复正常。
该方案中有几个关键步骤。首先，在分离趾长伸肌（EDL）和胫骨前肌（TA）时，必须注意不要损伤邻近的腓骨长肌（PL）或其肌腱。为避免此问题，应在对TA区域进行初始切口后，仔细准确地辨认所有远端肌腱的位置。此外，在切除EDL之前，应辨认并清晰暴露腓骨长肌（PL）的近端肌腱（
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由肌炎协会和彼得·巴克基金会资助。我们感谢张元凡博士在异种移植外科技术方面的专业知识分享和培训指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 毫米 × 15 毫米培养皿 | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-甲基丁烷 | Fisher | O3551-4 | |
| 20 毫米 × 30 毫米显微盖玻片 | VWR | 48393-151 | |
| 动物电子秤 | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| 抗生素-抗真菌素溶液 | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip 手术夹闭合系统 | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo 针持 | F.S.T | 12565-14 | |
| 鸡胚提取物 | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 紫外线冷冻切片机 | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| 考普林染色缸 | Thermo Scientific | 19-4 | |
| 解剖针 | Fisher Scientific | S13976 | |
| 干冰（颗粒状） | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| 胚胎型肌球蛋白抗体 | DSHB | F1.652 | 推荐使用浓度 1:10 |
| 乙醇 | Fisher Scientific | 459836 | |
| 胎牛血清 | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 光纤冷光源 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| 镊子 | F.S.T | 11295-20 | |
| 山羊抗小鼠 IgG1，Alexa Fluor 488 标记 | Invitrogen | A-21121 | 推荐使用浓度 1:500 |
| 山羊抗小鼠 IgG2b，AlexaFluor 594 标记 | Invitrogen | A-21145 | 推荐使用浓度 1:500 |
| 西黄芪胶 | Sigma | G1128 | |
| Ham's F-10 培养基 | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl 蓝色皮肤表面粘合剂 | Tissue seal | TS1050044FP | |
| 人特异性层粘连蛋白 A/C 抗体 | Abcam | ab40567 | 推荐使用浓度 1:50–1:100 |
| 人特异性血影蛋白抗体 | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | 推荐使用浓度 1:20–1:100 |
| 诱导麻醉室 | VetEquip | 941444 | |
| 虹膜镊 | F.S.T | 11066-07 | |
| 辐照 Global 2018 饲料（Uniprim 4100 ppm） | Envigo | TD.06596 | 含抗生素的啮齿类动物饲料，用于预防呼吸道感染 |
| 异氟烷 | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes 擦拭纸 | Kimberly-Clark | 34155 | 外科擦拭纸 |
| Mapleson E 型呼吸回路 | VetEquip | 921412 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A412 | |
| 移动式麻醉机 | VetEquip | 901805 | |
| 小鼠组织小鼠 IgG 基本封闭试剂盒 | Vector Laboratories | BMK-2202 | 小鼠 IgG 封闭试剂 |
| 指甲油 | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR 脱毛乳液/油 | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) 小鼠 | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 至 3 月龄 |
| O.C.T. 包埋剂 | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| 氧气 | Airgas | OX USPEA | |
| PBS（磷酸盐缓冲液）缓冲液 | Fisher Scientific | 4870500 | |
| 聚维酮碘术前清洁液 | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Fisher Scientific | P10144（不含 DAPI）；P36935（含 DAPI） | |
| Puralube 眼科软膏 | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl（卡洛芬）注射液 | Patterson Veterinary | 10000319 | 外科镇痛药，皮下注射，剂量为 5 mg/kg |
| 手术刀片 - #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| 手术刀柄 - #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| 体视显微镜 | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus 显微载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 合成非吸收性缝线，30 英寸长，CV-11 针 | Covidien | VP-706-X | |
| 1 毫升注射器（26 号针头，3/8 英寸） | BD Biosciences | 329412 | |
| 毛发修剪器 | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas 弹簧剪，8.0 毫米剪切刃 | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd 活性炭过滤器 | VetEquip | 931401 | |
| 伤口夹，9 毫米 | F.S.T | 12022-09 |
参考文献
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 0, 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature ....
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