方法文章

利用RNA测序鉴定环状RNA

DOI：

10.3791/59981

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2019年11月14日

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1Translational Genomic Research Institute, 2Arizona Alzheimer's Consortium, 3Banner Sun Health Research Institute

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

环状RNA（circRNA）是一类非编码RNA，可能在转录调控以及介导蛋白质间相互作用中发挥功能。在评估了构建circRNA测序文库的多个不同参数后，本文整合并提出了一种利用RNase R预处理的链特异性总RNA文库制备方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

环状RNA（circRNA）是一类非编码RNA，参与多种功能，包括微小RNA（miRNA）调控、介导蛋白质-蛋白质相互作用以及调控亲本基因的转录。在传统的二代RNA测序（RNA-seq）中，由于mRNA文库构建过程中采用poly-A筛选，circRNA通常被忽略，或因其丰度极低而难以分离和检测。本文通过比较不同的文库制备试剂盒、预处理方案以及总RNA输入量，优化了circRNA文库构建流程。测试了两种 commercially available 全转录组文库制备试剂盒，分别在有或无RNase R预处理的情况下，并使用不同量的总RNA输入（1至4 µg）。最后，比较了多种组织类型，包括肝脏、肺、淋巴结和胰腺，以及多个脑区，包括小脑、下顶叶、中颞回、枕叶皮层和上额回，以评估circRNA在不同组织类型中的丰度。利用六种不同的circRNA检测工具（find_circ、CIRI、Mapsplice、KNIFE、DCC和CIRCexplorer）对生成的RNA-seq数据进行分析，结果表明，采用链特异性总RNA文库制备试剂盒，结合RNase R预处理和4 µg RNA输入，是鉴定最多相对数量circRNA的最优方法。与先前研究结果一致，与其他组织类型相比，脑组织中circRNA的富集程度最高。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

环状RNA（circRNA）是一类内源性非编码RNA，因其在真核生物转录组中广泛表达而受到关注1,2,3。它们由外显子反向剪接相互连接形成，因此最初被认为是剪接过程中的副产物4,5。然而，近期研究表明，circRNA在细胞类型、组织和发育阶段中具有特异性表达特征3,6，并且在进化上具有保守性2,3。此外，circRNA还参与介导蛋白质-蛋白质相互作用7、微小RNA（miRNA）结合3,8,9,10，以及调控亲本基因的转录11。

在传统的RNA测序（RNA-seq）中，由于mRNA的poly-A筛选步骤，环状RNA（circRNA）可能在文库构建过程中完全丢失，或因其丰度极低而难以分离。然而，近期的circRNA表征研究已引入RNase R预处理步骤，以富集circRNA2,12,13。RNase R是一种外切核糖核酸酶，可降解线性RNA，而保留环状RNA结构。通过比较两种市售的全转录组文库构建试剂盒（有或无RNase R预处理步骤）在不同总RNA投入量（1至4 µg）下的数据，优化了circRNA富集方案。随后，采用优化后的方案评估了五种不同脑区（小脑[BC]、下顶叶[IP]、中颞回[MG]、枕叶皮层[OC]和额上回[SF]）以及四种其他组织类型（肝脏[LV]、肺[LU]、淋巴结[LN]和胰腺[PA]）中circRNA的丰度。RNA-seq文库采用双端测序，数据通过六种不同的circRNA预测算法进行分析：find_circ3、CIRI14、Mapsplice15、KNIFE16、DCC17和CIRCexplorer18。根据我们的分析，当使用链特异性总RNA文库制备试剂盒、结合RNase R预处理并投入4 µg总RNA时，检测到的唯一circRNA数量最多。本文描述了该优化方案。与先前报道一致19,20，与其他组织类型相比，脑组织中circRNA的富集程度最高。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究严格遵守所有机构、国家和国际关于人类福利的指南。脑组织来自位于亚利桑那州太阳城的班纳太阳健康研究所脑与身体捐赠项目。该脑与身体捐赠项目的运行已获得西方机构审查委员会批准（WIRB 方案编号：20120821）。所有受试者或其法定代理人均已签署知情同意书。商业来源（非脑组织）生物样本购自 Proteogenex 公司。

1. RNase R 处理

注意： 在以下步骤中，将反应体系调整至总体积为 50 µL。这是进行 RNA 纯化时所需使用的最小样本体积。 & 浓缩试剂盒（参见 材料清单）。此外，此处描述的优化方案适用于4 µg总RNA的起始量。对于起始量较少的样本，建议延长RNase R处理的孵育时间 >4 µg

  1. 在微量离心管中，将总RNA用无RNase的水稀释至4 µg，总体积为39 µL，用移液器吹打混匀。
  2. 在另一支离心管中，用1× RNase R反应缓冲液将RNase R稀释至工作浓度2 U/µL。现配现用，仅配制即时所需的量。
  3. 将39 µL总RNA和5 µL 10x RNase R反应缓冲液移入1.5 mL反应管中，用移液器充分混匀（总体积为50 µL）。随后加入6 µL RNase R（2 U/µL）。
  4. 将移液器调节至总反应体积（50 µL），并上下吹打10次以充分混匀。
  5. 将试管置于37 °C水浴中10分钟。确保整个反应体系完全浸入水浴中。
  6. 将离心管置于冰上，并立即进行RNA纯化步骤 & 浓度（第2节）

2. 使用RNA纯化与浓缩试剂盒纯化RNA

注意：使用高质量 RNA（RIN>8，DV200>80%）时，RNase R 处理可能导致约 60% 的 RNA 损失。若起始量为 4 µg，经第 1 部分处理后预计剩余 2–2.5 µg 处理后的 RNA。

  1. 开始前，通过加入48 mL的100%乙醇至缓冲液浓缩液中，使用移液器充分混匀，配制RNA洗涤缓冲液。将纯化柱放入收集管中（见材料表），并置于试管架上。
    注意：后续所有步骤均使用以下离心条件：10,000–16,000 x g。若已进行DNase I处理，则跳过本步骤中的DNase I处理。
  2. 向经RNase R处理的样品中加入2倍体积的RNA结合缓冲液，并用移液器充分混匀（总体积：150 µL）。
  3. 向RNA结合缓冲液与RNase R处理样品的混合物中加入1倍体积的100%乙醇，并用移液器充分混匀（总体积：300 µL）。
  4. 将全部液体转移至纯化柱中，离心30秒，弃去穿流液。
  5. 直接向纯化柱中加入400 µL RNA Prep缓冲液，离心30秒，弃去穿流液。
  6. 直接向纯化柱中加入700 µL RNA洗涤缓冲液，离心30秒，弃去穿流液。
  7. 直接向纯化柱中加入400 µL RNA洗涤缓冲液，离心2分钟，然后将纯化柱转移至新的无RNase的1.5 mL离心管中。
  8. 将11 µL无RNase的水直接加入纯化柱中，移液枪头应悬于纯化柱滤膜正上方，确保液体仅滴加在滤膜上。
  9. 室温孵育1分钟，然后离心1分钟。
  10. 弃去纯化柱前，检查无RNase离心管中是否有洗脱液。若洗脱成功，可将样品储存于-80 °C，或立即进行文库构建。最终洗脱体积约为10 µL，用于文库构建。
    注意：暂停点：RNA可在-80 °C保存最多7天后再进行文库构建。

3. circRNA 文库构建

注意：本节所用大多数试剂均包含在试剂盒中，详见材料表。

  1. rRNA 耗竭与片段化
    1. 从步骤 2.10 中取出 10 µL 纯化的 RNA，转移至新的 96 孔 0.3 mL PCR 板的洁净孔中。向孔中加入 5 µL rRNA 结合缓冲液，随后加入 5 µL rRNA 去除混合液。轻轻吹打 10 次以充分混匀。
    2. 密封反应板，并在预设并预热的热循环仪模块上于 68 °C 孵育 5 分钟。完成 5 分钟孵育后，将反应板置于实验台，室温孵育 1 分钟。
    3. 移除密封膜。向样品中加入 35 µL 经涡旋混匀的室温 rRNA 去除磁珠。将移液器调整至 45 µL，吹打 10–20 次以彻底混匀。室温孵育 1 分钟。
    4. 将反应板转移至磁力架，孵育 1 分钟或直至溶液澄清。将全部上清液（约 45 µL）转移至同一反应板上的新孔或另一新反应板（根据处理的样品数量决定）。
    5. 涡旋 RNA 纯化磁珠（见材料表），直至充分分散，然后向每个样品中加入 99 µL 磁珠。吹打 10 次以混匀。室温孵育 10 分钟。
    6. 将反应板转移至磁力架，继续孵育 5 分钟或直至溶液澄清。移除并弃去孔中全部上清液。
    7. 保持反应板在磁力架上，向孔中加入 200 µL 新配制的 80% 乙醇，避免扰动磁珠。孵育 30 秒后，移除并弃去乙醇。重复一次，共洗涤两次。
    8. 向每个孔中加入 11 µL 洗脱缓冲液，吹打 10 次以混匀。室温孵育 2 分钟，然后将反应板置于磁力架上，直至溶液澄清（1–5 分钟）。
    9. 将孔中 8.5 µL 上清液转移至同一反应板或新反应板中的新孔。向每个含样品的孔中加入 8.5 µL 洗脱液、引物、高浓度片段化混合液。吹打 10 次以充分混匀。
    10. 密封反应板，并在预设并预热的热循环仪模块上于 94 °C 孵育 8 分钟。当温度降至 4 °C 时从热循环仪中取出，并短暂离心。
      注意：立即进入合成第一链 cDNA 方案。
  2. 合成 cDNA
    1. 针对每个待处理的样品，将 9 µL 第一链合成混合液与 1 µL 逆转录酶（见材料表）混合。向样品中加入 8 µL 混合液。吹打 6 次以混匀。
      1. 密封反应板，并在预设并预热的热循环仪模块上按以下参数孵育：25 °C 孵育 10 分钟，42 °C 孵育 15 分钟，70 °C 孵育 15 分钟，4 °C 保持。完成后立即进入第二链合成步骤。
    2. 向每个样品中加入 5 µL 重悬缓冲液，随后加入 20 µL 第二链标记预混液。将全部液体吹打 6 次以混匀。
    3. 密封反应板，并在预设并预热的热循环仪模块上于 16 °C 孵育 1 小时。孵育结束后，从热循环仪中取出反应板，使其恢复至室温。
    4. 涡旋 PCR 纯化磁珠（见材料表），向每个样品孔中加入 90 µL 磁珠。吹打 10 次以充分混匀。室温孵育 10 分钟。
    5. 将磁珠/样品混合液转移至磁力架，孵育 5 分钟或直至液体澄清。移除并弃去上清液。
    6. 向每个样品中加入 200 µL 80% 乙醇。将样品在磁力架上室温孵育 30 秒。弃去上清液。重复一次。
    7. 让磁珠在室温下干燥 6 分钟，然后从磁力架上取下。
    8. 用 19.5 µL 重悬缓冲液重悬磁珠。吹打 10 次以充分混匀。室温孵育 2 分钟，然后转移至磁力架，继续孵育 1 分钟或直至液体澄清。
    9. 将 17.5 µL 上清液转移至新孔或新反应板。
      注意：若不立即进行后续操作，样品可在 -20 °C 保存最多 7 天。
  3. 文库构建
    1. 向每个含上清液的孔中加入 12.5 µL A-尾化混合液。将全部液体吹打 10 次以混匀。
    2. 将反应置于预设并预热的热循环仪模块上，设置为 37 °C，按以下参数孵育：37 °C 孵育 30 分钟，70 °C 孵育 5 分钟，4 °C 保持。当样品温度降至 4 °C 后，立即进入接头连接步骤。
    3. 向每个样品中加入 2.5 µL 重悬缓冲液、2.5 µL 特异性 RNA 接头和 2.5 µL 连接混合液。吹打 10 次以混匀。
    4. 将样品在预设并预热的热循环仪模块上于 30 °C 孵育 10 分钟。
    5. 向每个样品中加入 5 µL 终止连接缓冲液，吹打混匀。
    6. 向每个样品中加入 42 µL 混合均匀的 PCR 纯化磁珠，并充分混匀。按照步骤 3.2.6 至 3.2.10 操作，但将重悬体积调整为 52 µL，最终洗脱体积调整为 50 µL。
    7. 使用步骤 3.3.6 中获得的 50 µL 洗脱液再次重复 PCR 纯化磁珠方案，但将重悬体积调整为 22 µL，最终洗脱体积调整为 20 µL。
      注意：若不立即进行后续操作，样品可在 -20 °C 保存最多 7 天。
    8. 向每个样品中加入 5 µL PCR 引物混合液和 25 µL PCR 预混液。吹打 10 次以混匀。将反应置于预设并预热的热循环仪模块上，按以下参数孵育：98 °C 预变性 30 秒；随后进行 8 个循环（98 °C 变性 10 秒，60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒）；然后 72 °C 延伸 5 分钟，4 °C 保持。
      注意：可能需要优化 PCR 循环总数，以获得足够量的文库用于测序。
    9. 按照 PCR 磁珠纯化方案（步骤 3.2.4 至 3.2.9），但加入 50 µL 充分混匀的 PCR 纯化磁珠，并将重悬体积调整为 32.5 µL，最终洗脱体积为 30 µL。
      注意：样品应保存于 -20 °C。
  4. 使用核酸分析仪进行定量与质量控制
    1. 将胶带和试剂在室温下平衡 30 分钟。
    2. 将 2 µL 文库与 2 µL HS D1000 缓冲液混合，加入适配的微孔板中。
    3. 使用适配的铝箔密封膜严密封口，并在 2,000 rpm 下涡旋 1 分钟。
    4. 短暂离心后，根据软件提示将微孔板装入分析仪。
      注意：文库大小应约为 260 bp。

4. 数据分析工作流程

  1. 对RNA-seq文库进行测序（参见材料表），生成82 bp的双端测序读长。使用bcl2fastq工具（v0.2.19）将碱基识别文件（.bcl）形式的原始测序数据转换为FASTQ格式。
  2. 检测环状RNA（circRNA）。
    注意：根据先前报道的证据，集成多种方法的circRNA检测策略相较于单一检测工具具有更优性能21,22，因此我们建议采用多个工具进行circRNA检测。本研究中使用了六种现有的circRNA预测算法：find_circ、CIRI、CIRCexplorer、Mapsplice、KNIFE和DCC，并分别应用各算法推荐的参数设置。
    1. 根据开发者提供的说明，在Linux高性能计算集群上下载并安装每种circRNA检测算法。
    2. 使用各工具推荐的比对程序，将RNA-seq的FASTQ数据比对至参考基因组（GRCh37）。
    3. 完成比对后，按照各工具推荐的参数设置运行circRNA检测算法。
    4. 每个工具将输出一个包含多列信息的结果文件，列出所检测到的circRNA；从中提取circRNA的基因组坐标及其支持读段数量，以量化每个样本/实验条件下检测到的候选circRNA数量。
  3. 将CIRI、Mapsplice和DCC输出的circRNA坐标转换为0-based坐标系统，以与其他三种算法保持一致。
  4. 筛选出支持读段数不少于2的circRNA用于后续分析与比较。表1总结了本研究中评估的所有参数，以及每个样本生成的测序读段总数。
  5. 针对每个样本/实验条件，计算检测到的circRNA数量，并以每百万比对读段为单位进行标准化。按照代表性结果部分所述，使用箱线图对不同工具/样本间的结果进行汇总展示。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

首先评估了使用市售的通用对照RNA（UC）以及两种文库制备试剂盒（其方案中均包含核糖体RNA去除步骤）所产生的数据。通过分析流程（数据分析流程，第4节）发现，总体而言，与Kapa试剂盒相比，TruSeq数据集中检测到更多的环状RNA（circRNA）（图1）。尽管在较低起始量（1、2 µg）条件下，两种试剂盒数据集的核糖体RNA（rRNA）比例均低于5%，但在4、5和10 µg起始量时，Kapa试剂盒数据集的rRNA含量更高（表2）。因此，综合考虑检测到的circRNA数量及rRNA去除效率，后续实验选用TruSeq试剂盒进行。

接下来，通过比较经RNase R预处理和未经预处理的文库所产生的数据，检验RNase R预处理的重要性。为此，从健康老年人的腮腺（MG）中提取总RNA，并比较了经RNase R预处理（N = 3）和未经预处理（N = 3）文库的测序数据23。与未经预处理的文库相比，预处理文库中 consistently 检测到更多的...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究测试了两种市售的文库构建试剂盒、不同的预处理方案以及不同量的输入RNA，旨在优化环状RNA（circRNA）富集流程，以用于构建circRNA测序文库。根据本研究的评估结果，构建circRNA测序文库过程中多个关键方面和关键步骤得以明确。我们的评估证实了RNase R预处理的有效性，表现为检测到的circRNA数量增加。总体而言，使用Illumina TruSeq文库试剂盒、结合RNase R预处理并输入4 µg RNA时，观察到circRNA的多样性更高。这些结果与先前研究一致，表明RNase R富集步骤有助于circRNA的检测2。

环状RNA文库构建的其他关键因素包括可用于测序的总RNA量以及提取RNA的组织类型。尽管研究发现使用4 µg的总RNA作为起始量可检测到最多的环状RNA，但大多数RNA测序研究通常使用<=1 µg的总RNA，因此获得更高数量的RNA可能具有挑战性，尤其是在分析人类样本时尤为如此。虽然较低的起始量仍可实现环状RNA的鉴定，但需注意的是，分析的特异性可能会受到影响。本研究进一步强调了与其它组织...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢亚利桑那州太阳城的Banner Sun健康研究所脑与身体捐赠计划（BBDP）提供人脑组织。BBDP得到了美国国家神经疾病与卒中研究所（U24 NS072026 帕金森病及相关疾病国家脑与组织资源中心）、国家老龄化研究所（P30AG19610 亚利桑那阿尔茨海默病核心中心）、亚利桑那州卫生服务部（合同号211002，亚利桑那阿尔茨海默病研究中心）、亚利桑那州生物医学研究委员会（合同号4001、0011、05-901和1001，亚利桑那帕金森病联盟）以及迈克尔·J·福克斯帕金森病研究基金会27的支持。本研究还得到了卫生与公共服务部及亚利桑那州政府（ADHS资助号 ADHS14-052688）的支持。我们还感谢Andrea Schmitt（Banner研究所）和Cynthia Lechuga（TGen）在行政事务方面的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,000 µL 移液器吸头RaininGP-L1000F
20 µL 移液器吸头RaininSR L 10F
200 µL 移液器吸头RaininSR L 200F
2200 TapeStation 配件（铝箔盖）Agilent Technologies5067-5154
2200 TapeStation 配件（吸头）Agilent Technologies5067-5153
微孔板用粘性封膜VWR60941-064
AMPure XP 磁珠 450 mLBeckman CoulterA63882PCR 纯化
Eppendorf twin.tec 96 孔 PCR 板VWR951020401
高灵敏度 D1000 试剂Agilent Technologies5067-5585
高灵敏度 D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
HiSeq 2500 测序系统IlluminaSY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE 桥式扩增试剂盒IlluminaPE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS 试剂盒（150 个循环）IlluminaFC-410-1002
HiSeq 4000 测序系统IlluminaSY-401-4001
HiSeq PE Rapid 桥式扩增试剂盒 v2IlluminaPE-402-4002
HiSeq Rapid SBS 试剂盒 v2（50 个循环）IlluminaFC-402-4022
Kapa 总 RNA 试剂盒RocheKK8400
分子生物学级乙醇Fisher ScientificBP28184
Qubit 检测管Thermo Fischer 供应中心Q32856
Qubit dsDNA 高灵敏度检测试剂盒Thermo Fischer 供应中心Q32854
RNA 纯化与浓缩试剂盒 - 5ZymoRCC-100包含纯化柱和收集管
RNAClean XP 磁珠Beckman Coulter GenomicsRNA 纯化磁珠
Rnase RLucigenRNR07250
SuperScript II 逆转录酶 10,000 单位ThermoFisher (LifeTech)18064014
TapeStation 2200Agilent Technologies核酸分析仪
TElowEVWR10128-588
TruSeq Stranded 总 RNA 文库制备试剂盒Illumina20020596第 3 节中使用的试剂盒
双室分隔托盘VWR3054-1004
UltraPure 水Thermo Fischer 供应中心10977-015
通用对照 RNAAgilent740000

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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