本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。
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本文内容
摘要
摘要
使用传统的转基因方法在造血干细胞中操控基因可能耗时较长、成本高昂且具有挑战性。得益于基因组编辑技术以及慢病毒介导的转基因递送系统的进步，本文介绍了一种高效且经济的方法，用于建立基因在造血干细胞中特异性被操控的小鼠模型。该方法利用慢病毒将表达Cas9的谱系阴性骨髓细胞转导，同时导入靶向特定基因的向导RNA（gRNA）以及一个红色荧光报告基因（RFP），随后将这些细胞移植到经致死剂量照射的C57BL/6小鼠体内。以表达非靶向gRNA的慢病毒进行移植的小鼠作为对照组。通过流式细胞术检测外周血中RFP阳性白细胞，评估转导后造血干细胞的植入情况。采用此方法，移植后4周可实现约90%的髓系细胞转导率和约70%的淋巴系细胞转导率。从RFP阳性的血细胞中提取基因组DNA，通过PCR扩增靶位点DNA片段，以验证基因组编辑效果。该方案可高通量地评估调控造血的基因，并可拓展应用于多种涉及造血细胞的小鼠疾病模型。
引言
血液学和免疫学领域的许多研究依赖于基因修饰小鼠，包括利用造血系统特异性 Cre 驱动因子（如 Mx1-Cre、Vav-Cre 等）的常规和条件性转基因/基因敲除小鼠1,2,3,4,5。这些策略需要建立新的小鼠品系，耗时较长且经济负担较重。尽管基因组编辑技术的革命性进展使得在具备适当技术能力的情况下，可在短短 3 至 4 个月内生成新的小鼠品系6,7,8,9，但在开展实验之前仍需花费更长时间扩增小鼠种群。此外，这些操作成本高昂。例如，杰克逊实验室（Jackson Laboratory）列出的每品系基因敲除小鼠制备服务当前价格为 16,845 美元（截至 2018 年 12 月）。因此，相较于传统的转基因小鼠方法，更具经济性和效率的方法更具优势。
成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白9（CR....
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方案
所有涉及动物实验的操作均已获得弗吉尼亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 慢病毒颗粒的产生与纯化
注意：含有优化向导RNA的慢病毒颗粒可通过Addgene提供的详细方案制备：<https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf>。高滴度慢病毒的制备与保存的优化方法在其他文献中有讨论17,18。简言之，通过将慢病毒载体质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK 293T细胞来产生慢病毒。转染后48小时收集培养上清液，并通过超速离心浓缩。慢病毒滴度由市售的基于qPCR的检测试剂盒测定。该操作应在生物安全二级柜中进行。
- 在1×PBS中配制胶原蛋白（0.0005%）的1:200溶液。
- 用胶原蛋白溶液包被6孔板，并在37 °C、5% CO2条件下孵育约30分钟。
- 以每孔1 × 106个细胞的密度接种293T细胞，并在37 °C、5% CO2条件下孵育约2小时。
- 为制备单孔转染用的三种质粒混合物，将0.9 µg慢病毒载体、0.....
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结果
采用上述方案，每只小鼠可获得约 0.8-1.0 × 108 个骨髓细胞。每只小鼠获得的谱系阴性细胞数量约为 3 × 106 个。通常，骨髓谱系阴性细胞的得率为总骨髓有核细胞的 4%–5%。
通过对外周血进行流式细胞术分析，评估转导细胞（RFP阳性）的嵌合率（图2A、B）。血液自眶后静脉采集，并使用适当的标记物鉴定各造血细胞亚群的身份（如中性粒细胞、单核细胞、T细胞等）（图3A、B）。可从RFP阳性血细胞中提取基因组DNA，通过PCR扩增靶位点DNA片段，并将产物亚克隆至TA克隆载体中用于测序分析。将这些质粒转导至E. coli中，通过Sanger测序确定靶位点序列（.......
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讨论
与传统的转基因小鼠方法相比，该方案的优势在于能够快速且高度经济地构建在造血细胞中携带特定突变的动物模型。研究发现，该方法可在1个月内实现对小鼠造血细胞基因的操控。本方案中有多个关键步骤需要进一步考虑。
gRNA序列的筛选
建议在进行体内实验之前，先在体外测试gRNA以评估其编辑效率。gRNA的效率通过无细胞的体外转录和筛选系统进行检测。通过在重组Cas9蛋白存在的情况下，利用琼脂糖凝胶电泳检测转录出的gRNA对模板DNA的切割效率，从而验证其活性。目前已有 commercially available kits 可用于此目的。
此处，通过TA克隆法对从编辑区域扩增的PCR产物进行克隆，将这些质粒转化至细菌细胞，并挑取单个菌落进行Sanger测序，以鉴定插入缺失（indel）突变。然而，该方法费时且劳动强度大。 alternatively，可采用下一代测序（NGS）或混合DNA测序结合TIDE分析19
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
S. S. 获美国心脏协会博士后奖学金 17POST33670076 资助。K. W. 获美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01 HL138014、R01 HL141256 和 R01 HL139819 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 培养基 (1X) | Gibco | 11875-093 | 培养基 |
| 磺胺甲噁唑和甲氧苄啶注射液 | TEVA | 0703-9526-01 | |
| 1/2 cc LO-DOSE 胰岛素注射器 | EXELINT | 26028 | 通用耗材 |
| 293T 细胞 | ATCC | CRL-3216-- | 细胞系 |
| APC-抗小鼠 Ly6C 抗体（克隆 AL-21） | BD Biosciences | 560599 | 抗体 |
| APC-Cy7-抗小鼠 CD45R 抗体（克隆 RA3-6B2） | BD Biosciences | 552094 | 抗体 |
| BD Luer-Lok 一次性注射器，10 ml | BD | 309604 | 通用耗材 |
| BD Microtainer 血液采集管，含 K2EDTA | BD Bioscience | 365974 | 通用耗材 |
| BD Precisionglide 针头，18 G | BD | 305195 | 通用耗材 |
| BD Precisionglide 针头，22 G | BD | 305155 | 通用耗材 |
| BV510-抗小鼠 CD8a 抗体（克隆 53-6.7） | Biolegend | 100752 | 抗体 |
| BV711-抗小鼠 CD3e 抗体（克隆 145-2C11） | Biolegend | 100349 | 抗体 |
| 牛皮胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | 通用耗材 |
| Corning Costar 超低吸附多孔板，6 孔 | Millipore Sigma | CLS3471 | 通用耗材 |
| CRISPR/Cas9 基因敲入小鼠 | The Jackson Laboratory | 028555 | 小鼠 |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | 通用耗材 |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM) - 高糖 | Sigma Aldrich | D6429 | 培养基 |
| eBioscience 1X 红细胞裂解缓冲液 | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | 溶液 |
| Falcon 100 mm 细胞培养皿，经 TC 处理 | Life Sciences | 353003 | 通用耗材 |
| Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管 | Life Sciences | 352054 | 通用耗材 |
| Falcon 50 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 352098 | 通用耗材 |
| Falcon 6 孔透明平底多孔细胞培养板，经 TC 处理 | Life Science | 353046 | 通用耗材 |
| Fisherbrand 微量压积毛细管 | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | 通用耗材 |
| Fisherbrand 无菌细胞筛，70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | 通用耗材 |
| 荧光素异硫氰酸酯-抗小鼠 CD4 抗体（克隆 RM4-5） | Invitrogen | 11-0042-85 | 抗体 |
| 固定缓冲液 | BD Bioscience | 554655 | 溶液 |
| Guide-it Compete sgRNA 筛选系统 | Clontech | 632636 | 试剂盒 |
| Isothesia（异氟烷）溶液 | Henry Schein | 29404 | 溶液 |
| Lenti-X qRT-PCR 滴定试剂盒 | Takara | 631235 | 试剂盒 |
| Lineage 细胞耗竭试剂盒，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | 试剂盒 |
| Millex-HV 注射式滤器，0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | 通用耗材 |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | 溶液 |
| PE-Cy7-抗小鼠 CD115 抗体（克隆 AFS98） | eBioscience | 25-1152-82 | 抗体 |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | 溶液 |
| 青霉素-链霉素混合液 | Lonza | 17-602F | 溶液 |
| PerCP-Cy5.5-抗小鼠 Ly6G 抗体（克隆 1A8） | BD Biosciences | 560602 | 抗体 |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | 质粒 |
| pMG2D | Addgene | 12259 | 质粒 |
| Polybrene 感染/转染试剂 | Sigma Aldrich | TR-1003-G | 溶液 |
| 聚丙烯离心管 | BECKMAN COULTER | 326823 | 通用耗材 |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | 质粒 |
| RadDisk – 啮齿动物辐照器圆盘 | Braintree Scientific | IRD-P M | 通用耗材 |
| 重组小鼠 SCF | Peprotech | 250-03 | 溶液 |
| 重组小鼠 TPO | Peprotech | 315-14 | 溶液 |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | 溶液 |
| TOPO TA 克隆试剂盒（含 One Shot TOP10 化学感受态大肠杆菌）用于测序 | Thermo fisher Scientific | K457501 | 试剂盒 |
| Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒 | BioLegend | 423102 | 溶液 |
参考文献
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed thro....
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