本方案展示了如何使用Auto-CHO软件进行寡糖的分级和可编程一锅法合成。同时描述了RRV测定 实验以及SSEA-4一锅法糖基化的一般操作流程。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种可编程的“一锅法”寡糖合成通用实验方案，并演示了如何使用 Auto-CHO 软件生成潜在的合成路径。该可编程“一锅法”寡糖合成方法旨在利用硫苷类构筑单元（BBLs）并结合精确的相对反应活性值（RRVs）顺序，实现大量寡糖的快速合成。Auto-CHO 是一款跨平台的图形化软件，可通过支持向量回归准确预测 RRVs，并在 BBL 库（包含约 150 个已验证的和 >50,000 个虚拟 BBLs）中搜索，为可编程“一锅法”寡糖合成提供可能的合成方案。Auto-CHO 已经实现了分步“一锅法”合成的算法，能够将“一锅法”反应生成的片段作为新的 BBLs 进行后续利用。此外，Auto-CHO 允许用户对虚拟 BBLs 提供反馈，以保留有价值的构筑单元供后续使用。本文以阶段特异性胚胎抗原 4（SSEA-4）的“一锅法”合成为例进行演示，SSEA-4 是一种多能性人类胚胎干细胞标志物。
引言
碳水化合物在自然界中广泛存在1,2，但由于这类分子难以获取，其存在形式和作用机制仍属未知领域，主要原因在于获取此类分子存在困难3。与寡肽和寡核苷酸的自动化合成不同，寡糖的自动化合成发展仍面临巨大挑战，进展相对缓慢。
为解决这一问题，Wong 等人开发了首个用于寡糖合成的自动化方法，该方法采用一种名为 Optimer4 的可编程软件程序，指导从约 50 种 BBL 的库中选择 BBL，以进行连续的一锅法反应。每种 BBL 均经过设计和合成，其反应活性通过不同的保护基团进行精确调控。采用该方法，可在合成过程中最大限度地减少保护基操作和中间体纯化的复杂性，而这两者一直被认为是实现自动化合成最难克服的问题。尽管取得了这一进展，该方法仍存在较大局限性，因为 BBL 的数量过少，且 Optimer 程序仅能处理某些小型寡糖。对于需要更多 BBL、多次一锅法反应以及片段缩合的更复杂寡糖，研究人员已开发出该软件程序的升级版本 Auto-CHO5。
在 Auto-CHO 中，已加入超过 50,000 个对 BBL 文库具有明确反应性的 BBL，其中包括 154 个合成 BBL 和 50,000 个虚拟 BBL。这些 BBL 是基于基本性质、计算得到的核磁共振（NMR）化学位移6, 7以及分子描述符8，通过机器学习设计而成，这些因素影响 BBL 的结构与反应性。随着该升级版程序及新 BBL 集合的推出，合成能力得到扩展，如本文所示，若干目标寡糖可被快速制备。人们认为，这一新进展将有助于寡糖的合成，从而推动对其在多种生物过程中作用及其对糖蛋白和糖脂结构与功能影响的研究。此外，由于该方法可免费向科研界开放，本研究预计将显著惠及糖科学领域。本文展示了关键的人类胚胎干细胞标志物 SSEA-45 的合成过程。
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方案
1. Auto-CHO 软件操作
- Java运行时环境安装：请确保设备上已安装Java运行时环境（JRE）。若JRE已安装，请进入下一步“软件初始化”；否则，请根据用户的操作系统从以下地址下载并安装JRE： <https://www.oracle.com/technetwork/java/javase/downloads/index.html>.
- 软件初始化：访问 Auto-CHO 网站 <https://sites.google.com/view/auto-cho/home> 根据操作系统下载相应的软件。目前，Auto-CHO 支持 Windows、macOS 和 Ubuntu 系统。最新的 PDF 用户指南可在 Auto-CHO 官网获取。
- 对于 Windows 用户，解压缩该文件 Auto-CHO_Windows.zip 并双击 Auto-CHO.jar 在 Auto-CHO_Windows 文件夹以启动程序。
注意：用户需要安装解压缩软件，例如 7-Zip，可从以下网址获取 <https://www.7-zip.org>，用于解压 zip 文件。用户也可以使用 java -jar Auto-CHO.jar 通过 Windows 命令提示符启动程序的命令。 - 对于 macOS 用户，右键单击 Auto-CHO.jar 并选择 打开 启动程序。
- 对于使用 Ubuntu 的用户：
- 使用以下命令安装 libcanberra-gtk：
$ sudo apt-get install libcanberra-gtk* - 更改访问权限 Auto-CHO_Ubuntu.sh:
$ chmod 755 Auto-CHO_Ubuntu.sh - 运行 Auto-CHO 程序：
$ ./Auto-CHO_Ubuntu.sh
- 使用以下命令安装 libcanberra-gtk：
- 对于 Windows 用户，解压缩该文件 Auto-CHO_Windows.zip 并双击 Auto-CHO.jar 在 Auto-CHO_Windows 文件夹以启动程序。
- 输入所需的聚糖结构。选择绘制聚糖结构或读取现有的结构文件。
- 通过绘图输入：
- 点击 使用 GlycanBuilder 编辑聚糖9,10 (图1，btn1； 图2A）或区域的面积 点击此处编辑合成目标 使用 GlycanBuilder 绘制并编辑查询结构。不应忽略连接和手性信息。点击 Globo-H, SSEA-4，或 OligoLacNAc 按钮（图1，示例）以显示示例。
- 选择 文件 | 导出为序列格式 | 导出为 GlycoCT 简并格式 保存编辑后的结构（可选）。
- 关闭 GlycanBuilder 对话框以完成编辑。
- 通过读取文件输入：
- 点击 使用 GlycanBuilder 编辑糖链 (图1，btn1； 图2A）或区域面积 点击此处编辑合成目标 调整查询结构。
- 选择 文件 | 从序列格式导入 选择具有相应格式的查询结构文件。
- 通过绘图输入：
- 搜索参数设置（可选）。
- 在“参数设置” 标签页 (图1，标签2）以获得合理的搜索结果。
注意：
高致病性RRV的阈值 必须为实数且≥0。
中型类别远程遥控车辆的阈值 必须为实数且≥0。
高品质RRV的阈值 应为 >中型级别 RRV 的阈值.
最大片段数 应为整数且≥1。
片段中的最小 BBL 数量 必须为整数，且介于 1 和 3 之间。
片段中的最大 BBL 数量 必须为整数，且介于 1 和 3 之间。
片段中的最大 BBL 数量 必须 ≥片段中的最小 BBL 数量.
最小供体/受体 RRV 差值 必须是一个正实数。
最小供体/受体 RRV 比值 必须是一个正实数。
最大供体/受体 RRV 比值 必须是一个正实数。
最大供体/受体 RRV 比值 必须 >最小供体/受体 RRV 比值. - 点击 好的 单击按钮以启用新设置。
- 在“参数设置” 标签页 (图1，标签2）以获得合理的搜索结果。
- 选择构建模块库（图1，表5）。默认设置仅为搜索实验库。若需同时搜索实验库和虚拟库，请按以下步骤操作。
- 选择 虚拟构建模块库 标签图2C， 表5）。实验与虚拟构建模块可协同工作，以增强Auto-CHO的搜索能力。目前，Auto-CHO的数据库中已提供超过50,000个具有预测RRV值的虚拟构建模块。
- 选择 使用实验库与虚拟库 并应用 过滤 显示符合特定条件的虚拟构件。单击 显示选定的虚拟 BBL 按钮（图2C，btn5）以仅显示所选的虚拟构建模块。
- 点击 显示筛选后的虚拟 BBL 按钮（图2C，btn6）以仅显示用户定义特定条件的虚拟构建模块。
- 点击 显示所有虚拟 BBL 按钮（图2C，btn7）以显示所有可用的虚拟构建模块并重置筛选器。
- 选择一个或多个用户希望用于搜索的虚拟构建模块。
- 选择 查询结构 标签图 1，点击标签1（tab1）并单击 搜索构建模块库 按钮（图 1，btn2）以查找目标结构的单步合成方案，然后确认参数设置。
- 在结果查看器中搜索。
注意：搜索结果将显示在 结果可视化 标签图1，表6）。不同残基数量的还原端受体显示于 减少末端受体 柱图1，viewer1）。- 选择一个还原端受体，相应的溶液将显示在 合成溶液列表 (图1, viewer2）。片段显示在 片段列表 (图1，viewer3）以建议合成过程中应使用多少个片段。
注意：该系统提供每个片段的详细信息，包括片段的相对反应值（RRV）、计算产率，以及为在下一步一锅反应中使用该片段而需要脱除的保护基团。用于组装所选片段的构建单元在查看器4中显示。 图1. 第5位观看者 图1 还显示片段连接信息。 - 查看并核对所选构筑单元在各区域中的化学结构及详细信息 构筑单元的化学结构 和 构建模块浏览器分别为实验构建模块（图1，表4）。
- 选择一个还原端受体，相应的溶液将显示在 合成溶液列表 (图1, viewer2）。片段显示在 片段列表 (图1，viewer3）以建议合成过程中应使用多少个片段。
- 将搜索结果输出为文本（可选）。
- 选择 结果文本 标签图1，表7）。
- 点击 保存结果文本 (图2B，btn4）并选择文本文件的保存位置。
- 虚拟构建模块的反馈（可选）
注意：可通过在线问卷对虚拟模块提供反馈。反馈有助于社区保留有用的虚拟模块，并移除无效的模块。- 选择 虚拟构建模块 标签图1，表5）。
- 点击 评分 希望对其评分或评论的虚拟模块的链接 反馈 柱
- 系统打开网页后，请填写反馈表并提交。
注意：请勿更改虚拟 BBL ID。
2. RRV 测定实验
- 在10 mL圆底烧瓶中，加入两种硫代糖苷供体（每种0.02 mmol：Dr4 是已知RRV的参考供体；Dx1 是未知RRV的供体分子，加入绝对甲醇（0.10 mmol）和Drierite的二氯甲烷（DCM，1.0 mL）溶液，于室温（RT）下搅拌1小时。
- 取该混合液的等分试样（30 µL），分三次进样（每次进样10 µL）至高效液相色谱（HPLC）中。测定吸收值之间的系数（a）A）以及供体分子的浓度[D] 在基线分离条件下（乙酸乙酯/n-己烷 = 20/80
- 加入 0.5 M 溶液 N将碘代琥珀酰亚胺（NIS）的乙腈溶液（40 µL，0.02 mmol）加入反应混合物中，随后加入0.1 M三氟甲磺酸（TfOH）溶液（20 µL，0.002 mmol），于室温下搅拌反应混合物2小时。
- 用二氯甲烷（4.0 mL）稀释反应混合物，过滤，并用含有10%碳酸氢钠的饱和水溶液硫代硫酸钠洗涤（每次5 mL，共2次）。用二氯甲烷（每次5 mL，共3次）萃取水相。合并所有有机相，用5 mL饱和食盐水洗涤，再用约200 mg无水硫酸镁干燥。
- 轻轻振荡混合物30秒，通过带有褶皱滤纸的漏斗过滤，以除去硫酸镁，将滤液收集至25 mL圆底烧瓶中。使用旋转蒸发仪除去溶剂。
- 将残留物溶于二氯甲烷（1.0 mL）。取该混合液等分试样（30 µL），分三次进样至高效液相色谱仪（每次进样10 µL）。测定剩余供体的浓度（[Dx] 和 [D参考文献]) 通过高效液相色谱（HPLC）在相同的分离条件下（乙酸乙酯/正己烷 = 20/80）进行（A参考文献)t = 24417.0, (Ax)t = 23546.3.
- 测量 D 之间的相对反应活性x1 与 D 相比r4, kx1/kr4 = 0.0932。根据D的相对反应活性值r4，D的相对反应性值x1 是 3.
注意：a = A/[D]，（A参考文献)0 = 74530.1, (Ax)0 = 26143.0. kx/k参考文献 = (ln[Dx]t - ln[Dx]0)/(ln[D参考文献]t - ln[D参考文献]0) = (ln[Ax]t - ln[Ax]0)/(ln[A参考文献]t - ln[A参考文献]0) = 0.0932.
3. SSEA-4的一锅法糖基化反应
- 将一个10 mL圆底烧瓶置于真空下，用火焰干燥，并在保持真空的条件下冷却至室温。取下橡胶隔垫，向烧瓶中加入二糖供体1（38 mg，1.1当量，0.057 mmol）、第一个受体2（40 mg，1.0当量，0.053 mmol）以及一个聚四氟乙烯涂层磁力搅拌子。
- 将100 mg粉末状4 Å分子筛转移至一个5 mL圆底烧瓶中。将该烧瓶保持在真空下，用火焰干燥，并在保持真空的条件下冷却至室温。将新干燥的4 Å分子筛转移至含有起始物料的第一个烧瓶中。
- 向烧瓶中加入1 mL新近干燥的二氯甲烷（DCM）。在室温下搅拌反应混合物1小时，然后将其冷却至-40 °C。将NIS（13 mg，1.1当量，0.057 mmol）转移至烧瓶中。
- 在-40 °C条件下，使用微量注射器通过隔垫将TfOH（34 μL，0.3当量，0.017 mmol，乙醚中0.5 M溶液）注入烧瓶中。在-40 °C下继续搅拌3小时。
- 当第一个受体2几乎消耗完全后，通过隔垫将受体3的二氯甲烷溶液注入烧瓶中。
- 将反应混合物升温至-20 °C，并向烧瓶中加入NIS（19 mg，1.6当量，0.083 mmol）。在-20 °C条件下，通过隔垫注入TfOH（34 μL，0.3当量，0.017 mmol，乙醚中0.5 M溶液）。在-20 °C下继续搅拌3小时。
- 当第一步反应的产物消耗完全后，加入两当量的三乙胺淬灭反应。通过填充硅藻土的滤漏斗除去分子筛，将滤液收集至一个25 mL圆底烧瓶中，并用10 mL二氯甲烷进一步洗涤滤渣。
- 将滤液转移至分液漏斗中，用含10% NaHCO3的饱和硫代硫酸钠水溶液洗涤（每次10 mL，共洗两次）。用二氯甲烷萃取水相（每次10 mL，共萃取三次）。合并有机相，用饱和食盐水（10 mL）洗涤，并加入无水MgSO4干燥。过滤后，将滤液收集至一个100 mL圆底烧瓶中。
- 使用旋转蒸发仪除去溶剂。将粗产物用约1 mL二氯甲烷溶解后，加载至硅胶柱上。用乙酸乙酯与甲苯的混合溶剂（EtOAc/甲苯，1/4至1/2）洗脱产物，并收集相应馏分。
- 使用旋转蒸发仪除去溶剂。将残留物在减压下干燥，得到完全保护的SSEA-4衍生物4（74 mg，基于受体2计算产率为50%），为白色泡沫状固体。
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结果
基于默认参数设置的 Auto-CHO 搜索结果表明，SSEA-4 可通过 [2 + 1 + 3] 一锅法反应合成。图3 展示了 SSEA-4 搜索结果的软件截图。当选择一个三糖还原端受体时（图3，标签 1），程序显示了该查询的四种潜在解决方案。第一种方案包含一个片段（图3，标签 2），其计算产率约为 94%。该片段可通过两个 BBL 反应构建（图3，标签 3）。第一个二糖 BBL 的 RRV 为 1462，第二个单糖的 RRV 为 32.0。图3 的标签 4 显示了在该一锅反应中建议使用的第一个 BBL 的化学结构。一锅反应实验表明，根据该建议可成功以 43% 的产率合成 SSEA-4（图4），此结果在先前的研究中也已...
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讨论
Auto-CHO 软件旨在协助化学家进行寡糖的分步式、可编程一锅合成5。该软件使用 Java 编程语言开发，是一款支持 Windows、macOS 和 Ubuntu 的跨平台图形用户界面（GUI）软件。用户可从 Auto-CHO 官方网站 <https://sites.google.com/view/auto-cho/home> 免费下载该软件，其源代码依据 MIT 许可证发布，可在 GitHub 上获取，地址为 <https://github.com/CW-Wayne/Auto-CHO>。
Auto-CHO 的 BBL 文库包含 154 个实验性 BBL 以及超过 50,000 个具有准确预测 RRV 值的虚拟 BBL。目前，虚拟 BBL 中的糖类型包括 Gal、Glc、Man、GalNAc、GlcNAc、GlcN 和 GlcA。所有文库搜索均在本地计算机上处理，我们不会收集用户的任何查询结构。由于化学反应中存在多种结构限制或未知因素，Auto-CHO 无法保证程序提供的虚拟 BBL 能够成功实现高产...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由台湾“中央研究院”包括卓越计划、台湾科技部 [MOST 104-0210-01-09-02、MOST 105-0210-01-13-01、MOST 106-0210-01-15-02] 以及美国国家科学基金会（NSF 1664283）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| 无水硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 钼酸铵铈 | TCI | C1794 | |
| 二氯甲烷 | Sigma-Aldrich | 75-09-2 | |
| Drierite | Sigma-Aldrich | 7778-18-9 | |
| 乙酸乙酯 | Sigma-Aldrich | 141-78-6 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| 4 型分子筛 Å | Sigma-Aldrich | ||
| n- 己烷 | Sigma-Aldrich | 110-54-3 | |
| N-Iodosuccinimide | Sigma-Aldrich | 516-12-1 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| 硫代硫酸钠 | Sigma-Aldrich | 10102-17-7 | |
| 甲苯 | Sigma-Aldrich | 108-88-3 | |
| 三氟甲磺酸 | Sigma-Aldrich | 1493-13-6 |
参考文献
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- Ceroni, A., Dell, A., Haslam, S. M. The GlycanBuilder: a fast, intuitive and flexible software tool for building and displaying glycan structures. Source Code for Biology and Medicine. 2, 3(2007).
- Damerell, D., et al. The GlycanBuilder and GlycoWorkbench glycoinformatics tools: updates and new developments. Biological Chemistry. 393 (11), 1357-1362 (2012).
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