本方案展示了如何使用Auto-CHO软件进行寡糖的分级和可编程一锅法合成。同时描述了RRV测定 实验以及SSEA-4一锅法糖基化的一般操作流程。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种可编程的“一锅法”寡糖合成通用实验方案，并演示了如何使用 Auto-CHO 软件生成潜在的合成路径。该可编程“一锅法”寡糖合成方法旨在利用硫苷类构筑单元（BBLs）并结合精确的相对反应活性值（RRVs）顺序，实现大量寡糖的快速合成。Auto-CHO 是一款跨平台的图形化软件，可通过支持向量回归准确预测 RRVs，并在 BBL 库（包含约 150 个已验证的和 >50,000 个虚拟 BBLs）中搜索，为可编程“一锅法”寡糖合成提供可能的合成方案。Auto-CHO 已经实现了分步“一锅法”合成的算法，能够将“一锅法”反应生成的片段作为新的 BBLs 进行后续利用。此外，Auto-CHO 允许用户对虚拟 BBLs 提供反馈，以保留有价值的构筑单元供后续使用。本文以阶段特异性胚胎抗原 4（SSEA-4）的“一锅法”合成为例进行演示，SSEA-4 是一种多能性人类胚胎干细胞标志物。
引言
碳水化合物在自然界中广泛存在1,2，但由于这类分子难以获取，其存在形式和作用机制仍属未知领域，主要原因在于获取此类分子存在困难3。与寡肽和寡核苷酸的自动化合成不同，寡糖的自动化合成发展仍面临巨大挑战，进展相对缓慢。
为解决这一问题，Wong 等人开发了首个用于寡糖合成的自动化方法，该方法采用一种名为 Optimer4 的可编程软件程序，指导从约 50 种 BBL 的库中选择 BBL，以进行连续的一锅法反应。每种 BBL 均经过设计和合成，其反应活性通过不同的保护基团进行精确调控。采用该方法，可在合成过程中最大限度地减少保护基操作和中间体纯化的复杂性，而这两者一直被认为是实现自动化合成最难克服的问题。尽管取得了这一进展，该方法仍存在较大局限性，因为 BBL 的数量过少，且 Optimer 程序仅能处理某些小型寡糖。对于需要更多 BBL、多次一锅法反应以及片段缩合的更复杂寡糖，研究人员已开发出该软件程序的升级版本 Auto-CHO5。
在 Auto-CHO 中，已加入超过 50,000 个对 BBL 文库具有明确反应性的 BBL，其中包括 154 个合成 BBL 和 ....
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方案
1. Auto-CHO 软件操作
- Java运行时环境安装：请确保设备上已安装Java运行时环境（JRE）。若JRE已安装，请进入下一步“软件初始化”；否则，请根据用户的操作系统从以下地址下载并安装JRE： <https://www.oracle.com/technetwork/java/javase/downloads/index.html>.
- 软件初始化：访问 Auto-CHO 网站 <https://sites.google.com/view/auto-cho/home> 根据操作系统下载相应的软件。目前，Auto-CHO 支持 Windows、macOS 和 Ubuntu 系统。最新的 PDF 用户指南可在 Auto-CHO 官网获取。
- 对于 Windows 用户，解压缩该文件 Auto-CHO_Windows.zip 并双击 Auto-CHO.jar 在 Auto-CHO_Windows 文件夹以启动程序。
注意：用户需要安装解压缩软件，例如 7-Zip，可从以下网址获取 <https://www.7-zip.org>，用于解压 zip 文件。用户也可以使用 java -jar Auto-CHO.jar 通过 Windows 命令提示符启动程序的命令。
- 对于 Windows 用户，解压缩该文件 Auto-CHO_Windows.zip 并双击 Auto-CHO.jar 在 Auto-CHO_Windows 文件夹以启动程序。
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结果
基于默认参数设置的 Auto-CHO 搜索结果表明，SSEA-4 可通过 [2 + 1 + 3] 一锅法反应合成。图3 展示了 SSEA-4 搜索结果的软件截图。当选择一个三糖还原端受体时（图3，标签 1），程序显示了该查询的四种潜在解决方案。第一种方案包含一个片段（图3，标签 2），其计算产率约为 94%。该片段可通过两个 BBL 反应构建（图3，标签 3）。第一个二糖 BBL 的 RRV 为 1462，第二个单糖的 RRV 为 32.0。图3 的标签 4 显示了在该一锅反应中建议使用的第一个 BBL 的化学结构。一锅反应实验表明，根据该建议可成功以 43% 的产率合成 SSEA-4（图4），此结果在先前的研究中也已.......
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讨论
Auto-CHO 软件旨在协助化学家进行寡糖的分步式、可编程一锅合成5。该软件使用 Java 编程语言开发，是一款支持 Windows、macOS 和 Ubuntu 的跨平台图形用户界面（GUI）软件。用户可从 Auto-CHO 官方网站 <https://sites.google.com/view/auto-cho/home> 免费下载该软件，其源代码依据 MIT 许可证发布，可在 GitHub 上获取，地址为 <https://github.com/CW-Wayne/Auto-CHO>。
Auto-CHO 的 BBL 文库包含 154 个实验性 BBL 以及超过 50,000 个具有准确预测 RRV 值的虚拟 BBL。目前，虚拟 BBL 中的糖类型包括 Gal、Glc、Man、GalNAc、GlcNAc、GlcN 和 GlcA。所有文库搜索均在本地计算机上处理，我们不会收集用户的任何查询结构。由于化学反应中存在多种结构限制或未知因素，Auto-CHO 无法保证程序提供的虚拟 BBL 能够成功实现高产.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由台湾“中央研究院”包括卓越计划、台湾科技部 [MOST 104-0210-01-09-02、MOST 105-0210-01-13-01、MOST 106-0210-01-15-02] 以及美国国家科学基金会（NSF 1664283）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| 无水硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 钼酸铵铈 | TCI | C1794 | |
| 二氯甲烷 | Sigma-Aldrich | 75-09-2 | |
| Drierite | Sigma-Aldrich | 7778-18-9 | |
| 乙酸乙酯 | Sigma-Aldrich | 141-78-6 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| 4 型分子筛 Å | Sigma-Aldrich | ||
| n- 己烷 | Sigma-Aldrich | 110-54-3 | |
| N-Iodosuccinimide | Sigma-Aldrich | 516-12-1 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| 硫代硫酸钠 | Sigma-Aldrich | 10102-17-7 | |
| 甲苯 | Sigma-Aldrich | 108-88-3 | |
| 三氟甲磺酸 | Sigma-Aldrich | 1493-13-6 |
参考文献
- Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochimica Et Biophysica Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
- Sears, P., Wong, C. -H. Toward Automated Synthesis of Ol....
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