通过调节 Tau 蛋白的亚细胞定位研究疾病相关基因的表达

摘要

Tau 是一种神经元蛋白，存在于细胞质中，可结合微管，同时也存在于细胞核内，在其中发挥非常规功能，包括调控与阿尔茨海默病相关基因的表达。本文介绍一种在排除细胞质 Tau 干扰的情况下研究核内 Tau 功能的方法。

摘要

Tau 是一种在神经元中表达的微管结合蛋白，其已知的主要功能与细胞骨架稳定性的维持有关。然而，最近的研究证据表明，Tau 也存在于其他亚细胞区域，包括细胞核，在其中参与了DNA保护、rRNA转录、逆转座子的移动以及核仁的结构组织。我们最近证明了核内Tau参与VGluT1基因的表达，提示了一种可能解释阿尔茨海默病早期阶段谷氨酸释放病理性增加的分子机制。直到最近，由于技术上的限制，无法排除细胞质Tau的贡献或其他与核Tau无关的下游因素的影响，因此核Tau在调控靶基因表达中的作用一直相对不确定且模糊。为了克服这一不确定性，我们开发了一种方法，用于研究特异性受核Tau蛋白调控的靶基因表达。我们采用了一种结合定位信号与亚细胞组分分离的技术方案，从而能够排除细胞质Tau分子的干扰。尤为重要的是，该方案操作简便，由经典且可靠的方法组成，可广泛适用于在其他细胞类型和细胞状态下研究Tau蛋白的核功能。

引言

近年来，Tau蛋白在细胞核内的功能引起了广泛关注，因其已被证明与核酸密切相关^1,2,3,4,5,6。事实上，最近一项全基因组研究显示，Tau在体内可结合基因区和基因间区的DNA序列⁷。有研究提示Tau可能参与核仁的组织结构调控^8,9,10,11。此外，Tau被认为在保护DNA免受氧化应激和高温应激损伤方面发挥作用^5,10,12,13，而突变型Tau则与染色体不稳定性和非整倍体相关^14,15,16。

迄今为止，由于难以区分核内Tau蛋白与细胞质Tau蛋白各自的具体作用，研究Tau蛋白在细胞核区室中的功能所面临的挑战几乎仍未解决。此外，目前归因于核内Tau分子的功能仅具有相关性，因为缺乏对核内Tau蛋白直接参与作用的明确证明。事实上，Tau蛋白在逆转座子移动性、rRNA转录或DNA保护中的作用^{11,12,17,18,19}，也可能由细胞质Tau蛋白的作用或其他与核内Tau无关的下游因素所导致。

本文提供了一种方法，通过结合经典的细胞核分离步骤与带有核定位信号（NLS）或核输出信号（NES）标记的Tau蛋白0N4R构建体，解决上述问题。该方法可消除因Tau分子从细胞质区室溢出而可能产生的复杂假象。此外，Tau-NLS和Tau-NES构建体可分别诱导Tau分子在细胞核区室中的富集或排除，从而为研究核内Tau分子在特定功能中的作用提供阳性与阴性对照。本实验方案技术操作简便，由经典且可靠的方法组成，可广泛适用于研究Tau蛋白在其他细胞类型（无论是否分化）中的核功能，例如重新激活Tau表达的癌细胞^20,21。此外，该方法也可应用于其他同时存在于细胞质和细胞核中的蛋白质，以解析其在不同区室中的生物学功能。

方案

1. 细胞培养

1. 在完全培养基（DMEM/F-12 培养基，含 10% 胎牛血清 [FBS]、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）中培养 SH-SY5Y 细胞（人神经母细胞瘤细胞系，CRL-2266）。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。在 10 cm 培养皿中培养细胞，待细胞汇合后进行传代。

2. 细胞分化

1. 为了诱导 SH-SY5Y 细胞分化，在接种后的第二天，向完全培养基中加入 10 µM 视黄酸（RA），培养 5 天。
2. 第六天，更换为分化培养基：DMEM/F-12 培养基添加 50 ng/mL BDNF 和 2 mM L-谷氨酰胺。不要添加 FBS 或抗生素。
3. 将细胞在分化培养基中继续培养 3 天。

3. 嵌合体构建体的克隆

1. 通过限制性酶切克隆方法，将3xNLS(SV40NLS)序列：5'-CCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3'，按读码框连接至Tau序列0N4R（383个氨基酸）的3'端，构建Tau-NLS质粒。
   注意： 将位于Tau 3'端的3xNLS序列克隆至pCMV-Tau质粒的多克隆位点（MCS）中，利用XhoI和BamHI限制性酶切位点，用于哺乳动物细胞表达。
2. 通过限制性酶切克隆方法，将NES序列：5'-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTGGACTCGTACAA-3'，按读码框连接至Tau序列0N4R（383个氨基酸）的3'端，构建Tau-NES质粒。
   注意： 将位于Tau 3'端的NES序列克隆至pCMV-Tau质粒的多克隆位点（MCS）中，利用EcoRI和BamHI限制性酶切位点，用于哺乳动物细胞表达。
3. 将步骤3.1或3.2中获得的100 ng DNA转化至DH5alpha E.coli菌株中，并将菌液涂布于含100 mg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37 °C过夜培养。
4. 挑取单克隆菌落，接种至含氨苄青霉素的5 mL LB培养基中，于37 °C振荡培养过夜。
5. 使用质粒DNA小提试剂盒（材料表）提取质粒DNA，并进行测序以验证构建的质粒序列。
6. 将测序验证正确的构建质粒转化至DH5alpha E. coli菌株中，并将菌液涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37 °C过夜培养。
7. 挑取单克隆菌落，接种至含氨苄青霉素的5 mL LB培养基中，于37 °C振荡培养2小时。
8. 将步骤3.7中的菌液转入含氨苄青霉素的200 mL LB培养基中，于37 °C过夜培养。
9. 在4 °C条件下，以3,500 x g离心10分钟，收集菌体沉淀。
10. 使用质粒DNA大提试剂盒（材料表）提取质粒DNA。

4. 细胞转染

1. 将步骤 1.1 中的 400,000 个细胞接种于 6 孔板中，或 20,000 个细胞接种于 8 孔腔室载玻片中。共设置四组样品：转染空载体的对照细胞、转染无标签 Tau 的细胞、转染 Tau-NLS 的细胞，以及转染 Tau-NES 的细胞。
2. 接种后次日，按照制造商说明书，使用阳离子脂质（材料表）进行转染，6 孔板每孔加入 400 ng DNA，8 孔腔室载玻片每孔加入 200 ng DNA。
   1. 将 DNA 和阳离子脂质分别在 250 µL（用于 6 孔板）或 25 µL（用于 8 孔腔室载玻片）的低血清培养基中室温孵育 5 分钟。然后将两者混合以形成 DNA-脂质复合物，并继续孵育 20 分钟。
   2. 更换为 2 mL（用于 6 孔板）或 250 µL（用于 8 孔腔室载玻片）新鲜的完全培养基。将 DNA-脂质复合物加入细胞中，37 °C 过夜孵育。
3. 也可使用阳离子试剂聚乙烯亚胺（PEI）进行 DNA 转染。
   1. 将 2 µg DNA 与 6 µL PEI 溶于 200 µL 完全培养基中（用于 6 孔板每孔），或 1 µg DNA 与 3 µL PEI 溶于 100 µL 完全培养基中（用于 8 孔腔室载玻片每孔），涡旋混匀后室温孵育 10 分钟。
   2. 将混合物加入细胞中，并在 6 孔板中每孔补加 1.8 mL 完全培养基，或在 8 孔腔室载玻片中每孔补加 150 µL 完全培养基，以达到接种体积。
4. 转染后次日更换培养基，并加入步骤 2.2 中所述的分化培养基。

5. 免疫荧光

1. 吸去培养基，用1× PBS清洗细胞。加入预冷的100%甲醇，4℃固定3分钟，不摇动。去除固定液，用1× PBS短暂洗涤。
2. 用含0.1%非离子型表面活性剂的1× PBS在室温（RT）下透化处理5分钟。用1× PBS短暂洗涤，重复3次。
3. 加入封闭缓冲液（含0.1% Tween 20和1% BSA的PBS），在旋转摇床上室温孵育30分钟。
4. 加入适当的一抗（例如，小鼠单克隆抗Tau13抗体），用封闭缓冲液按1:500稀释，在旋转摇床上4℃孵育过夜。去除一抗溶液，用1× PBS短暂洗涤。
5. 加入荧光染料标记的二抗（例如，Alexa Fluor 633标记的山羊抗小鼠抗体），用封闭缓冲液按1:500稀释，在室温孵育1小时。去除二抗溶液，用1× PBS短暂洗涤3次。
6. 为染色细胞核，加入DAPI（用封闭缓冲液按1:20,000稀释），室温孵育10分钟。用1× PBS洗涤3次。将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上。

6. 蛋白质印迹

1. 从步骤 4.4 收集细胞沉淀，移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞。在 37 °C 下用 500 µL 0.1% 胰蛋白酶孵育 4 分钟。加入等体积的完全培养基并重悬细胞。
2. 将细胞收集至离心管中，在 500 × g 条件下离心 5 分钟。离心结束后小心移除上清液。加入 1 mL PBS，在 500 × g 条件下离心 5 分钟，再次小心移除上清液。将细胞沉淀置于冰上立即使用，或于 -80 °C 冻存以长期保存。
3. 对于总蛋白提取物，将细胞沉淀在裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8，20 mM NaCl，10% 甘油，1% 支化辛基苯氧基聚（乙二醇）乙醇（材料表），10 mM EDTA）中于冰上孵育 30 分钟，裂解缓冲液中需添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。根据沉淀量的多少，使用 50 µL 至 100 µL 裂解缓冲液。
   1. 在 16,000 × g 条件下离心提取物 15 分钟。收集上清液，并通过任何标准定量方法测定蛋白浓度。通过将 20 µg 蛋白与 5 µL 4× Laemmli 缓冲液混合至总体积为 20 µL，然后在 100 °C 下煮沸 5 分钟，制备 SDS-PAGE 所需的蛋白样品。
      注意： 样品可在 -20 °C 下保存。
4. 对于亚细胞组分分离，将步骤 6.2 的细胞重悬于完全培养基中，每份样品收集 1 × 10⁶ 个细胞。在 500 × g 条件下离心 10 分钟，获得用于后续步骤的细胞沉淀。
   1. 为分离亚细胞结构，按照试剂盒说明书进行组分分离。为分离各组分，将步骤 6.4 的细胞沉淀与相应缓冲液孵育，离心后收集上清液，并按 6.4.1.1–6.4.1.5 所述将下一缓冲液加入沉淀中。依次加入细胞质提取缓冲液、膜提取缓冲液、核提取缓冲液、添加了 5 mM CaCl₂ 和 3 U/µL 微球菌核酸酶的核提取缓冲液，以及细胞骨架提取缓冲液。
      注意： 所有缓冲液均需添加蛋白酶抑制剂。根据细胞沉淀体积调整缓冲液体积。
      1. 为分离胞质组分，将细胞沉淀在含有蛋白酶抑制剂的 100 µL 冰冷细胞质提取缓冲液中于 4 °C 轻柔混匀孵育 10 分钟。在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，将上清液转移至预冷的离心管中。
      2. 向步骤 6.4.1.1 的沉淀中加入 100 µL 含有蛋白酶抑制剂的冰冷膜提取缓冲液，在 4 °C 轻柔混匀孵育 10 分钟。在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液。
      3. 为获得可溶性核组分，向步骤 6.4.1.2 的沉淀中加入 50 µL 含有蛋白酶抑制剂的核提取缓冲液，涡旋混匀。在 4 °C 孵育 30 分钟，在 4 °C 下以 5,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液。
      4. 为获得不溶性核组分，向步骤 6.4.1.3 的沉淀中加入 50 µL 含有蛋白酶抑制剂、CaCl₂ 和微球菌核酸酶的核提取缓冲液，涡旋混匀。在 37 °C 孵育 5 分钟，再次涡旋。在室温下以 16,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液。
      5. 为获得细胞骨架组分，向步骤 6.4.1.4 的沉淀中加入 50 µL 含有蛋白酶抑制剂的细胞骨架提取缓冲液，涡旋混匀。在室温下孵育 10 分钟。以 16,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液并弃去沉淀。
         注意： 根据细胞体积调整缓冲液体积，具体参见试剂盒说明书。有关孵育时间、离心时间和温度的更多细节，请参考试剂盒说明书^{22,23,24,25,26,27,28,29}。或者，也可使用任何标准方法³⁰，通过使用去垢剂并逐步提高离子强度和离心速度，分离胞质、膜结合、细胞骨架和核组分。利用标准核提取缓冲液分离可溶性和不溶性核组分。样品可在 -20 °C 下保存。
   2. 对于 SDS-PAGE，向从步骤 6.4.1.1–6.4.1.5 获得的 20 µL 亚细胞组分中加入 7 µL 4× Laemmli 缓冲液，在 100 °C 下煮沸 5 分钟。
5. 将样品上样至丙烯酰胺凝胶，在恒定电压 120 V 条件下进行电泳。在 250 mA 条件下将蛋白转移至硝酸纤维素膜 90 分钟。
6. 将膜在 Ponceau 染色液中孵育 5 分钟，以检查蛋白凝胶电泳和转膜效果是否良好。用蒸馏水冲洗膜直至背景干净。再用含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）在摇床上持续洗涤 10 分钟以去除染色。
7. 将膜在封闭液（TBST 中含 5% 脱脂奶粉）中于室温摇床孵育 1 小时。用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
8. 将膜在封闭液（TBST 中含 1% 脱脂奶粉）中与一抗孵育，4 °C 过夜。用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
9. 将膜在封闭液中与 HRP 标记的二抗孵育，室温 1 小时。用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用化学发光法检测蛋白条带。使用 ImageJ 对 Western Blot 条带强度进行定量。将蛋白表达量归一化至内参基因产物：核可溶性和不溶性组分使用组蛋白 H2B，胞质组分和总提取物使用 GAPDH。

结果

为解析核内Tau蛋白对基因表达的影响，同时排除细胞质Tau蛋白的贡献，所采用的策略如图1所示。简言之，带有核定位信号（NLS）或核输出信号（NES）标签的Tau蛋白分别在细胞核内聚集或被排除在细胞核外。这种分布失衡的功能性效应表现为VGluT1基因表达产物的改变。

按照实验方案，SH-SY5Y 细胞先用 RA 处理 5 天，再用 BDNF 处理 3 天，以获得终末分化、具有神经元样形态的细胞（图 2）。在未添加 RA 和 BDNF 的情况下，未分化的 SH-SY5Y 细胞呈现较圆的形态，并形成细胞团块。正如预期，启动分化程序后，细胞团块散开，细胞开始延伸出神经突；分化结束时，细胞均匀分布，并通过分支状神经突网络相互连接。

讨论

我们描述了一种用于检测核内Tau蛋白对基因表达影响的方法。该实验方案显著限制了细胞质Tau蛋白的干扰。本方案的关键步骤包括：人源神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的分化、亚细胞组分分离以及Tau蛋白在细胞核区室中的定位。

首先，如代表性结果部分所示，通过添加RA和BDNF诱导SH-SY5Y细胞分化，对于在体外培养中获得高质量的类神经元细胞至关重要。接种细胞的密度尤为关键，因为密度过低可能影响细胞增殖。此外，对于需要大量细胞的实验（如细胞组分分离和Western blot），需特别注意：BDNF诱导分化阶段会阻断细胞增殖，以促进终末分化，从而限制了培养中细胞的数量。其他替代性分化方案可能仅使用RA或NGF代替BDNF。然而，已有研究表明，在RA处理后添加BDNF可实现更优的形态学分化^32,33，而NGF在SH-SY5Y细胞中诱导的 neurite outgrowth（ neurite 生长）较弱³⁴。此外，大量研究已充分证实...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 633 山羊抗小鼠 IgG	Life Technologies	A21050	免疫荧光 1:500
抗肌动蛋白抗体	BETHYL LABORATORIE	A300-485A	抗兔 WB 1:10,000
抗 GAPDH 抗体	Fitzgerald Industries International	10R-G109a	抗小鼠 WB 1:10,000
抗 H2B 抗体	Abcam	ab1790	抗兔 WB 1:15,000
抗 Tau-13 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	抗小鼠 WB 1:1,000；免疫荧光 1:500
抗微管蛋白 α 抗体	Thermo Fisher Scientific	PA5-16891	抗小鼠 WB 1:5,000
抗 VGluT1 抗体	Sigma-Aldrich	AMAb91041	抗小鼠 WB 1:500
BCA 蛋白定量检测试剂盒	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
印迹级封闭剂	Biorad	1706404	脱脂奶粉
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	蛋白酶抑制剂
Criterion TGX 4-20% 无染预染胶，10 孔	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
杜氏改良伊格尔培养基低糖型	Euroclone	ECM0060L
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH = 8, 0.5 M
胎牛血清	Euroclone	EC50182L
甘油	Sigma-Aldrich	G5516-500ml
山羊抗小鼠 IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	WB 1:1,000
山羊抗兔 IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004	WB 1:1,000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	辛基苯氧基聚乙氧基乙醇
Immobilon Western	MERCK	WBKLS0500
Lab-Tech 8 孔腔室载玻片	nunc	177402
L-谷氨酰胺	Euroclone	ECB3000D	100X
Lipofectamine 2000 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	12566014	阳离子脂质
甲醇	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM 减血清培养基	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40,872-7
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL，100 mL
磷酸盐缓冲液（Dulbecco A）	OXOID	BR0014G
PhosStop	Roche	4906837001	磷酸酶抑制剂
QIAGEN 质粒大提试剂盒	Qiagen	12163	步骤 3.10
视黄酸	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
培养细胞亚细胞蛋白分级分离试剂盒	Thermo Fisher Scientific	78840
支撑型硝酸纤维素膜	Biorad	1620097
TC-6 孔培养板	SARSTEDT	833,920
TCS SP2 激光共聚焦显微镜	Leica	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	非离子型表面活性剂
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	15400054	0.50%
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV 小量质粒 DNA 纯化系统	Promega	A1330	步骤 3.5