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方法文章

一种通过抗体饲喂法研究分离原代海马神经元培养中谷氨酸受体转运的方法

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DOI：

10.3791/59982

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2019年8月2日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Cellular Neurophysiology, Institute of Physiology CAS

本文内容

摘要

本文介绍了一种在分离的原代海马神经元培养物中研究谷氨酸受体（GluR）转运的方法。该方法结合使用抗体标记技术对内源性或过表达的受体进行标记，并联合药理学手段，通过调控受体的内吞或再循环过程，从而鉴定调节GluR表面表达的分子机制。

摘要

细胞对外部刺激的反应在很大程度上依赖于特定时刻细胞表面所表达的受体种类。因此，细胞表面受体的群体处于持续动态调整中，并受到严格调控机制的控制。生物学中一个典型的范例且被广泛研究的运输事件，是突触部位谷氨酸受体（GluRs）表达的调控。GluRs介导中枢神经系统中绝大多数兴奋性神经传递，并调控突触和神经元水平上依赖生理活动的功能性与结构性变化（例如突触可塑性）。细胞表面表达的GluRs在数量、定位及亚基组成上的改变会深刻影响神经元功能，事实上，这些因素的异常与多种神经病理疾病相关。本文介绍一种用于研究离体海马初级神经元中GluR运输的方法。采用"抗体孵育"技术，可区分性地观察细胞表面与胞内膜上表达的GluR群体。通过对活细胞表面受体进行标记，并在不同时间点固定细胞，以允许受体发生内吞和/或再循环，从而评估并选择性研究这些运输过程。该方法具有良好的灵活性，可与药理学干预或突变受体过表达等手段联合使用，以获取有关影响GluR运输的刺激因素及分子机制的重要信息。同样，该方案也可轻松改造用于研究其他受体或细胞表面表达的蛋白质。

引言

细胞利用主动的转运过程将蛋白质运输至特定的亚细胞位置，从而对其功能进行严格的时空调控1。这一过程对于跨膜受体尤为重要，因为细胞对不同环境刺激的响应依赖于受体激活所触发的细胞内级联反应。细胞能够通过调控受体的亚细胞转运，改变细胞表面受体的密度、定位和亚基组成，从而调节这些响应2。新合成受体插入质膜，以及现有受体的内吞和再循环，都是决定细胞表面受体总量的转运过程实例2。多种分子机制协同调控蛋白质转运，包括蛋白质-蛋白质相互作用以及磷酸化、泛素化或棕榈酰化等翻译后修饰2。

受体运输的调控在具有高度特化结构的强极性细胞中尤为重要。典型的例子是通过谷氨酸受体（GluRs）的调控运输来控制神经元功能3,4。谷氨酸作为主要的兴奋性神经递质，可结合并激活细胞表面表达的GluRs，从而调控突触神经传递和突触可塑性等基本的神经元生理功能。已有研究发现，在从神经发育障碍到神经退行性疾病等多种神经病理过程中均存在GluR运输异常，这凸显了该过程的重要性5。因此，阐明调控GluR运输的分子机制在多个研究领域中均具有重要意义。

在本实验方案中，采用基于抗体标记的方法来定量原代海马神经元表面表达的谷氨酸受体（GluRs）水平，并评估内吞和再循环过程的变化如何导致观察到的净表面表达量改变。通过使用药理学手段和/或过表达携带特定突变的外源性受体，使该方案成为研究神经元适应不同环境刺激背后分子机制的强有力方法。该方案另一个应用实例是，通过检测疾病模型等复杂环境变化条件下受体的表面表达情况，研究多因素环境改变对GluR转运的影响。

首先通过具体实例演示药理学操作如何模拟生理性突触刺激[化学性长时程增强（cLTP）]，从而增加内源性AMPA型谷氨酸受体（AMPARs）GluA1亚基在细胞表面的表达6。此外，还分析了过表达的NMDA型谷氨酸受体（NMDARs）GluN2B亚基的磷酸化模拟突变体的转运情况，以说明本方案可用于研究特定翻译后修饰对谷氨酸受体转运的调控作用。尽管本文使用了这些具体示例，但该方案可轻松应用于其他具有抗原性胞外结构域的谷氨酸受体及其他受体和蛋白质。若缺乏针对胞外结构域的抗体，可通过过表达带有胞外表位标签（如Flag、Myc、GFP等标签）的蛋白来辅助蛋白标记。

本方案提供了使用特异性抗体定量特定GluR亚型密度和转运的方法。该方案可用于研究：1）GluR的总表面表达水平，2）GluR的内化过程，以及3）GluR的再循环过程。为分别研究上述各个过程，建议首先进行第1和第2部分操作，然后依次选择第3、第4或第5部分进行；所有情况下，最后均需完成第6和第8部分（图1）。

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方案

与海马体原代培养制备相关的工作已通过西北大学动物护理与使用委员会的审查和批准（方案编号 #IS00001151）。

1. 标记前的准备

  1. 原代海马神经元培养物的制备与维持
    1. 将原代海马神经元以每18 mm盖玻片150,000个细胞的密度接种于聚-D-赖氨酸包被（0.1 mg/mL）的盖玻片上。有关解离神经元培养制备的优秀指南已有文献报道7,8。
      注意：如有需要，可在培养过程中使用阿糖胞苷（Ara-C，自体外培养第1天起使用10 μM）处理，以避免胶质细胞增殖。
      注意：可使用其他包被试剂替代聚-D-赖氨酸，例如纤连蛋白（1 mg/mL）或层粘连蛋白（5 μg/mL）。
    2. 将培养物置于含B27和2 mM L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基中（每孔2 mL），在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中维持培养。
      注意：如有需要，可使用L-谷氨酰胺的替代物（如Glutamax）。
    3. 每周更换一半体积的培养基，并补充等体积的含添加剂的Neurobasal培养基。
  2. 可选步骤：突变型和/或表位标签受体的转染
    注意：    为确保受体充分表达，神经元应在分析时间点前至少3–4天进行转染。使用较年轻的神经元[体外培养第6–9天（DIV6–9）]比使用较老的神经元（DIV15–20）具有更高的转染效率，但无论采用何种体外培养天数，均可获得足够数量的转染细胞（>20）。
    1. 对于12孔板中的每一孔，取1.5 μg含有目标构建物的质粒DNA，溶于100 μL不含B27和谷氨酰胺的新鲜Neurobasal培养基中，置于微量离心管内，快速涡旋混匀。
      注意：为实现高效转染，所用Neurobasal培养基应尽可能新鲜，理想情况下为开瓶后一周内。
    2. 在另一微量离心管中，将1 μL适当的脂质体转染试剂加入100 μL新鲜Neurobasal培养基中，轻轻混匀。
      注意：切勿涡旋脂质体转染试剂混合液。使用新鲜的脂质体转染试剂可提高转染效率。
    3. 室温（RT）孵育5分钟。
    4. 将脂质体转染试剂混合液逐滴加入DNA混合液中，轻轻混匀后，室温孵育20分钟。
    5. 将每孔中的培养基体积调整为1 mL条件培养基。
    6. 将脂质体转染试剂-DNA复合物逐滴加入孔中。
    7. 将细胞放回培养箱，至少培养3–4天以进行蛋白表达。
      注意：针对下文所述的内吞与再循环实验方案，本研究中在体外培养第11–12天（DIV11–12）对海马神经元转染表达胞外结构域带有GFP标签的GluN2B（GFP-GluN2B）的质粒，并于体外培养第15–16天（DIV15–16）进行成像观察。
  3. 可选步骤：在固定前，于条件培养基中对细胞进行药物处理（慢性或急性）
    注意：    对于急性处理，应在标记前开始给药。根据所用药物处理方案的不同，细胞可在第2部分操作期间持续维持在含药物的培养基中。在本示例中，体外培养第21天（DIV21）的细胞接受了化学性长时程增强（cLTP）处理，以增加膜表面表达的AMPAR9。
    1. 将条件培养基更换为细胞外溶液（ECS）。
    2. 在室温下，用含300 μM甘氨酸的ECS处理细胞3分钟。作为对照，用不含甘氨酸的ECS处理另一块平行的盖玻片。
    3. 用37 °C的ECS洗涤细胞3次，随后将细胞置于不含甘氨酸的ECS中，放回细胞培养箱孵育20分钟，然后继续进行第2部分操作。
      注意：ECS成分（单位为mM）：150 NaCl、2 CaCl2、5 KCl、10 HEPES、30 葡萄糖、0.001 TTX、0.01 士的宁和0.03 毕克毒素，pH调至7.4。

2. 细胞表面表达受体的活体标记

  1. 准备盖玻片用于标记
    1. 为节约试剂并便于操作，将细胞面向上的盖玻片转移至覆盖有石蜡膜的托盘中。
      注意：必须确保样品始终不干燥。
    2. 将预孵育培养基保存并在 37 °C 条件下维持，用于后续孵育和洗涤步骤。
      注意：对于直径 18 mm 的盖玻片，建议抗体标记时使用 75–100 μL 培养基，内化/再循环实验时使用 120–150 μL。
  2. 用一抗标记细胞表面受体
    1. 将细胞与用预孵育培养基稀释的一抗在室温下孵育 15 分钟。
      注意：对于 GFP 标签的受体，使用 1:1000 稀释倍数的兔抗 GFP 抗体；对于内源性 GluA1，使用 1:200 稀释倍数的鼠抗 GluA1 抗体。
    2. 使用真空移液器小心吸除含抗体的培养基，并用预孵育培养基洗涤细胞三次。
      注意：若无预孵育培养基，所有洗涤步骤均可使用 PBS+ [含 1 mM MgCl2 和 0.1 mM CaCl2 的磷酸盐缓冲液 (PBS)] 进行。如无温和的真空抽吸设备，可使用移液枪手动吸除液体。

3. 表面表达（图2）

  1. 细胞表面表达受体的二抗标记
    1. 用 PBS+ 洗涤一次。
    2. 将细胞在含 4% 多聚甲醛（PFA）和 4% 蔗糖的 PBS 中孵育 7–8 分钟以固定细胞。
      注意：与其他固定方法（如甲醇孵育）不同，PFA 不会穿透细胞膜，因此适用于细胞表面表达分析。为获得最佳效果，应使用新鲜配制的 PFA。短期可在 4 °C 保存，或长期（最长 30 天）在 -20 °C 保存，均可满足有效固定需求。
      警告：PFA 是已知的致癌物。操作时须佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱中进行。
    3. 用普通 PBS 洗涤细胞三次。
      注意：也可使用 0.1 M 甘氨酸代替 PBS 洗涤 PFA，因为甘氨酸可淬灭任何残留的固定剂，从而降低样本背景信号。
    4. 在 PBS 中加入 10% 正常山羊血清（NGS），室温孵育 30 分钟以封闭非特异性结合位点。
      注意：延长封闭时间不会对标记效果产生不利影响。
    5. 将荧光标记的二抗用含 3% NGS 的 PBS 稀释后，室温孵育 1 小时，以标记已结合一抗的受体（即细胞表面表达的受体）。
      注意：在这些示例中，使用了 1:500 稀释度的 Alexa 555 标记二抗：针对 GFP 标记受体使用山羊抗兔 IgG，针对 GluA1 使用山羊抗小鼠 IgG。
    6. 用 PBS 洗涤细胞 3 次。
  2. 细胞内受体的标记
    1. 用含 0.25% Triton X-100 的 PBS 在室温下处理细胞 5–10 分钟以实现细胞通透。
      注意：为验证前一轮抗体标记已占据所有细胞表面表位，可在平行培养的样本中省略此通透步骤。在此情况下，不应检测到细胞内受体信号。此外，为验证在前述第 2 节中未发生细胞内受体的标记（即证明培养细胞的细胞膜完整性良好），也可在平行样本中省略通透步骤，并在步骤 2.2.1 中使用针对细胞内蛋白的一抗（例如 PSD-95 或 MAP2）。在此条件下，该一抗不应产生任何信号。本示例中使用了 1:500 稀释的兔抗 PSD-95 抗体。
    2. 用含 10% NGS 的 PBS 在室温下封闭 30 分钟。
    3. 将已通透的细胞与第 2.2 节中使用的相同一抗，用含 3% NGS 的 PBS 稀释后，室温孵育 1 小时，以标记细胞内受体。
      注意：用于标记细胞内受体的一抗稀释度可能与标记细胞表面受体时不同。以 GluA1 为例，本实验中使用了相同的抗体稀释度（1:200）。
    4. 用 PBS 洗涤细胞 3 次。
    5. 将第二种荧光标记的二抗用含 3% NGS 的 PBS 稀释后，室温孵育 1 小时进行标记。
      注意：在这些示例中，使用了 1:500 稀释的 Alexa 647 标记山羊抗小鼠二抗（用于 GluA1）。
    6. 用 PBS 洗涤细胞 3 次。

4. 内化作用（图3）

  1. 抗体标记的膜表面受体内化
    1. 在完成膜表面表达受体的标记并洗去抗体后（见第2.2节），将细胞置于不含抗体的条件培养基中，并放回培养箱（37 °C）以促进内化过程。
      注意：对于NMDA受体，建议内化时间为30分钟。作为对照，可将平行培养的细胞在内化过程中置于4 °C的条件培养基中。在此低温条件下，受体的内化应极少发生。
  2. 膜表面受体的标记
    1. 用PBS+洗涤细胞一次。
    2. 用含4% PFA和4%蔗糖的PBS固定细胞，持续7–8分钟。
      注意：操作PFA时应佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱中进行。
    3. 用普通PBS洗涤细胞3次。
    4. 用含10% NGS的PBS在室温下封闭30分钟，以防止非特异性结合。
    5. 将样品与荧光标记的二抗在含3% NGS的PBS中稀释后，在室温下孵育1小时，以标记已结合一抗的受体（即未发生内化的膜表面表达受体）。
      注意：本示例中使用了Alexa 555标记的山羊抗兔二抗（1:500）进行标记。
    6. 用PBS洗涤细胞3次。
  3. 内化受体的标记
    1. 用含0.25% Triton X-100的PBS对细胞进行透化处理，持续5–10分钟。
    2. 用含10% NGS的PBS在室温下孵育30分钟，以阻断非特异性结合。
    3. 将样品与荧光标记的二抗在含3% NGS的PBS中稀释后，在室温下孵育1小时，以标记已内化的抗体结合受体。
      注意：本示例中使用了Alexa 647标记的山羊抗兔二抗（1:500）进行标记。
    4. 用PBS洗涤细胞3次。

5. 回收利用（图4）

  1. 抗体标记表面受体的内化
    1. 在完成表面表达受体的标记并洗去抗体后（见第2.2节），将细胞维持在无抗体的条件培养基中，并放回培养箱（37 °C）以允许受体内化。
      注意：对于NMDA受体，建议内化时间为30分钟。
  2. 封闭稳定表达于细胞表面的受体
    1. 为了封闭未内化的、已结合初级抗体的表面受体上的表位，将细胞与未标记的Fab抗IgG（H+L）抗体片段（针对第2.2节中使用的初级抗体）在条件培养基中稀释（20 μg/mL）后孵育20分钟（室温）。该处理可防止后续与二抗发生相互作用。
      注意：本示例中使用了山羊抗兔Fab片段。
      注意：对照实验：为确保表面表达受体被完全封闭，可将平行的盖玻片分别在有或无Fab片段的条件下孵育。Fab处理后立即固定细胞，并将两组样品均与Alexa 555标记的二抗孵育。若在含Fab片段孵育的细胞中未检测到Alexa 555信号，则表明抗体封闭成功。
    2. 用条件培养基洗涤细胞3次。
    3. 将细胞与含有80 μM dynasore的条件培养基孵育，以阻止进一步的内化，并将细胞放回培养箱（37 °C）以允许内化受体的再循环。Dynasore是一种GTP酶抑制剂，可抑制dynamin功能，从而阻断内化过程。
      注意：建议NMDAR再循环时间为45分钟。需注意，Dynasore仅特异性阻断dynamin依赖性的内化过程（例如NMDAR的内化），而其他突触蛋白的dynamin非依赖性内化仍可在Dynasore存在下发生。
  3. 再循环受体的标记
    1. 用PBS+洗涤细胞一次。
    2. 用含4%多聚甲醛（PFA）和4%蔗糖的PBS固定细胞7–8分钟。
      注意：操作PFA时应佩戴适当的个人防护装备并在通风橱中进行。
    3. 用PBS洗涤细胞3次。
    4. 用含10%正常山羊血清（NGS）的PBS在室温下封闭30分钟，以防止非特异性结合。
    5. 将细胞与第一种荧光标记的二抗在含3% NGS的PBS中稀释后，在室温下孵育1小时进行标记。
      注意：本示例中使用了Alexa 555标记的山羊抗兔抗体（1:500）进行标记。
    6. 用PBS洗涤细胞3次。
      注意：延长PBS洗涤时间（5–10分钟）可能有助于降低背景信号。
  4. 内化受体的标记
    1. 用含0.25% Triton X-100的PBS对细胞进行透化处理，持续5–10分钟。
    2. 用含10% NGS的PBS在室温下封闭30分钟。
    3. 将细胞与第二种荧光标记的二抗在含3% NGS的PBS中稀释后，在室温下孵育1小时进行标记。
      注意：本示例中使用了Alexa 647标记的山羊抗兔抗体（1:500）进行标记。
    4. 用PBS洗涤细胞3次。

6. 样品的封片与成像

  1. 将盖玻片细胞面朝下，轻轻放置在 12–15 μL 适当的封片剂上，完成封片。
    注意：吸除多余的封片剂可提高成像质量。
  2. 使用合适的共聚焦显微镜对细胞进行成像。
    注意：建议以 60 倍放大倍数、0.35 μm 步长采集贯穿整个神经元厚度的 z 轴层扫图像。

7. 时间考量

  1. 这是一个较长的实验方案，可在多个步骤暂停。如有需要，可在 4 °C 湿润盒中进行封闭和一抗孵育过夜。
  2. 或者，如有需要，可使用微波组织处理仪显著缩短固定后孵育时间。所有步骤均使用 150 W、30 °C 的“开启”设置。
    1. 封闭时，运行程序为“开启”2 分钟，“关闭”1 分钟，再“开启”2 分钟。
    2. 一抗和二抗孵育步骤，运行程序为“开启”3 分钟，“关闭”2 分钟，再“开启”3 分钟。
      注意：上述对实验方案的修改未观察到质量差异。

8. 图像分析

  1. 建议使用 FIJI <https://fiji.sc/> 进行图像分析，因为它兼容多种文件格式。对于我们的数据，图像是以尼康 ND2 文件格式获取的。
  2. 提供了一个宏脚本，以便对 FIJI 预先选定的不同参数进行批量量化。该宏包含以下步骤：
    注意： 在这些示例中，测量的是“积分光密度”。
  3. 在 FIJI 中打开图像文件并分离各通道。
  4. 对每个通道的图像堆栈进行 Z 轴投影，采用最大强度投影法。
  5. 为每个通道设置下限阈值。
    注意： 阈值应根据每组实验数据通过经验确定。虽然每个通道可以具有不同的下限阈值，但必须确保同一数据集中所有图像的通道阈值保持一致。
  6. 选择三到五根二级或三级树突，并将其保存为感兴趣区域（ROIs）。
  7. 测量每个 ROI 在表面通道和细胞内通道中的积分密度。
  8. 通过将表面通道的积分密度值除以细胞内通道的积分密度值，对每个 ROI 的信号进行归一化处理。
  9. 对所有对照组和实验组图像重复上述测量，并将实验组数值相对于对照组数值进行归一化（例如 GluN2B WT 或无甘氨酸条件）。

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结果

本研究谷氨酸受体转运的实验方案基于对细胞表面表达的受体与细胞内膜表达的受体进行差异标记。通过在细胞膜透化前后分别标记受体，使用相同的初级抗体但结合不同荧光染料的次级抗体，从而实现区分。如本方案中包含的可选步骤所述，该方法在研究不同受体转运过程（如内化和再循环）方面具有高度灵活性，并可根据研究者的需要轻松调整（图1）。

首先，提供一种用于定量神经元表面表达受体的方法。该方案可用于定量基础状态下的表面表达水平，并研究不同药物或突变改变表面受体基础表达水平的分子机制。表面表达的受体首先通过在透化前孵育一抗和二抗进行标记。随后用0.25% Triton X-100进行透化处理，使细胞内受体池可被抗体标记。为演示该方案，分别在对照培养物以及化学性长时程增强（cLTP）诱导后，进行了AMPA受体（AMPARs）的表面与细胞内染色。具体而言，活细胞使用针对AMPAR GluA1亚基胞外表位的抗体进行标记，固...

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讨论

细胞与其环境之间的相互作用（例如与其他细胞的通讯、对不同刺激的响应等）在很大程度上依赖于细胞表面受体的正确表达。细胞表面受体含量的快速且精细的调控，使细胞能够对持续变化的环境做出适当的反应。对于神经元而言，突触部位表达的受体在数量、定位及亚基组成上的改变，会显著影响突触传递、突触可塑性、突触形成以及突触修剪3,5,10。因此，准确分析受体的表面表达及其调控机制是当前研究的重要课题。

研究受体表面表达的方法有多种。总体而言，这些方法可分为三大类：（i）生化分离表面表达的受体群体，（ii）成像技术以可视化表面受体，以及（iii）功能技术以监测受体激活后的效应。这些方法相互补充，可联合使用以解答有关受体表面表达的具体问题。

表面表达受体的生化分离示例包括培养细胞或脑片中的生物素标记实验方案，以及培养细胞或组织的亚细胞组分分离。

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披露

作者无任何披露信息。

致谢

我们感谢西北大学先进显微镜中心提供尼康A1共聚焦显微镜，并感谢他们在实验设计与分析过程中给予的帮助。本研究得到美国国家普通医学科学研究所（NIGMS，T32GM008061，A. M. C.）以及美国国家衰老研究所（NIA，R00AG041225）和脑与行为研究基金会NARSAD青年研究者奖的资助。 & 行为研究基金会 (#24133) (A. S. -C.)

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
18 mm 直径 #1.5 厚度盖玻片NeuvitroGG181.5
Alexa 555 标记的山羊抗小鼠二抗Life TechnologiesA21424
Alexa 555 标记的山羊抗兔二抗Life TechnologiesA21429
Alexa 647 标记的山羊抗小鼠二抗Life TechnologiesA21236
Alexa 647 标记的山羊抗兔二抗Life TechnologiesA21245
B27Gibco17504044
CaCl2SigmaC7902
Corning Costar 平底细胞培养板Corning3513
DynasoreTocris2897
葡萄糖SigmaG8270
甘氨酸Tocris0219
山羊抗兔 Fab 片段SigmaSAB3700970
HEPESSigmaH7006
KClSigmaP9541
L-谷氨酰胺SigmaG7513
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
小鼠抗 GluA1 抗体MilliporeMAB2263
NaClSigmaS6546
Neurobasal 培养基Gibco21103049
NGSAbcamAb7481
Parafilm 封口膜BemisPM999
PBSGibco10010023
Pelco BioWaveTed Pella36500
PFAAlfa Aesar43368
苦味毒Tocris1128
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐SigmaP7280
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Life TechnologiesP36934
兔抗 GFP 抗体InvitrogenA11122
兔抗 PSD-95 抗体Cell Signaling2507
士的宁Tocris2785
蔗糖SigmaS0389
Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisher12-550-15
Triton X-100SigmaX100
TTXTocris1078

参考文献

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