用于评估骨替代材料中骨生长与新生血管形成的兔颅骨骨增量模型

摘要

本文介绍了一种在兔子中进行的外科手术方案，旨在评估骨替代材料在骨再生能力方面的性能。通过将聚醚醚酮（PEEK）圆柱体固定在兔颅骨上，可在活体或安乐死动物中评估材料所诱导的成骨传导、成骨诱导、成骨生成以及血管生成作用。

摘要

兔颅骨模型的基本原理是在颅骨皮质部分的上方垂直生长新骨组织。该模型可用于评估骨替代材料在口腔和颅面骨再生方面对骨生长和新生血管形成的支持作用。动物麻醉并进行通气（经气管插管）后，将四个由聚醚醚酮（PEEK）制成的圆柱体分别固定于颅骨上，位于矢状缝和冠状缝两侧。在每个圆柱体所限定的骨区域内钻五个髓内孔，以允许骨髓细胞流入。将待测材料样本置入圆柱体内，随后封闭圆柱体。最后缝合手术部位，使动物苏醒。可通过显微CT对活体动物进行骨生长的评估。动物安乐死后，可利用显微CT、免疫组织化学和免疫荧光技术进一步评估骨生长及新生血管形成情况。由于材料评估需要最大程度的标准化与校准，颅骨模型显得尤为理想。该模型操作简便，使用定义明确的圆柱体有助于实现校准与标准化，并可同时评估四个样本。此外，可对活体动物进行连续断层扫描，从而有望显著减少需安乐死的动物数量。

引言

颅骨骨增量模型于20世纪90年代建立，旨在优化口腔及颅面外科领域内的引导性骨再生（GBR）概念。该模型的基本原理是在颅骨的皮质骨部分上方垂直生长新的骨组织。为此，将一个反应器（例如钛制穹顶、圆柱或笼状结构）固定于颅骨上，以保护由移植物（如水凝胶、骨替代材料等）介导的骨再生过程。借助该模型，研究人员已对钛或陶瓷笼^1,2,3,4,5,6、GBR膜^7,8,9,10、成骨因子^{11,12,13,14,15,16,17}、新型骨替代材料^{12,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29}，以及骨再生过程中新生血管化的机制³⁰进行了评估。

从转化医学的角度来看，颅骨模型代表了一种单壁缺损，可与颌骨的IV类缺损相比较³¹。该模型的目标是在皮质骨区域上方生成新骨，且无内源性骨壁提供的侧向支撑。因此，该模型极为严格，能够评估在骨皮质部分实现垂直骨传导的真实潜力。尽管本文所述模型主要用于评估骨替代材料的骨传导性，但也可用于评估成骨作用和/或骨诱导作用，以及血管生成能力^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30}。

出于伦理、实际和经济方面的考虑，兔颅骨模型被开发出来，因为兔的骨代谢和骨结构与人类具有较高的相关性³²。上述引用的30篇文献中，80%采用了兔颅骨模型^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,17,22,23,26,27,28,29,30,33}，从而证明了该动物模型的重要性。2008年，Busenlechner 研究组将颅骨模型转移至猪，以实现同时比较八种骨替代材料²⁰（相比之下，兔模型仅能比较两种骨替代材料）。另一方面，我们的研究组则将兔颅骨模型应用于绵羊。简而言之，将钛制穹顶置于绵羊颅骨上，用于表征一种新型3D打印骨替代材料的骨引导性能。这些研究使我们得以开发并掌握颅骨模型及其分析方法^16,21。

最近引用的三项研究^16,20,21，以及另外多项研究^{12,17,18,19,22,23,24,26,27,28,29}，共同证实了颅骨模型作为筛选和表征模型的巨大潜力。然而，尽管所获得的结果相当令人满意，这些研究也指出了某些局限性：（1）使用了钛制穹顶，阻碍了X射线的穿透，从而无法进行活体微计算机断层扫描（micro-CT）检测。由于组织学处理前无法移除钛制穹顶，研究人员被迫将样本包埋于聚甲基丙烯酸甲酯树脂（PMMA）中，导致后续分析在很大程度上仅限于表面形貌观察。（2）高昂的经济成本，尤其是动物本身的费用，以及与动物运输、饲养和手术相关的成本。（3）在大型动物实验中获得伦理审批存在困难。

Polo 等人最近的一项研究²⁶在兔模型上进行了大幅改进。用可闭合的圆柱体替代了钛制穹顶，该圆柱体可填充固定体积的材料。将四个此类圆柱体置于兔颅骨上。实验结束后，可移除圆柱体，使活检样本不含金属，从而在样本处理方面提供了更大的灵活性。兔颅骨模型因此成为一种具有吸引力的模型，可用于同步测试，且成本较低、动物操作简便、样本处理便捷。利用这些最新进展，我们进一步改进了该模型，使用聚醚醚酮（PEEK）替代钛来制造圆柱体，从而允许X射线穿透，并可在活体动物上应用显微断层扫描技术。

本文将介绍麻醉和手术操作流程，并展示使用该方案可能获得的结果示例，即通过（免疫）组织学、组织形态计量学、活体及离体显微断层成像技术来评估骨再生机制，并定量分析骨替代材料所支持的新骨形成。

方案

根据瑞士法律法规，该方案已获得学术委员会批准，并由州级和联邦级兽医机构监督（许可编号 n° GE/165/16 和 GE/100/18

1. 特定设备与动物

1. 圆柱体
   1. 将聚醚醚酮（PEEK）材料加工成带有侧向稳定凸片的圆柱体，内径为5 mm，外径为8 mm，高度为5 mm（图1）。
   2. 加工PEEK盖帽，设计为可精确卡接到圆柱体顶部（厚度1 mm）。
   3. 手术前通过高压灭菌法对PEEK圆柱体和盖帽进行灭菌。
2. 螺钉
   1. 使用自钻式微型螺钉（由商业纯钛（5级）制成）固定圆柱体（直径1.2 mm，长度4 mm）。手术前通过高压灭菌法进行灭菌。
3. 实验动物
   1. 购买三个月大的新西兰白兔（雄性或雌性），每只体重约2.5 kg。
      注：本研究使用的兔子来源于日内瓦大学的繁殖种群。

2. 手术

1. 手术托盘
   1. 准备好手术刀、剪刀、两把镊子、骨膜剥离器、注射器（1 mL、2 mL、5 mL、50 mL）、外科手机、圆形外科钻头（0.8 mm直径）、针头、无菌生理盐水、四个圆柱形装置、八枚螺钉和螺丝刀。
2. 临床前治疗
   1. 手术前一周对动物进行适应性饲养。
   2. 手术前2小时开始，每天给予一次预防性抗生素（5–10 mg/kg，口服），持续至术后第3天。
3. 麻醉与插管
   1. 通过肌内注射（IM）给予氯胺酮（25 mg/kg，50 mg/mL，0.5 mL/kg）+ 赛拉嗪（3 mg/kg，20 mg/mL，0.15 mL/kg）使动物镇静。等待约20分钟，直至动物进入睡眠状态
      深度（完全肌肉松弛）
      注意：本项预先用药可实现简单、快速且无痛的插管过程。深度镇痛和麻醉的诱导方法见步骤 2.3.8。
   2. 将静脉（IV）套管插入耳缘静脉，并保持关闭状态直至完成插管。
      注意：此静脉通路将用于输注芬太尼和丙泊酚，分别实现深度镇痛和麻醉（见步骤 2.3.8）。
   3. 通过纯氧供给5%七氟烷维持麻醉，直至完成插管。
      注意：仅当动物出现苏醒迹象（如眼球运动、肌肉收缩）时，才需要执行此步骤。
   4. 用10%利多卡因喷雾对气管进行局部麻醉。将兔子置于俯卧位，并使其头部保持垂直伸展状态。
   5. 将第一根小直径（2.5 mm）的气管插管插入兔气管，直至能听到管内有气流声。此举可打开声门，便于后续插入正式气管插管。
   6. 在导管中插入引导管（插管导管），以固定导管在气管内的位置。移除细径导管，并沿引导管插入终末气管导管（4.9 mm）。
   7. 移除引导器，然后充胀气管导管末端的气囊，以封闭并固定装置于气管内。导管将保持在原位，但可通过一根系于前额的系带进一步固定。  立即用纯氧中3%七氟烷（7 mL/kg，频率40次/分钟）对动物进行通气。
   8. 持续灌注（耳静脉）芬太尼（0.01 mg/mL，2–4 mL/h）以实现镇痛，2–4 mg/kg 的丙泊酚（2%，20 mg/mL，4–8 mL/h）以诱导麻醉，并以 4 mL/kg/h 的速度输注醋酸林格液以维持等容状态。
   9. 放置直肠温度探针。在整个过程中监测心功能、体温和血氧饱和度。
   10. 通过监测自主呼吸来控制麻醉深度；若动物出现自主呼吸迹象，给予小剂量的丙泊酚和芬太尼。
4. 术前准备
   1. 将兔子置于加热垫（39 °C) 用软垫（以避免灼伤）覆盖手术台上的动物。剃除头皮毛发。
   2. 在眼睛上涂抹润滑凝胶以避免刺激和干燥。使用聚维酮碘（10%）擦拭皮肤对术区进行消毒。然后用无菌手术巾覆盖兔子，并为颅骨暴露区域剪开适当窗口。
   3. 用聚维酮碘（10%）对手术部位进行第二次消毒。在眼睛上涂抹润滑凝胶，以避免刺激和干燥。
   4. 准备一张铺有无菌巾的手术台，用于放置完整的手术托盘。
5. 手术部位切开
   1. 用利多卡因2%（1 mL）进行皮下（SC）注射，局部麻醉 在颅骨上
   2. 沿颅骨矢状线从眼眶至枕外隆凸处（使用手术刀）切开皮肤（约4 cm长）。确保切开骨膜。
   3. 沿切口两侧轻轻抬起骨膜（使用骨膜剥离器）。用无菌生理盐水冲洗术区。
6. 圆柱体放置
   1. 在颅骨上定位矢状缝和冠状缝（图 2A，B）。请注意，这些解剖标志线形成一个十字。圆柱体将被放置于该十字所划分的每个象限内，确保圆柱体的边缘不覆盖骨缝（图2C).
   2. 将第一个圆柱体置于左上象限（左额骨），并尝试使装置平放。用手施加较大压力固定位置，然后拧入微型螺钉，直至感到阻力。确保螺钉头部与圆柱体凸缘表面齐平。
   3. 在另一侧的骨瓣上重复相同操作，将圆柱体牢固地固定在颅骨上。确保圆柱体与骨组织完全密闭固定。
   4. 在右上象限（右额骨）、左下象限（左顶骨）和右下象限（右顶骨）重复上述操作。
7. 在圆柱限定区域内进行5个髓内孔的骨钻孔（图1)
   1. 在骨面、圆筒划定区域的中心位置，使用球钻在生理盐水灌注条件下钻一个髓腔孔（直径0.8 mm，深度约1 mm），确保出现出血。
   2. 沿穿过两个标签螺钉的轴线，在圆柱体内侧边缘再钻两个髓腔孔。沿垂直轴线，在圆柱体内侧边缘再钻两个髓腔孔。确保有出血出现。
   3. 在其余三个圆柱体内重复上述操作。
8. 将材料样品填入圆柱体并封盖（图3）
   1. 根据制造商说明或材料规格准备所需的骨替代材料。
   2. 将材料样品填满第一个圆柱体至边缘，并通过安装盖子封闭圆柱体。在其余3个圆柱体中重复此过程。
9. 手术部位关闭
   1. 使用间断性不可吸收缝线缝合覆盖在圆柱体上方的皮肤。
   2. 在伤口上喷洒可喷涂敷料。

3. 术后处理

1. 停止镇痛和麻醉（停止输注丙泊酚和芬太尼），并检查自主呼吸是否恢复。
2. 动物恢复自主呼吸后停止通气。在完全苏醒前，维持动物吸入纯氧。
3. 皮下注射盐酸丁丙诺啡（0.02 mg/kg，0.03 mg/mL，0.67 mL/kg），术后镇痛每6小时注射一次，持续3天。
4. 将动物转移至常规饲养环境，并提供水和完整饲料。
5. 伤口愈合约10天后拆除缝线。

结果

本文所述模型专用于评估骨替代材料的骨传导性。也可对经（预先）细胞化或负载生物活性分子的骨替代材料的成骨作用和/或骨诱导作用，以及血管生成进行评估^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,}

讨论

本文所述模型操作简便，只要遵循所有步骤并使用合适的设备，即可轻松建立。由于本方案属于外科手术方法，所有步骤均至关重要，必须严格遵守。操作人员必须接受过动物实验培训，尤其是兔类动物的饲养管理和麻醉技术。如有需要，应毫不犹豫地寻求专业麻醉师和兽医的帮助。必须强调在缝线拆除前后对动物进行每日视觉观察。尽管颅骨部位皮肤较厚、丰富且松弛，但圆柱体固定后会产生较大张力。若过早拆除缝线，伤口可能重新裂开，需要再缝合一周并重新进行抗生素治疗。若伤口裂开部位超出切口线范围，外科医生需评估是否仍可进行缝合。如无法缝合，则需考虑样本废弃。

除了方案部分所述的关键步骤外，以下细节可能有助于正确实施本方案。从技术角度来看，由于所使用的兔子年龄较小且体型较小，因此必须采用方案中描述的两步插管法。 第二根（也是最终的）导管过大，不能用于首次插管，否则存在明显的“错误路径”风险，可能导致严重损害甚至死亡。
根据所测试的材料，可考虑从已放置的耳缘静脉留置管中采集少量新鲜血液。这种方法可用于在植入前用天然细胞和生长因子预处理骨替代材料。新鲜凝固的血液也可作为理想的假手术对照样本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
药物
恩诺沙星 Baytril 10%	Bayer		抗生素
芬太尼	Bischel		用于镇痛
Ketalar 50mg/ml	Pfizer		用于麻醉的氯胺酮
Lidohex	Bichsel		眼部润滑凝胶
Opsite	Smith and Nephew	66004978	可喷洒敷料
聚维酮碘 10%，Betadine	Mundipharma		抗感染剂
丙泊酚 2%	Braun	3538710	用于麻醉
Rapidocain 2%	sintetica		局部麻醉
林格氏醋酸盐	Fresenius Kabi		容量补充
Rompun 2%	Bayer		用于麻醉的赛拉嗪
七氟烷 5%	Abbvie		用于麻醉
无菌生理盐水	Sintetica
Temgesic	Reckitt Benckiser		盐酸丁丙诺啡，用于镇痛
硫喷妥钠 Inresa	Ospediala		用于麻醉
Xylocaine 10% 喷雾	Astra Zeneca		用于插管
名称	公司	目录编号	备注
设备
Fresenius Vial pilot C	Imexmed		输液泵
加热垫	Harvard Apparatus
Suction dominant 50	Medela
Suction tubing Optimus	Promedical	80342.2
外科电机	Schick dental	Qube	用于钻制髓内孔
通气设备	Maquet Servo1
名称	公司	目录编号	备注
材料
圆柱体及盖帽	Boutyplast	定制	成分：PEEK（聚醚醚酮）
手动自持式套管	GlobalD	ACT1K
自持式套管的移动手柄	GlobalD	MTM
自攻螺钉	GlobalD	VA1.2KL4	十字驱动螺钉，由钛合金5级（ISO 5832-3）制成
名称	公司	目录编号	备注
手术托盘
Shiley 气管插管，直径 2.5 mm	Covidien	86233	用于插管
Shiley 气管插管，直径 4.9 mm	Covidien	107-35G	用于插管
Ethicon prolene 4-0	Ethicon	8581H	不可吸收缝线
镊子	Marcel Blanc	BD027R	145 mm
插管导管	Cook medical		插管引导
持针器	Marcel Blanc	BM008R
BD Microlance3 针头	Becton Dickinson	300300/304622	26G；18G
骨膜剥离器	HU-Friedy	P9X
圆形外科钻头	Patterson	78000	直径 0.8 mm，用于钻制髓内孔
手术刀	Swann-Morton		编号°10 和编号°15
剪刀	Marcel Blanc	00657	180 mm
Omnifix 注射器	Braun	4616057V	5 ml、10 ml 和 50 ml
Venflon G22	Braun	42690985-01	耳部静脉通路用 Vasofix 安全型留置针