用于自身免疫性糖尿病模型功能检测的高效生成抗原特异性原代小鼠细胞毒性T细胞

摘要

本文介绍了一种用于生成抗原特异性CD8 T细胞并在体外扩增的实验方案，旨在获得大量具有功能的T细胞，用于体外和体内实验。

摘要

1型糖尿病（T1D）的特征是胰岛特异性自身免疫反应，导致β细胞破坏以及胰岛素分泌的绝对缺失。在自发性非肥胖糖尿病（NOD）小鼠模型中，胰岛素是主要的自身抗原靶点，通过基因操作去除单个关键胰岛素表位即可防止疾病发生。因此，选择性清除携带该致病表位的专业抗原呈递细胞（APCs）是一种抑制异常胰岛素特异性自身免疫反应的策略，且可能具有更高的转化应用潜力。

嵌合抗原受体（CAR）可引导T细胞选择性地靶向致病性抗原。该技术是近年来利用细胞工程进行过继性细胞治疗以治疗多种癌症的核心方法。在本方案中，我们描述了一种优化的T细胞逆转录病毒（RV）转导及体外扩增方案，该方案可从少量初始T细胞出发，高效生成大量具有功能的抗原特异性CD8+ CAR-T细胞。此前已有多种CAR-T细胞制备方案被报道，但通常转导效率较低，且转导后细胞存活率不高。相比之下，本方案的转导效率可达90%，所获得的细胞在体内可存活超过两周，单次输注即可显著延缓疾病的发生。我们对细胞培养与转导的详细步骤进行了说明，以便关键操作能够被清晰遵循。从原代细胞分离到CAR表达的整个流程可在14天内完成。该通用方法可应用于任何已知靶点的小鼠疾病模型。同样，本方案的具体应用（靶向致病性肽段/MHC II类分子复合物）也可推广至其他已鉴定出关键复合物的自身免疫性疾病模型。

引言

鉴于抗原特异性免疫疗法（ASI）可能降低非靶向效应的风险，因此其在治疗1型糖尿病（T1D）等自身免疫性疾病方面具有广阔前景。越来越多的证据表明，针对（前原）胰岛素的免疫反应在T1D中可能尤为重要¹。在过去十年中，包括我们团队在内的多个研究小组的研究结果强烈提示，由特定MHC II类分子呈递的包含胰岛素B链第9至23位氨基酸的表位（B:9-23/MHCII）在小鼠和人类T1D的发生过程中起着重要作用^2,3,4,5。为了选择性靶向B:9-23/MHCII复合物，我们开发了一种单克隆抗体，命名为mAb287，该抗体不与激素胰岛素或其他肽段组成的复合物发生交叉反应⁶。mAb287可在体外阻断抗原呈递，每周向糖尿病前期NOD小鼠注射mAb287可使35%的治疗小鼠延缓T1D的发生⁶。为了在体内阻断抗原呈递，通常需要频繁注射以维持较高的循环浓度。我们假设，可利用Ab287的高度特异性来重编程T细胞，从而为T1D提供更优的抗原特异性T细胞治疗策略⁷。

据报道，细胞毒性T细胞只要识别出其同源配体的单个分子，即可杀伤靶细胞^8,9,10。因此，针对B:9-23/MHCII特异性的CD8 T细胞在清除异常抗原呈递方面，预期比亲本抗体具有更高的效率，因为后者通常需要结合同一抗原呈递细胞上的多个复合物才能发挥作用。CAR T细胞已被用于治疗多种人类癌症^11,12,13，也可能在自身免疫疾病中具有疗效¹⁴。然而，迄今为止，尚无针对致病性肽段-MHC复合物特异性的CAR-T细胞被用于干预1型糖尿病（T1D）的疾病进程。通过采用下文所述的优化CD8 T细胞转导技术，我们近期已初步证明该策略确实是一种可行的方法⁷。

在本实验方案中，我们介绍了一种高效且简化的转导与扩增方法。本方案适用于需要高效生成小鼠CD8 CAR T细胞的其他研究。

方案

小鼠在转基因小鼠繁育中心的特定无病原体条件下饲养，所有动物实验均依照贝勒医学院动物护理与使用委员会批准的方案进行。

注意：本实验需要同时进行病毒和T细胞的制备。表1总结了该实验方案。主要试剂和缓冲液列于材料表中。本实验方案重点在于生成和扩增靶向特定抗原呈递细胞（APC）群体的CAR-T细胞。

1. 单链Fab抗体（scFab）-CAR的构建与验证。

注意：CAR 通常包含三个关键结构域——抗原靶向结构域、间隔区/跨膜结构域以及胞内信号传导结构域。每种 CAR 的具体设计取决于其预期靶标，因此，除与逆转录病毒生成相关的构建体关键特征外，本方案中不会详细描述这些设计。用于下述研究的 CAR 整体结构如图1所示。简而言之，靶向结构域由亲本单克隆抗体的完整轻链以及重链的可变区和 CH1 结构域组成，二者通过一个半刚性连接肽相连；间隔区/跨膜结构域来源于小鼠 CD28；信号传导结构域则为包含小鼠 CD28、CD137（4-1BB）和 CD247（CD3ζ）元件的融合结构。这些元件可通过标准分子生物学方法（如拼接重叠聚合酶链式反应（PCR））或合成相应的“基因片段”进行组装。mAB287 CAR 构建的具体细节见 Zhang 等人⁷。cDNA 序列可应要求向作者索取。

1. 组装CAR结构
   1. 分别合成靶向单链Fab抗体（scFab）以及组合的间隔区/信号域，使用“三点”连接技术¹⁵组装最终结构（图1）。
      注意：CAR插入片段的关键要求是应包含侧翼限制性内切酶位点，以便连接至逆转录病毒表达载体pMSCV-IRES-GFP II（pMIG II），或相关衍生物¹⁵也同样适用。
2. 验证CAR表面表达
   1. 使用通过标准方案（例如Holst等¹⁶）生成的pMIG II来源的逆转录病毒颗粒转导杂交瘤细胞。
   2. 进行流式细胞术分析，检测CAR载体中GFP的表达¹⁷。
   3. 使用针对小鼠κ链的标记抗体（例如克隆RMK-45）染色转导后杂交瘤细胞表面CAR的表达¹⁷。
      注意：¹⁸。
3. 验证CAR特异性
   1. 用适当的包被平板抗原或细胞抗原刺激转导后的杂交瘤细胞。共培养过夜后收集上清液和分泌的细胞因子，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行检测⁷。
      注意：理想情况下，每个CAR在用于转导前都应独立验证。在此步骤中，实验可暂停并在之后重新启动。

2. 病毒产生细胞的转染（第 -4 天至第 3 天）

注意：使用 Phoenix-ECO 细胞（参见材料表）生产逆转录病毒^19,20。在产生潜在感染性因子时，应采取适当的预防措施（建议使用指定的 BSL-2 生物安全柜，并配备独立的培养箱用于培养转染/转导细胞）。

1. 解冻Phoenix细胞（第-4天）
   1. 解冻2 × 10⁶个Phoenix-Eco细胞。若计划进行多次转导，需按比例增加Phoenix细胞数量。
   2. 将细胞接种于含10 mL培养基（含10%胎牛血清（FCS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM））的10 cm组织培养皿中。
2. 传代Phoenix细胞（第-3天）
   1. 移除培养基，并用5 mL Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞。
   2. 加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C、10% CO₂条件下孵育3分钟。
   3. 收集细胞，200 × g离心3分钟形成细胞沉淀。将细胞重悬于10 mL新鲜培养基中，重新接种并置于37 °C孵育。
3. Phoenix细胞辐照（第-1天下午）
   1. 为最大限度抑制细胞进一步分裂，按步骤2.2所述方法收集Phoenix细胞，重悬于5 mL培养基中，置于冰上进行γ射线辐照（1000 rad）。
      注意：进行辐射操作时应谨慎，避免人员暴露。
   2. 将辐照后的细胞离心，重悬于新鲜培养基中，以每孔每种CAR 2 × 10⁶个细胞（溶于10 mL培养基）的密度接种，并进行孵育。
4. 转染（第0天上午）
   1. 吸除Phoenix细胞的上清液，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后沿培养皿壁缓慢滴加7 mL低血清培养基（如Opti-MEM），避免扰动单层细胞。将细胞放回培养箱。
   2. 取两个14 mL圆底聚丙烯管，每管加入1.5 mL低血清培养基。向其中一管加入40 µL转染试剂（参见材料表）。
   3. 向另一管加入15 µg Ab-CAR质粒（由步骤1制备）和5 µg包膜与包装质粒（5 µg pCL-Eco）。室温孵育5分钟。
   4. 将步骤2.4.2中的转染试剂混合物沿管壁滴加至第二管中，避免接触管壁，用移液器轻轻吹打3次混匀。室温孵育至少20分钟。
   5. 将3 mL混合液滴加至Phoenix细胞中，放入组织培养箱。
   6. 4–5小时后加入1 mL FCS。于37 °C过夜培养细胞。
5. 更换培养基（第1天）
   1. 移除含有质粒/转染试剂复合物的上清液，并按照机构关于感染性材料处理的规程进行处置。向细胞中加入4 mL新鲜预热的培养基。
6. 收集病毒用于转导（第2天）
   1. 用无菌注射器收集Phoenix细胞的含病毒培养基，经0.45 µm滤膜过滤以去除残留细胞碎片，收集至新管中。
   2. 加入rhIL-2储备液至终浓度为200 IU/mL。立即用于转导（步骤5.3）。向Phoenix细胞中加入4 mL新鲜培养基，并放回培养箱。
7. 重复收集病毒（第3天）
   1. 重复步骤2.6，但不再添加新鲜培养基，而是将Phoenix细胞作为感染性废弃物丢弃。此上清液用于步骤5.4。

3. 初始CD8 T细胞的分离与激活（第-1天至第0天）

注意：此前，从雌性NOD小鼠在4–5周龄时收集CD8 T细胞，该时间点处于胰岛炎症开始之前^21,22。所有小鼠操作均须遵循IACUC批准的实验方案。使用商业化的阴性选择试剂盒从小鼠脾细胞中富集CD8 T细胞。

1. 用 CD3/CD28 抗体包被培养板（第 -1 天）
   1. 向 24 孔板的每个孔中加入 1 mL 抗小鼠 CD3 和 CD28 抗体混合液（两种抗体在 PBS 中浓度均为 1 µg/mL），4 °C 过夜孵育。
   2. 次日，在加入小鼠 CD8 T 细胞前（步骤 4.1），用 1 mL 无菌 PBS 洗涤培养板 3 次。
      注意：所需包被的孔数因实验而异，取决于所需活化 CD8 T 细胞的总数。
2. 脾细胞的收集（第 0 天）
   1. 使用 CO₂ 吸入法处死两只 4–5 周龄的 NOD 雌性小鼠，随后进行断头。取出脾脏，并将其置于冰上含有 10 mL PBS 的细胞培养皿中的细胞筛网上。
   2. 在细胞培养超净台中，将每个脾脏切成 3–5 小块，用 3 或 5 mL 注射器的无菌活塞头按压组织，使脾组织分散，细胞通过金属网筛滤出。
   3. 通过将脾细胞重悬于 1:4 稀释的红细胞裂解缓冲液中（每只脾脏使用 1 mL 裂解缓冲液与 3 mL PBS 混合），室温孵育 5 分钟，轻柔去除红细胞。
   4. 然后，取 10 μL 细胞悬液与台盼蓝染液混合，使用血细胞计数板进行细胞计数，并将剩余细胞在 350 x g 离心 7 分钟以收集细胞沉淀。
3. CD8 T 细胞的富集（第 0 天）
   1. 使用小鼠 CD8 T 细胞分离试剂盒，按照制造商说明书通过阴性选择法富集 CD8 T 细胞。
      注意：为确保高纯度，在计算需加入的生物素化抗体体积时，细胞数量应向上取整（例如，当计算得细胞数为 9.1 x 10⁷ 时，应采用适用于 10⁸ 细胞的试剂体积）。
   2. 每 1 x 10⁸ 个细胞，用 400 µL 缓冲液重悬细胞沉淀，并加入 100 µL 生物素标记抗体混合液，充分混匀后于冰箱（4 °C）孵育 5 分钟，使抗体结合。
   3. 每 1 x 10⁸ 个细胞，加入 300 µL 标记缓冲液和 200 µL 抗生物素磁珠，充分混匀后于 4 °C 孵育 10 分钟。
   4. 在等待磁珠结合期间，将分离柱安装至磁力分离器上。用 3 mL 标记缓冲液冲洗柱子进行洗涤。
   5. 将磁珠/细胞混合液在上样前通过 40 µm 细胞筛网过滤 1000 µL，以去除细胞团块。将穿柱流出液收集至预冷的 15 mL 离心管中。
   6. 按照制造商说明洗涤柱子，将所有流出液均收集至同一离心管中。测定细胞数量（方法同步骤 3.2.4），在 350 x g 离心 5 分钟收集细胞。通过在 2 mL 完全 T 细胞培养基（含 FCS、2-巯基乙醇、rhIL-2（200 U/mL）、mIL-7（0.5 ng/mL）、ITS、HEPES 和青霉素-链霉素的 RPMI-1640）中重悬细胞，并在 350 x g 离心 5 分钟，洗涤细胞。
   7. 将细胞重悬于预热（37 °C）的完全 T 细胞培养基中，浓度为 0.25–0.5 x 10⁶/mL。

4. T细胞激活（第0至2天）

1. 将2 mL细胞悬液（0.25–0.5 × 10⁶/mL）加入步骤3.1.2中包被有CD3/CD28抗体的24孔板的每个包被孔中。采用旋转方式加入，使细胞均匀分布。
   注意：加入细胞时应旋转混匀，以确保分布均匀并减少边缘效应。若细胞在孔边缘聚集，则转导效率和细胞存活率均会降低。
2. 作为对照，将相同数量的CD8 T细胞接种至同一块板中的一个未包被孔中。将细胞置于37 °C、含10% CO₂的培养箱中孵育48小时。
   注意：48小时后可通过显微镜确认激活情况；被激活的细胞体积会大于未接触抗CD3/CD28抗体的细胞。

[在此处插入图 2]

5. 活化CD8 T细胞的转导（第1至3天）

注意：本实验方案采用旋转转导法。需要配备摆动转子和组织培养板适配器、且能够维持内部温度为 37 °C 的离心机。为确保最高转导效率，在转导当天，收集病毒前应将离心机预热至 37 °C。

1. 人纤维连接蛋白片段包被板的制备（第1天至第2天）
   1. 在第1天，向24孔板的各孔中加入0.5 mL纤维连接蛋白溶液（50 µg/mL，溶于PBS），于4 °C孵育过夜。
      注意：通常每块转染Phoenix细胞的培养板需要两个纤维连接蛋白包被的孔。
   2. 在第2天，移除纤维连接蛋白溶液，并加入1 mL含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液。室温孵育30分钟，以“封闭”非特异性结合位点。
   3. 用1 mL无菌PBS洗涤处理过的各孔。移除洗涤液后，板即可使用；或可密封后于4 °C保存最多一周。
2. 活化CD8 T细胞的收集（第2天）
   1. 收集活化的CD8 T细胞，使用台盼蓝染色或合适的自动化仪器计数并计算细胞活力。
   2. 通过离心收集细胞，并重悬于完全T细胞培养基中，调整至5 x 10⁶ 个活细胞/mL，用于转导。同时保留少量细胞继续在含完全T细胞培养基的CO₂培养箱中培养，作为后续对转导细胞进行荧光激活细胞分选（步骤6）的对照。
      注意：活化48小时后，细胞总数应增加约1.5倍，且细胞活力应高于95%。
3. 转导（第2天）
   1. 将100 µL活化CD8 T细胞悬液（含0.5 x 10⁶ 个细胞）加入纤维连接蛋白包被的孔中。然后向每孔加入1.5–2 mL含病毒的培养基（来自步骤2.6）。轻轻旋转混匀，使细胞均匀分布（图2）。
   2. 将培养板放入密封塑料袋中并封口（提供二次防护）。于37 °C以2000 x g 离心90分钟。
   3. 从离心机中取出培养板，在生物安全柜内小心移除塑料袋，并确保培养板外表面未被培养基污染。
   4. 随后将培养板转移至专用的37 °C CO₂培养箱中。4小时后，从每孔中移除1 mL培养基，并替换为1 mL预温的完全T细胞培养基。将培养板放回CO₂培养箱。
      注意：所有来自转导细胞的培养基均应作为感染性废弃物处理。
4. 第二次转导（第3天）
   1. 在专用的生物安全柜中，将含有转导后细胞的培养板倾斜放置于盖子上，小心吸除大部分培养基（保留100–200 µL），注意不要接触孔底的细胞。
   2. 加入步骤2.7中收集的含病毒培养基，并重复步骤5.3.2–5.3.4。
      注意：根据我们的经验，第三次转导极少能进一步提高整体效率。此外，若进行第三次转导，细胞活力可能会显著下降。如果细胞接种浓度高于0.5 x 10⁶/孔，第二次转导后的过夜培养可能导致T细胞达到汇合状态。在此情况下，应在第3天4小时孵育后立即分瓶传代。
5. 洗涤细胞（第4天）
   1. 从每孔中移除1 mL培养基，将剩余液体中的细胞重悬后转移至15 mL离心管中。用1 mL完全T细胞培养基洗涤各孔，并将洗液加入含有合并细胞的离心管中。
   2. 以350 x g离心7分钟，随后用2 mL完全T细胞培养基重悬细胞并离心，重复洗涤两次。最后将细胞重悬于2 mL培养基中，并测定细胞数量。
      注意：若初始转导细胞数为1 x 10⁶，此阶段的细胞产量应约为3 x 10⁶。
6. 转移
   1. 将0.5–1 x 10⁶ 个细胞分装至含2 mL完全T细胞培养基的新24孔板各孔中，于37 °C孵育。转导后约48–72小时，细胞可用于CAR表达分析和细胞分选。
      注意：此阶段CAR-T细胞数量通常每24小时翻倍。关键是要避免细胞过度生长。若细胞密度超过2 x 10⁶/mL（或培养基变为亮黄色），应立即分瓶传代。根据我们的经验，CAR-T细胞在24孔板和12孔板中的增殖效果优于转移至更大容器。

6. 通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化转导细胞（第5天或第6天）

1. 收集细胞。
   1. 通过反复吹打重悬细胞（注意避免产生气泡），转移至15 mL离心管中，在350 ×g条件下离心5分钟。
   2. 用分选缓冲液（含庆大霉素的无菌PBS中含2% BSA）重悬细胞，浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL。同时从步骤5.2中收获对照组（未转导）的CD8 T细胞。
      注意：从第2天的1 × 10⁶ 个细胞起，预计在此时间点可获得约2 × 10⁷ 个转导细胞。
2. 用分选缓冲液洗涤细胞一次，350 ×g离心5分钟，然后以1 × 10⁷ 个细胞/mL的浓度重悬于分选缓冲液中。取少量样品用于Foxp3^GFP补偿对照（用于步骤6.4.1），其余部分加入标记的抗小鼠CD8抗体（克隆号53-6.7；每5 × 10⁶ 个细胞使用0.2 µg抗体），在4 °C孵育20分钟。
   1. 同样地，取未转导CD8 T细胞的一部分进行染色，作为抗CD8抗体所用荧光染料的补偿对照。
      注意：请避免在任何缓冲液中添加叠氮化钠，因其对细胞有毒性。
3. 用分选缓冲液将染色后的细胞洗涤两次，然后以1 × 10⁷ 个细胞/mL的浓度重悬于预冷的分选缓冲液中。
4. 分选细胞。
   1. 将CD8 GFP⁺阳性细胞分选至预冷的完全T细胞培养基中（图3B）。取少量样品用于分选后分析以确定纯度。
      注意：为最大程度提高分选细胞的纯度，应使用严格的门控策略。使用100 µm喷嘴以确保细胞高存活率。尽量减少分选后细胞在冰上放置的时间。在冰上放置超过3小时的T细胞恢复时间显著长于冷藏不足2小时的细胞。因此，若需分选3个转导细胞系，建议在分选第一个细胞系的同时收集并标记第二个细胞系，依此类推，避免第二和第三个细胞系长时间处于0 °C环境中。其他T细胞标志物（如CD28和CD3）的表达也可进行检测（图3C），但对分选过程并非必需。
   2. （替代分选策略）在对整体细胞群染色前，先分析少量转导T细胞的CD8表达情况。如果纯度>99%，则可仅依据GFP表达对整体细胞群进行安全分选。

7. 分选后CAR-T细胞的扩增（第5至10天）

1. CAR-T 细胞扩增
   1. 将分选后的 CAR-T 细胞洗涤一次，然后重悬于预热的完全 T 细胞培养基中，细胞密度为 2.5–5 x 10⁵ 个细胞/mL，每孔加入 2 mL 分装至 24 孔板中。
   2. 每隔 1–2 天进行细胞计数并传代。通常细胞数量每天翻倍，持续至约第 10 天，细胞活力保持在 95% 以上。
      注意：若不进行再次刺激，CAR-T 细胞约在第 10 天停止增殖，并最终死亡。因此，T 细胞功能检测和过继转移实验应据此合理安排时间。
2. 替代性扩增策略
   1. 分选后，将 CAR-T 细胞培养于含 100 U/mL rhIL-2 的完全 T 细胞培养基中，而非 200 U/mL。
      注意：在此培养基中，CAR-T 细胞增殖速度略慢。然而，它们通常可在无需再次刺激的情况下持续增殖至第 11 至 13 天。因此，尽管该替代性扩增策略不会产生更多的细胞数量，但可为下游检测提供稍长的时间窗口。

8. CAR T细胞抗原特异性和功能性的验证。

注意：可通过四聚体染色法验证靶向肽/MHC复合物的CAR T细胞的结合特异性^7,23。类似地，通过检测其同源配体刺激后细胞因子的分泌或细胞毒性，可确认其功能活性。位于埃默里大学的美国国立卫生研究院四聚体核心实验室（TCF）是获取“四聚体”及相关染色方案的推荐来源。

1. 肽-MHC 四聚体染色。
   1. 在 100 µL 分选缓冲液中，将 2 × 10⁵ 个转导的 CAR-T 细胞分装，并加入约 0.6 µg 荧光标记的抗原特异性四聚体和对照四聚体，在 37 °C 下孵育 2 小时进行标记。
   2. 在 350 × g 条件下离心 5 分钟使细胞沉淀，随后用 0.5 mL 分选缓冲液重悬并洗涤两次，每次均重新离心。最后将细胞重悬于 300 µL 分选缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析（图 4）。
      注意：在本研究中，我们通常使用 BV421 标记的 IA^g7-B:9-23(RE)（检测组）和 IA^g7-HEL（对照组）四聚体。然而，也可根据所研究的 CAR 选择其他合适的荧光染料/四聚体组合。在此情况下，应针对每种四聚体优化其浓度和染色时间。经分选或未分选的 CAR-T 细胞均可用于四聚体染色。
2. 通过配体刺激测定特异性。
   1. 将 2 × 10⁵ 个经分选的 CAR-T 细胞与适当的包被于培养板上的配体或细胞类配体一起，在 200 µL 无细胞因子的 T 细胞培养基中孵育。
   2. 孵育 6–24 小时后，按照试剂盒制造商的操作说明，通过 ELISA 或细胞内染色法检测细胞因子的产生。
      注意：在我们对靶向 IA^g7-B:9-23 的 T 细胞的研究中，将细胞与表达 IA^g7-B:R3 或“空载”IA^g7 的 M12C3 小鼠 B 细胞淋巴瘤细胞共培养过夜^24,25，然后收集上清液，并采用 ELISA 法检测分泌的小鼠干扰素 γ（IFN-γ）²⁶（图 5）。

结果

通常，使用本方案的转导效率约为 60–90%。在 图3 所示的实验中，分选前大约有 70% 的 CD8 T 细胞共表达 GFP，这些细胞同时也共表达 CD28 和 CD3（图3C）。重要的是，所有“实验组”GFP⁺ 细胞均能与 IA^g7-B:R3 四聚体共染色，但不与对照四聚体结合（图4）。类似地，分选后的实验组和对照组 CAR-T 细胞仅在与表达相应配体的靶细胞共培养后，才分泌高水平的 IFN-γ（图5）。这证实了转导后的细胞具有针对亲本抗体靶标的 CD8 效应 T 细胞表型。

讨论

本方案描述了一种通过逆转录病毒转导高效制备抗原特异性CD8 CAR-T细胞的方法。本方案的转导效率通常较高，且一般可观察到CAR的稳定表达。扩增后的CAR T细胞保留了亲代活化T细胞的基本特性以及抗体特异性，适用于体外和体内实验。我们已将Ab-CAR CD8 T细胞应用于NOD小鼠1型糖尿病的重编程研究⁷。

本方案在先前描述的方法基础上进行了多项关键性改进。首先，我们采用了一种优化的T细胞培养基，可实现更长的激活时间。所述完全培养基含有多种关键添加剂的最佳浓度，能显著提高T细胞激活后的存活率和增殖程度。需要注意的是，小鼠IL-2可替代人源蛋白并获得相当的效果，但目前人IL-2更具成本优势。值得注意的是，使用激活40–48小时的T细胞进行转导，其转导效率显著高于仅激活24小时的细胞。

其次，我们采用了一种改进的转导方法，该方法去除了对T细胞有毒性的聚凝胺B（polybrene B），转而使用纤维连接蛋白（fibronectin），从而进一步提高了细胞存活率。需要注意的是，为确保良好...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇（50 mM）	Gibco	21985-023	50 μM
5’ RACE PCR	Clontech	634859
抗小鼠 CD28 抗体	eBioscience	14-0281-86	终浓度为 1µg/ml
抗小鼠 CD3e 抗体	eBioscience	145-2C11	终浓度为 1µg/ml
生物素标记大鼠抗小鼠 IFN-γ	BD Biosciences	554410	工作浓度为 0.5 µg/ml
BSA	Sigma	A7030
无内毒素大提纯试剂盒（Endo-free Maxi-Prep kit）	Qiagen	12362
庆大霉素	Gibco	15750-060	终浓度为 50 µg/ml
热灭活胎牛血清（FCS）	Hyclone	SH30087.03	终浓度为 10% FCS
HEPES（100X）	Gibco	15630-080	1X
IAg7-CLIP 四聚体-BV421	Emory 大学 NIH 四聚体中心	按批准提供	工作浓度为 6 µg/ml
IAg7-胰岛素 P8E 四聚体-BV421	Emory 大学 NIH 四聚体中心	按批准提供	工作浓度为 6 µg/ml
胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS 100x）	ThermoFisher	51500056	终浓度为 1x
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS 分离缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-221
小鼠 CD8a+ T 细胞分离试剂盒	Miletenyi Biotec Inc	130-104-075
小鼠 CD8a+ T 细胞分离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-104-075
Opti-MEM 培养基	ThermoFisher	31985070
青霉素-链霉素（5000 U/ml）	ThermoFisher	15070063	50 U/ml
Phoenix-ECO 细胞	ATCC	CRL-3214
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010-023
pMIG II	Addgene	52107
pMSCV-IRES-GFP II	Addgene	52107
纯化型大鼠抗小鼠 IFN-γ	BD Biosciences	551216	工作浓度为 3 µg/ml
红细胞裂解缓冲液	Sigma	R7767
RetroNectin	Takara	T100A	在 PBS 中工作浓度为 50 µg/ml
rhIL-2（储存浓度 105 IU/μl）	Peprotech	200-02	终浓度为 200 IU/ml
rmIL-7（储存浓度 50 ng/μl）	R&D	407-ML-005	终浓度为 0.5 ng/ml
RPMI-1640	Gibco	11875-093
无菌细胞筛	Fisher Scientific	22-363-548
Tryple	Gibco	12605-028