使用改性非缝合铐技术的宫颈主动脉移植模型

摘要

本文在宫颈鼠模型中采用非缝合袖口技术，提出了小鼠异位主动脉移植方案。该模型可用于研究慢性异体血管病（CAV）的基础病理学，并有助于评估新的治疗剂，以防止其形成。

摘要

随着强大的免疫抑制方案的引入，在预防和治疗急性排斥发作方面可以取得明显进展。然而，在过去几十年中，只能观察到移植固体器官的长期结果略有改善。在此背景下，慢性异体血管病（CAV）仍然是心脏、肾脏和肺移植晚期器官衰竭的主要原因。

到目前为止，CAV发展的基本发病机制仍不清楚，这解释了为什么目前缺乏有效的治疗策略，并强调需要相关的实验模型，以便研究导致CAV 形成。以下方案描述了使用改良的非缝合铐技术的鼠异位宫颈主动脉移植模型。在此技术中，胸主动脉的一段插在右侧常见的胡萝卜动脉中。利用非缝合铐技术，可以建立易于学习和可重复的模型，最大限度地减少了缝合血管微麻醉剂的可能异质性。

引言

在过去的六十年里，固体器官移植已经从实验性程序发展到治疗终末期器官^衰竭1的护理标准。由于抗菌剂的改进、外科技术和免疫抑制团的进步，固体器官移植的早期成功率在过去几十年中^{显著提高。}

然而，长期移植存活率并没有以同样的方式^{显著改善3。}CAV的发展是限制长期生存的主要因素4，5，6。这种病理学的特点是形成由平滑肌肉细胞组成的同心新突层，导致血管逐渐变窄和移植的固体器官连续发生麦芽灌注。在心脏移植接受者中，在移植^后3年内，高达75%的患者可以诊断出CAV病变。

CAV的病理生理学尚未完全了解。它似乎与许多免疫学和非免疫因素有关，导致内皮损伤，随后的内皮活化和功能^障碍8。到目前为止，对于预防CAV，没有因果治疗方案，强调需要一个可重复的小动物模型来研究CAV的形成和潜在的治疗。

使用鼠主动脉移植模型，CAV像病变可以看到移植后4周。这些病变主要由血管平滑肌细胞组成，因此类似于人类病理学。由于转基因和淘汰小鼠的种类繁多，在移植相关病理学中使用小鼠模型为确定新的治疗方案和了解其发展提供了独特的机会。然而，由于移植容器的直径小，小鼠模型的使用通常与长学习曲线和初始高并发症^率9相关。随着非缝合袖口技术的引入，这个最具挑战性的手术部分可以促进和麻醉的直径保持恒^{定10，11。}

方案

所有实验均根据德国动物福利法案（TierSchG）的指导方针进行。（AZ:55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015）。

1. 动物外壳

1. 在实验中，使用体重为20-25克的雄性C57BL/6小鼠和C57BL/6小鼠作为受体动物，将BALB/c小鼠作为供体动物。
2. 根据FELASA健康监测^指南12，在无障碍无病原体设施中购买动物和房屋。
3. 用浓缩的嵌套材料将小鼠放在标准模克隆笼子里。以12小时的日/夜周期提供饮用水和颗粒食物。
4. 将室温保持在22~2°C，相对湿度保持在55~5%。

2. 收件人准备

1. 首先，对受体动物（C57BL/6）进行麻醉，注射中子兰（5毫克/千克;5毫克/升）、麦地霉素（0.5毫克/千克;1毫克/升）和芬太尼（0.05毫克/千克;0.05毫克/升/升）。
   注:麻醉的正确深度应在5-10分钟内达到。
   1. 用钳子捏住后脚，检查反射，以确认麻醉的深度。
2. 用电动护发器夹住颈椎区的所有毛发，用棉签涂抹眼膏，防止眼睛在手术过程中干涸。
3. 将动物放在显微镜下的加热垫上，用皮肤敏感的石膏条轻轻地将它的腿用胶带粘在手术台上。
4. 向后倾斜头部，用酒精擦洗手术场几次。
5. 用小剪刀从切口到右下颌进行皮肤切口。
6. 通过血管板的双极烧结和随后用微剪刀切除下颌骨的右下叶。
7. 通过上部和下部的双极性烧灼和随后的用微剪刀切除右胸腺体肌肉，以获得进入常见的胡萝卜动脉。
8. 调动共同的胡萝卜动脉尽可能远和近，通过拉开周围的结缔组织与精细的钳子。
9. 将两个 7-0 丝质连结，在普通胡萝卜动脉的中间，每个连接距离最小，在连结之间用精细的微剪刀横断普通胡萝卜动脉。
10. 通过近端，连接端通过袖口，并修复它与一个小动脉夹。
    注:本程序中使用的袖口用微剪刀从外径为0.610毫米、壁厚为0.0254毫米的聚酰亚胺管中切割。完成袖口的长度为 ±2 mm，其中一半用于袖口过程，是一个满缸，另一半是夹紧的，是半缸。
11. 用精细的微剪刀去除结扎，尽可能靠近连结，用肝化盐水（50 IU/mL）用30 G针冲洗流明，同时注意不要损坏血管壁。
12. 使用精细血管扩张器将开放流明分解，并通过轻轻拉过聚酰亚胺管，将胡萝卜树桩放在袖口上。
13. 立即修复与松散预绑的7-0丝环的电环。
    注:在手术前，松绑4个7-0丝环，直径约1.5毫米，使袖口手术更流畅、更容易。
14. 在胡萝卜动脉的另一端执行相同的程序（2.10-2.13）。
15. 将受体动物放在一边，用盐水滋润手术场，直到主动脉部分被切除。

3. 捐助者业务

1. 以与受体动物相同的方式麻醉捐赠小鼠 （BALB/c）。
   1. 用钳子捏住后脚，检查反射，以确认足够的麻醉。
2. 用电动发夹夹子夹住腹部和胸腔的所有头发，用棉签涂抹眼部膏，防止眼睛在手术过程中干涸。
3. 将动物放在显微镜下的加热垫上，用皮肤敏感的石膏条轻轻地将它的腿用胶带粘在手术台上。
4. 用酒精擦洗手术现场几次。
5. 用小剪刀进行中线腹部腹腔切除术，将肠子稍微向上推，露出劣质的vena卡瓦（IVC）。
6. 使用 30 G 针头注射 1 mL 的肝化盐水，注入劣质 vena 卡瓦 （IVC）。
7. 用小剪刀切下肾动脉以下的腹部主动脉和IVC，以消灭捐赠动物。松散地将压缩放入腹部以吸收血液。
8. 用剪刀在肋骨的双边分流处进行胸腔切除术，用手术夹将前胸壁倾斜，以暴露中导。
9. 用微剪刀将IVC和食道切在隔膜正上方。
10. 用钳子将心脏和肺部向上倾斜，用钳子固定切割的 IVC/食道，然后用微剪刀从底座中取出它们，以进入背中腹的胸主骨。
11. 通过用细钳将周围的结缔组织和脂肪拉开，同时小心不要损坏任何闭周动脉，从而从周围组织中抽离胸主动脉。
12. 用双极性烧灼钳从胸主动脉烧灼所有分支，并使用微剪刀切除隔膜和主动脉拱之间的主动脉段。
13. 用30G针冲洗肝素盐水，同时注意不要损坏血管壁，去除任何残留的血液或血块，并将移植物转移到受体动物。
    注:在转移过程中，将主动脉移植物直接放在收件人大致正确的位置。如果存在混淆受体动物移植不同末端的问题，则远端周围的松散连字可能会有所帮助。

4. 植入

1. 将供体主动脉的近端拉过可漏颈动脉顶部的近端，用细钳子固定，并立即用松散预绑的 7-0 丝环固定它。
2. 用微剪刀修剪主动脉移植的远端自由端，使移植长度适合两个袖口之间的距离。
3. 在主塔的另一端用另一个袖口重复步骤 4.1，以完成麻醉。
4. 拆下远端夹具，允许逆行灌注。
5. 达到赫莫西病后，拆下近端夹以完成麻醉。
6. 最后，用6-0连续缝合伤口。

5. 术后护理

1. 在手术后的前6小时密切观察小鼠，然后在移植后的第一个72小时每天监测几次，以立即检测出任何并发症。
2. 对于术后性肛门病，在移植后直接将移植小鼠注射丁丙诺啡（0.05-0.1 mg/kg），然后每12小时72小时，提供适当的长期麻醉。

6. 主动脉移植解释

1. 麻醉移植动物，在移植后4周内注射中子兰（5毫克/千克;5毫克/千米）、麦地霉胺（0.5毫克/千克;1毫克/千米）和芬太尼（0.05毫克/千克;0.05毫克/mL）。
   1. 用钳子捏住后脚，检查反射，以确认足够的麻醉。
2. 用电动剪发器为小动物剪下腹部、胸腔和宫颈区域的所有头发。
3. 将动物放在显微镜下的加热垫上，用皮肤敏感的石膏条轻轻地将它的腿用胶带粘在手术台上。
4. 用酒精擦洗手术现场几次。
5. 用小剪刀进行中线腹部腹腔切除术，将肠子稍微向上推，露出劣质的vena卡瓦（IVC）。
6. 使用 30 G 针头注射 1 mL 的肝化盐水，注入劣质 vena 卡瓦 （IVC）。
7. 用小剪刀切下肾动脉以下的腹部主动脉和IVC，以消灭捐赠动物。松散地将压缩放入腹部以吸收血液。
8. 用与移植手术过程中的皮肤切口对应的小剪刀，从切口到右下颌进行皮肤切口。
9. 识别移植的主动脉移植物与远端和近端袖口一起，用钳子钝切除周围任何组织。
10. 使用微剪刀，用袖口切开常见的胡萝卜动脉远端和近端主动脉移植，以便将主动脉移植物与两个袖口末端一起切除。
11. 将主动脉部分切成两半，并保存标本以进行进一步分析（冷冻部分、石蜡嵌入部分、捕捉冷冻材料）^13、14。

结果

在完全MHC错配移植模型中，移植后4周可以看到同心新心层（图2）。这一层主要由血管平滑肌细胞组成，如SM22（成熟血管平滑肌细胞的选择性标记物）的免疫组织染色。如前所述，这些血管平滑肌细胞是慢性异体血管病中看到的病变的病灶。为进一步分析，主动脉段应分割和染色的Elastica范吉森染色。在这里，新突层可以很容易地区分到内部弹性膜的弹性纤维，将图尼卡intima与图尼卡介质分开。

为了评估该模型中的潜在治疗效果，可以在这些切片^{样本13、15}中测量新丁铁-介质比以及发光横截面面积缩小。在我们描述的非缝合主动脉移植的改进模型中，在300多例主动脉移植中，技术成功率达到>91%。使用外径为 0.610 mm、壁厚为 0.0254 mm 的聚酰亚胺管制成的袖口，可以实现这一高成功率。

讨论

慢性异体血管病是心脏固体器官移植后晚期移植损失的主要原因，可能为肾和肺异体^移植8。到目前为止，无法制定任何因果治疗方案，以防止CAV的形成。

CAV的病理生理学是多因素的，涉及免疫学和非免疫学^方面16。在移植中使用啮齿动物模型对于理解固体器官移植中异体排斥过程的基本病理生理学至关重要，并有助于确定防止排斥的新方法¹⁷.CAV的特点是形成由血管平滑肌细胞组成的新肌层，导致血管连续变窄，移植器官的恶性灌注，随后器官功能^恶化7。

在所述的鼠主动脉移植模型中，同心新心形形成可在移植后4周内在完全MHC（H-2^d至H-2^b）不匹配胸主动脉移植中观察到。这些病变主要由血管平滑肌细胞组成（图2）。施等人于1994^年...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Balb-c 小鼠 （H2-d）	Charles River	菌株# 028	供体动物
双极烧灼系统	ERBE	ICC 50 / 20195-023	双极烧灼
C57BL/6J （H-2b）	Charles River	菌株# 027	受体动物
Halsey 持针器	FST	12501-12	持针
器 Halsted-蚊子镊子	AESCULAP	BH111R	弯曲夹
医用聚酰亚胺管	Nordson MEDICAL	141-0031	袖带材料
Micro Serrefines	FST	18055-04	微血管夹
Micro-Adson 镊子（锯齿状）	FST	11018-12	标准镊子
Micro-Serrefine 夹应用镊	FST	18057-14	夹式涂抹器
S&T 型镊子 - SuperGrip 尖端（倾斜 45 度）	S&T	00649-11	细镊子
T 型血管扩张钳 - 倾斜 10 度;（尖端直径 0.2 mm）	S&T	00125-11	血管扩张器
Schott VisiLED 套装	Schott	MC 1500 / S80-55	光学
立体显微镜	蔡司	SteREO Discovery.V8	显微镜
学生精细剪刀 / 手术剪刀 - 锐利钝	FST	91460-11 / 14001-12	标准剪刀
Vannas-Tübingen 弹簧剪刀（弯曲，8.5 厘米）	FST	15004-08	微型剪刀（弯曲）
Vannas-Tübingen 弹簧剪刀（直，8.5 cm）	FST	15003-08	微型剪刀（直）