本文介绍了一种利用16S rRNA宏基因组测序及免费可用工具进行微生物组分析的简化标准操作流程。该方案将有助于刚进入微生物组领域的研究人员，以及需要更新方法以实现更高分辨率细菌谱型分析的研究人员。
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本文内容
摘要
摘要
人体肠道中定植着数以万亿计的细菌，这些细菌支持多种生理功能，例如食物代谢、能量获取以及免疫系统的调节。已有研究提示，健康肠道微生物组的紊乱可能在包括多发性硬化症（MS）在内的炎症性疾病的发生发展中发挥作用。环境和遗传因素均可影响微生物组的组成；因此，识别与疾病表型相关的微生物群落已成为定义微生物组在健康与疾病中作用的第一步。利用16S rRNA宏基因组测序对细菌群落进行分析，已推动了微生物组研究的发展。尽管该方法被广泛使用，但目前尚无统一的基于16S rRNA的分类学分析流程。另一个局限性是由于技术难题（如测序读长远短、反向（R2）读长质量较低导致最终分析中仅使用正向（R1）读长）所导致的分类学注释分辨率较低。因此，亟需一种操作简便且分辨率高的方法，以准确表征特定生物样本中的细菌多样性。测序技术的进步，特别是能够以高分辨率生成更长读长的能力，已在一定程度上克服了这些挑战。当前的测序技术结合公开可用的宏基因组分析流程（例如基于R语言的分裂扩增子去噪算法DADA2），已显著提升了微生物群落分析的分辨率，因为DADA2能够将序列精确注释到属和种水平。本文介绍了一种通过两步扩增16S rRNA基因V3-V4区进行细菌群落分析的操作指南，并结合免费可用的分析工具（如DADA2、Phyloseq和METAGENassist）进行后续数据分析。本研究认为，这一简单而完整的分析流程将为致力于开展微生物组分析研究的科研人员提供一个优秀的技术工具。
引言
微生物群是指生活在特定环境中的微生物（包括细菌、病毒、古菌、噬菌体和真菌）的集合，而微生物组则指这些定植微生物的集体基因组。由于细菌在人类和小鼠体内是最丰富的微生物之一，本研究仅聚焦于细菌群落的分析。人类肠道中定植着数万亿的细菌，包含数百种不同的菌株1。正常的肠道微生物群通过调节多种功能（如维持完整的肠道屏障、食物代谢、能量稳态、抑制病原体定植以及免疫应答的调控）在宿主健康状态的维持中发挥着至关重要的作用2,3,4,5。肠道微生物群组成的改变（即肠道菌群失调）已被证实与多种人类疾病相关，包括胃肠道疾病6、肥胖7,8、中风9、癌症10、糖尿病8,11、类风湿性关节炎12、过敏1....
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方案
该实验方案已获爱荷华大学机构动物护理与使用委员会批准。
1. 粪便样本的采集与处理
- 用70%乙醇对分隔盒（见材料表、补充图1）进行灭菌。
- 预先标记微型离心管（每只小鼠一支），注明样本编号和处理组别（如适用）。
- 将小鼠放入已灭菌的分隔盒中，使其正常排便，时间最长可达1小时。
- 使用无菌镊子将粪便颗粒收集至一个空的、预先标记的1.5 mL微型离心管中，并拧紧管盖。每次从小鼠收集后，均需对镊子进行灭菌。
- 将含有粪便颗粒的微型离心管置于-80 °C冰箱中保存，直至进一步处理。
注意：分隔盒的优势在于可同时从多只小鼠（最多12只）一次性收集粪便样本。
2. DNA 提取
- 从冰箱中取出粪便样本（小鼠或人类），在室温（RT）下解冻。
注意：建议根据需要将人粪便样本在 4 °C 下过夜解冻，以便从储备样本中收集 200 mg 或所需量的样本。 - 使用 200 mg 起始材料，并将 DNA 洗脱至终体积为 50 µL。
- 设置一个 DNA 提取试剂盒空白对照，该对照中不加入粪便样本，但仍进行所有 DNA ....
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结果
由于MHC II类分子（人类中为HLA）在适应性免疫应答中起核心作用，并且与多发性硬化症（MS）的易感性密切相关24,25,26，因此推测HLA II类分子可能影响肠道微生物的组成。为此，本研究利用了缺乏MHC II类基因的小鼠（AE.KO）以及表达人类HLA-DQ8基因的小鼠（HLA-DQ8），以探究HLA II类分子在塑造肠道微生物群落中的重要性。
从 AE.KO（n = 16）和 HLA-DQ8（n = 12）转基因小鼠收集粪便样本，提取细菌 DNA，并扩增 16S rRNA 基因的 V3-V4 区域。通过在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳检测扩增子大小（550 bp）（图 2A，泳道 1–6）。进一步使用高灵敏度电泳芯片上样 1 μL PCR1 产物，对 16S rR.......
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讨论
本方案描述的实验流程简单，通过16S rRNA宏基因组测序技术，可对大量感兴趣的生物样本进行微生物组分析，步骤清晰易行。新一代测序技术已彻底改变了微生物生态学研究，尤其在人类及临床前疾病模型中应用广泛31,32。该技术的主要优势在于能够以高通量、低成本的方式，成功分析特定生物样本中复杂的微生物组成（包括可培养和不可培养的微生物）32。然而，若干因素（如批次效应、16S rRNA基因引物的选择以及测序数据分析）仍是该技术广泛应用的主要障碍。
基于16S rRNA的高级MiSeq测序技术（2×300 bp）33能够对细菌长达1,500个核苷酸的16S rRNA基因中的约600个核苷酸进行测序，从而克服了早期测序读长较短的技术瓶颈。可使用针对rRNA不同区域（如V1–V2、V3–V5或V6–V9）的特异性引物，但每种区域特异性引物在特定分类群的检测中均表现出一定程度的偏倚，即可.......
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披露
A. M. 作为一项声称使用Prevotella histicola治疗自身免疫性疾病技术的发明人之一，从梅奥诊所（由Evelo Biosciences支付）获得了专利使用费。
致谢
作者感谢美国国家过敏与传染病研究所/国立卫生研究院（NIAID/NIH，项目编号：1R01AI137075-01）、卡弗医疗研究倡议基金（Carver Trust Medical Research Initiative Grant）以及爱荷华大学环境健康科学研究中心、美国国家环境健康科学研究所/国立卫生研究院（NIEHS/NIH，项目编号：P30 ES005605）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 天然微量离心管 | USA, Scientific | 1615-5500 | 粪便样本采集 |
| 3M 手持式涂布器刮刀 PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | 用于 PCR 板的正确密封 |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR 纯化、NGS 清洁、PCR 清洁 |
| Agilent DNA 1000 试剂 | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA 定量与质量控制 |
| Bioanalyzer DNA 1000 芯片 | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA 定量与质量控制 |
| Index Adapter 替换盖 | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | Index 1 和 Index 2 adapter 引物的新盖 |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil 试剂盒 | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA 提取 |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | 用于扩增子 PCR1 和加索引 PCR2 的 PCR 预混液 |
| Lewis 分隔盒 | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | 粪便样本采集 |
| 磁力架 | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | 用于 PCR 清洁 |
| MicroAmp 快速光学 96 孔反应板 | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR 板 |
| MicroAmp 光学粘性封膜 | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR 板封膜 |
| Microfuge 20 离心机 | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | 用于 DNA 提取的离心机 |
| MiSeq 试剂盒（600 个循环）v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | 用于 MiSeq 测序 |
| Nextera XT DNA 文库制备试剂盒 | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA 文库制备 |
| 多通道加样槽试剂储液槽 | ASI, FL, USA | RS71-1 | 用于 PCR2 产物的混合 |
| 板式离心机 | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | 用于 PCR 试剂混合及去除板中气泡 |
| PhiX 控制品 | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | 用于 MiSeq 测序对照 |
| 微生物组 DNA 纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | 用于 PCR1 产物的纯化 |
| PowerLyzer 24 均质器 | Omni International, GA, USA | 19-001 | 用于 DNA 提取的珠磨破碎仪 |
| Qubit dsDNA HS（高灵敏度）检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA 定量 |
| TruSeq 索引板固定装置 | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | 用于排列索引引物 |
| 垂直分隔板（大号） | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | 粪便样本采集 |
| 垂直分隔板（小号） | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | 粪便样本采集 |
参考文献
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. J....
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重印与许可
