本文介绍了一种在小鼠颈部分异位主动脉移植模型中应用无缝合套管技术的小鼠异位主动脉移植方案。该模型可用于研究慢性移植物血管病变（CAV）的潜在病理机制，并有助于评估新的治疗药物以预防其发生。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
随着强效免疫抑制方案的引入，在预防和治疗急性排斥反应方面已取得显著进展。然而，在过去几十年中，移植实体器官的长期效果仅获得了轻微改善。在此背景下，慢性移植物血管病变（CAV）仍然是心脏、肾脏和肺移植术后晚期器官衰竭的主要原因。
迄今为止，冠状动脉血管病变（CAV）发生的潜在发病机制仍不明确，这解释了为何目前缺乏有效的治疗策略，也凸显了建立相关实验模型以研究导致 CAV 形成的基础病理生理过程的必要性。以下方案描述了一种采用改良无缝线套管技术的小鼠异位颈部主动脉移植模型。该技术将一段胸主动脉植入右侧颈总动脉中。通过使用无缝线套管技术，可建立一种易于掌握且可重复的模型，从而最大限度地减少缝合血管显微吻合可能带来的异质性。
引言
在过去六十年中，实体器官移植已从一种实验性手术发展为治疗终末期器官衰竭的标准医疗手段1。随着抗菌药物的改进、外科技术的进步以及免疫抑制治疗方案的发展，实体器官移植的早期成功率在过去几十年中显著提高2。
然而，移植物的长期存活率并未以相同程度显著提高3。慢性移植物血管病（CAV）的发展是限制长期存活的主要因素4,5,6。该病理特征为形成由平滑肌细胞构成的同心性新生内膜层，导致血管进行性狭窄，进而引起移植实体器官的连续性灌注不足。在心脏移植受者中，移植后3年内可于高达75%的患者中检出CAV病变7。
冠状动脉血管病变（CAV）的病理生理机制尚未完全明确。该病变似乎与多种免疫性和非免疫性因素相关，可导致内皮细胞损伤，进而引起内皮激活和功能障碍8。目前尚无针对预防 CAV 的病因治疗手段，因此迫切需要建立一种可重复的小动物模型，以研究 CAV 的形成机制及潜在治疗方法。
通过使用小鼠主动脉移植模型，可在移植后4周观察到类似移植血管病（CAV）的病变。这些病变主要由血管平滑肌细胞构成，因而与人类病理特征相似。由于存在大量转基因和基因敲除小鼠品系，利用小鼠模型研究移植相关疾病为探索新的治疗策略及其发病机制提供了独特的机会。然而，由于移植血管直径较小，小鼠模型的应用通常需要较长的学习曲线，并在初期伴随较高的并发症发生率9。随着无缝线套管技术的引入，手术中最困难的部分得以简化，且吻合口的直径可保持恒定10,11。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有实验均按照德国动物福利法（TierSchG.）的指南进行（批准号：55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015）。
1. 动物饲养
- 实验中使用体重为20-25 g的雄性C57BL/6和BALB/c小鼠，其中C57BL/6小鼠作为受体动物，BALB/c小鼠作为供体动物。
- 根据FELASA健康监测指南12，购买动物并在屏障级无特定病原体设施中饲养。
- 将小鼠饲养在标准的Makrolon笼具中，并提供丰富的筑巢材料。自由饮水和摄食颗粒饲料，光照周期为12小时明/12小时暗。
- 维持室温在22 ± 2°C，相对湿度在55 ± 5%。
2. 受体准备
- 首先，通过腹腔注射咪达唑仑（5 mg/kg；5 mg/mL）、美托咪啶（0.5 mg/kg；1 mg/mL）和芬太尼（0.05 mg/kg；0.05 mg/mL）对受体动物（C57BL/6）进行麻醉。
注意：应在5–10分钟内达到适当的麻醉深度。- 用镊子轻夹后肢足部以检查反射，确认麻醉深度。
- 使用小型动物专用电推剪剃除颈部侧区全部毛发，并用棉签涂抹眼用软膏，防止手术过程中眼睛干燥。
- 将动物仰卧位置于显微镜下的加热垫上，并使用对皮肤温和的胶带将其四肢轻轻固定于手术台上。
- 向后仰头，并用酒精反复擦拭手术区域进行消毒。
- 使用小剪刀从颈静脉切口处沿至右侧下颌角做皮肤切口。
- 通过双极电凝处理下颌下腺右下叶的血管蒂，随后使用显微剪将其切除。
- 通过双极电凝处理胸锁乳突肌右上段和下段，随后使用显微剪将其切除，以暴露颈总动脉。
- 用精细镊子分离周围结缔组织，尽可能向远端和近端游离颈总动脉。
- 在颈总动脉中段用两根7-0丝线结扎，结扎间距尽量小，然后在两结扎线之间用精细显微剪剪断颈总动脉。
- 将近端结扎端穿过套管，并用小型动脉夹固定。
注意：本实验所用套管系使用显微剪从聚酰亚胺管上切割而成，管材外径为0.610 mm，壁厚为0.0254 mm。制备完成的套管长度约为2 mm，其中用于套接的一半为完整圆柱形，另一被夹持的一半为半圆柱形。 - 用精细显微剪尽可能靠近结扎线处剪除结扎线，并用30 G针头以肝素化生理盐水（50 IU/mL）冲洗管腔，注意避免损伤血管壁。
- 使用精细血管扩张器扩张开放的管腔，并通过轻柔地将颈总动脉残端翻转套入聚酰亚胺管，完成外翻。
- 立即用预先松松打结的7-0丝线环固定已外翻的颈总动脉。
注意：术前应预先制作4个直径约1.5 mm的松结7-0丝线环，以使套管操作更顺畅、简便。 - 在颈总动脉另一端重复相同操作（步骤2.10–2.13）。
- 将受体动物暂置一旁，用生理盐水保持手术区域湿润，直至主动脉节段被取出。
3. 供体手术
- 以与受体动物相同的方式麻醉供体小鼠（BALB/c）。
- 用镊子轻捏后肢足部，检查反射以确认麻醉充分。
- 使用小型动物专用电推剪剪除腹部和胸部的所有毛发，并用棉签涂抹眼药膏，防止手术过程中眼睛干涩。
- 将动物仰卧位放置在显微镜下的加热垫上，并使用对皮肤温和的胶带将其四肢轻轻固定在手术台上。
- 用酒精反复擦拭手术区域。
- 使用小剪刀行腹正中切口进入腹腔，将肠管轻微上推，暴露下腔静脉（IVC）。
- 使用30 G针头向 下腔静脉（IVC）注入1 mL肝素化生理盐水。
- 用小剪刀在肾动脉下方剪断腹主动脉和下腔静脉，使供体动物放血；在腹腔内松散放置纱布以吸收血液。
- 用剪刀在双侧肋骨分叉处行胸廓切开术，并用手术钳将前胸壁向头侧抬起，暴露纵隔。
- 用显微剪刀在膈肌上方直接剪断下腔静脉和食管。
- 用镊子夹住已剪断的下腔静脉/食管并向上抬起心脏和肺组织，再用显微剪刀从其基底部开始切除，以暴露背侧纵隔内的胸主动脉。
- 用精细镊子小心分离周围结缔组织和脂肪，将胸主动脉从周围组织中游离出来，注意避免损伤任何肋间动脉。
- 使用双极电凝镊凝固胸主动脉的所有分支，并用显微剪刀切除膈肌至主动脉弓之间的主动脉节段。
- 用30 G针头以肝素化生理盐水冲洗切除的主动脉节段，注意避免损伤血管壁，以清除残留血液或血凝块，随后将移植物转移至受体动物。
注：转移过程中应直接将主动脉移植物大致放置于受体内的正确位置。若在受体动物中难以区分移植物的两端，可在远端结扎一根松线作为标记。
4. 植入
- 用精细镊子将供体主动脉节段的近端拉至翻转的颈动脉上方的近端套管上，并立即用预先松松打结的7-0丝线环固定。
- 用显微剪刀修剪主动脉移植物的远端游离端，使移植物长度与两个套管之间的距离相匹配。
- 在主动脉另一端使用另一个套管重复步骤4.1，以完成吻合。
- 移除远端夹子，以允许逆行灌注。
- 止血完成后，移除近端夹子，以完成吻合。
- 最后，用6-0连续缝合线关闭切口。
5. 术后护理
- 在手术后最初6小时内密切监测小鼠，之后在移植后的前72小时内每天监测数次，以便及时发现任何并发症。
- 术后镇痛处理：在移植后立即皮下注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg），之后每12小时给药一次，持续72小时，以提供适当且长效的镇痛效果。
6. 主动脉移植物说明
- 移植后4周，通过腹腔注射咪达唑仑（5 mg/kg；5 mg/mL）、美托咪啶（0.5 mg/kg；1 mg/mL）和芬太尼（0.05 mg/kg；0.05 mg/mL）对移植动物进行麻醉。
- 用镊子轻夹后肢足部以检查反射，确认麻醉充分。
- 使用小型动物专用电推剪，剃除腹部、胸部和颈部的所有毛发。
- 将动物仰卧位放置于显微镜下的加热垫上，并使用对皮肤温和的胶带将其四肢轻轻固定于手术台上。
- 用酒精反复擦洗手术区域。
- 使用小剪刀行腹正中切口进入腹腔，将肠管轻微上推，暴露下腔静脉（IVC）。
- 使用30 G针头向 下腔静脉（IVC）注入1 mL肝素化生理盐水。
- 用小剪刀在肾动脉下方剪断腹主动脉和下腔静脉，使供体动物放血；在腹腔内松置一块纱布以吸收血液。
- 使用小剪刀沿颈静脉切口至右侧下颌角做皮肤切口，该切口应与移植手术时所做的皮肤切口一致。
- 辨认移植的主动脉移植物及其远端和近端套管，用镊子钝性剥离周围组织。
- 使用显微剪刀，在套管的远端和近端切断颈总动脉，将主动脉移植物连同两端套管一并取出。
- 将主动脉段切成两半，并将标本保存用于后续分析（冷冻切片、石蜡包埋切片、速冻组织）13,14。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在完全MHC不相合的移植模型中，移植后4周可观察到同心圆状的新内膜层（图2）。免疫组织化学染色显示SM22（成熟血管平滑肌细胞的特异性标志物）表明，该层主要由血管平滑肌细胞构成。如前所述，这些血管平滑肌细胞是慢性同种异体移植物血管病病变的特征性表现。为进一步分析，应将主动脉节段进行切片，并采用Elastica van Gieson染色。在此染色下，新内膜层可清晰区分于内弹力膜的弹性纤维，后者分隔了Tunica intima与Tunica media。
为了评估该模型中的潜在治疗效果，可对切片样本测量新生内膜-中膜比值以及管腔横截面积的狭窄程度13,15。在我们所描述的无缝线主动脉移植改良模型中，已完成超过300例主动脉移植手术，技术成功率达到>91%。通过使用由聚酰亚胺管制成的套管（外径为0.610 mm，壁厚为0.0254 mm），可实现如此高的成功率。
...访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
慢性移植物血管病变是心脏实体器官移植后晚期移植物丢失的主要原因，可能也是肾和肺移植物晚期失功的主要原因8。迄今为止，尚无能够预防CAV形成的病因学治疗方案被成功开发。
冠状动脉血管病变（CAV）的病理生理机制是多因素的，涉及免疫性和非免疫性因素16。啮齿类动物移植模型在理解实体器官移植中移植物排斥反应的潜在病理生理过程方面至关重要，并有助于发现可预防排斥反应的新型治疗策略17。CAV 的特征是形成由血管平滑肌细胞构成的新生内膜层，导致血管进行性狭窄，移植器官灌注不足，进而引起器官功能逐渐恶化7。
在所述的小鼠主动脉移植模型中，完全MHC（H-2d 到 H-2b）错配的胸主动脉移植物在移植后4周可观察到同心圆状的新生内膜形成。这些病变主要由血管平滑肌细胞组成（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Balb-c 小鼠 (H2-d) | Charles River | Strain# 028 | 供体动物 |
| 双极电凝系统 | ERBE | ICC 50 / 20195-023 | 双极电凝 |
| C57BL/6J (H-2b) | Charles River | Strain# 027 | 受体动物 |
| Halsey 持针器 | FST | 12501-12 | 持针器 |
| Halsted-Mosquito 镊子 | AESCULAP | BH111R | 弯型止血钳 |
| 医用聚酰亚胺管 | Nordson MEDICAL | 141-0031 | 套管材料 |
| 微型血管夹 | FST | 18055-04 | 微型血管夹 |
| 显微有齿 Adson 镊子 | FST | 11018-12 | 标准镊子 |
| 微型血管夹施夹钳 | FST | 18057-14 | 施夹器 |
| S&T 镊子 - SuperGrip 尖端（45° 角） | S&T | 00649-11 | 精细镊子 |
| S&T 血管扩张镊子 - 10° 角（尖端直径 0.2 mm） | S&T | 00125-11 | 血管扩张器 |
| Schott VisiLED 照明系统 | Schott | MC 1500 / S80-55 | 光源 |
| 体视显微镜 | ZEISS | SteREO Discovery.V8 | 显微镜 |
| 学生型精细剪刀 / 外科剪刀 - 尖头钝头 | FST | 91460-11 / 14001-12 | 标准剪刀 |
| Vannas-Tübingen 弹簧剪（弯型，8.5 cm） | FST | 15004-08 | 显微剪刀（弯型） |
| Vannas-Tübingen 弹簧剪（直型，8.5 cm） | FST | 15003-08 | 显微剪刀（直型） |
参考文献
- Rana, A., et al. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surgery. 150 (3), 252-259 (2015).
- Rana, A., Godfrey, E. L. Outcomes in Solid-Organ Transplantation: Success and Stagnation. Texas Heart Institute Journal. 46 (1), 75-76 (2019).
- Meier-Kriesche, H. U., Schold, J. D., Srinivas, T. R., Kaplan, B. Lack of improvement in renal allograft survival despite a marked decrease in acute rejection rates over the most recent era. American Journal of Transplantation. 4 (3), 378-383 (2004).
- Bagnasco, S. M., Kraus, E. S. Intimal arteritis in renal allografts: new takes on an old lesion. Current Opinion in Organ Transplantation. 20 (3), 343-347 (2015).
- Hollis, I. B., Reed, B. N., Moranville, M. P. Medication management of cardiac allograft vasculopathy after heart transplantation. Pharmacotherapy. 35 (5), 489-501 (2015).
- Verleden, G. M., Raghu, G., Meyer, K. C., Glanville, A. R., Corris, P. A new classification system for chronic lung allograft dysfunction. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (2), 127-133 (2014).
- Ramzy, D., et al. Cardiac allograft vasculopathy: a review. Canadian Journal of Surgery. 48 (4), 319-327 (2005).
- Skoric, B., et al. Cardiac allograft vasculopathy: diagnosis, therapy, and prognosis. Croatian Medical Journal. 55 (6), 562-576 (2014).
- Koulack, J., et al. Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection. Microsurgery. 16 (2), 110-113 (1995).
- Rowinska, Z., et al. Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Dietrich, H., et al. Mouse model of transplant arteriosclerosis: role of intercellular adhesion molecule-1. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (2), 343-352 (2000).
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Laboratory Animals. 48 (3), 178-192 (2014).
- Ollinger, R., et al. Blockade of p38 MAPK inhibits chronic allograft vasculopathy. Transplantation. 85 (2), 293-297 (2008).
- Thomas, M. N., et al. SDF-1/CXCR4/CXCR7 is pivotal for vascular smooth muscle cell proliferation and chronic allograft vasculopathy. Transplant International. 28 (12), 1426-1435 (2015).
- Ollinger, R., et al. Bilirubin: a natural inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation. 112 (7), 1030-1039 (2005).
- Segura, A. M., Buja, L. M. Cardiac allograft vasculopathy: a complex multifactorial sequela of heart transplantation. Texas Heart Institute Journal. 40 (4), 400-402 (2013).
- McDaid, J., Scott, C. J., Kissenpfennig, A., Chen, H., Martins, P. N. The utility of animal models in developing immunosuppressive agents. European Journal of Pharmacology. 759, 295-302 (2015).
- Shi, C., Russell, M. E., Bianchi, C., Newell, J. B., Haber, E. Murine model of accelerated transplant arteriosclerosis. Circulation Research. 75 (2), 199-207 (1994).
- Koulack, J., et al. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clinical Immunology and Immunopathology. 80 (3 Pt 1), 273-277 (1996).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141 (5), 682-689 (2007).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753(2014).
- Nakao, A., Ogino, Y., Tahara, K., Uchida, H., Kobayashi, E. Orthotopic intestinal transplantation using the cuff method in rats: a histopathological evaluation of the anastomosis. Microsurgery. 21 (1), 12-15 (2001).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
