通过调节 Tau 蛋白的亚细胞定位研究疾病相关基因的表达

摘要

Tau 是一种神经元蛋白，存在于细胞质中，可结合微管，同时也存在于细胞核内，在其中发挥非常规功能，包括调控与阿尔茨海默病相关基因的表达。本文介绍一种在排除细胞质 Tau 干扰的情况下研究核内 Tau 功能的方法。

摘要

Tau 是一种在神经元中表达的微管结合蛋白，其已知的主要功能与细胞骨架稳定性的维持有关。然而，最近的研究证据表明，Tau 也存在于其他亚细胞区域，包括细胞核，在其中参与了DNA保护、rRNA转录、逆转座子的移动以及核仁的结构组织。我们最近证明了核内Tau参与VGluT1基因的表达，提示了一种可能解释阿尔茨海默病早期阶段谷氨酸释放病理性增加的分子机制。直到最近，由于技术上的限制，无法排除细胞质Tau的贡献或其他与核Tau无关的下游因素的影响，因此核Tau在调控靶基因表达中的作用一直相对不确定且模糊。为了克服这一不确定性，我们开发了一种方法，用于研究特异性受核Tau蛋白调控的靶基因表达。我们采用了一种结合定位信号与亚细胞组分分离的技术方案，从而能够排除细胞质Tau分子的干扰。尤为重要的是，该方案操作简便，由经典且可靠的方法组成，可广泛适用于在其他细胞类型和细胞状态下研究Tau蛋白的核功能。

引言

近年来，Tau蛋白在细胞核内的功能引起了广泛关注，因其已被证明与核酸密切相关^1,2,3,4,5,6。事实上，最近一项全基因组研究显示，Tau在体内可结合基因区和基因间区的DNA序列⁷。有研究提示Tau可能参与核仁的组织结构调控^8,9,10,11。此外，Tau被认为在保护DNA免受氧化应激和高温应激损伤方面发挥作用^5,10,12,13，而突变型Tau则与染色体不稳定性和非整倍体相关

方案

1. 细胞培养

1. 在完全培养基（DMEM/F-12 培养基，含 10% 胎牛血清 [FBS]、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）中培养 SH-SY5Y 细胞（人神经母细胞瘤细胞系，CRL-2266）。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。在 10 cm 培养皿中培养细胞，待细胞汇合后进行传代。

2. 细胞分化

1. 为了诱导 SH-SY5Y 细胞分化，在接种后的第二天，向完全培养基中加入 10 µM 视黄酸（RA），培养 5 天。
2. 第六天，更换为分化培养基：DMEM/F-12 培养基添加 50 ng/mL BDNF 和 2 mM L-谷氨酰胺。不要添加 FBS 或抗生素。
3. 将细胞在分化培养基中继续培养 3 天。

3. 嵌合体构建体的克隆

1. 通过限制性酶切克隆方法，将3xNLS(SV40NLS)序列：5'-CCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3'，按读码框连接至Tau序列0N4R（383个氨基酸）的3'端，构建Tau-NLS质粒。
   注意： 将位于Tau 3'端的3....

结果

为解析核内Tau蛋白对基因表达的影响，同时排除细胞质Tau蛋白的贡献，所采用的策略如图1所示。简言之，带有核定位信号（NLS）或核输出信号（NES）标签的Tau蛋白分别在细胞核内聚集或被排除在细胞核外。这种分布失衡的功能性效应表现为VGluT1基因表达产物的改变。

按照实验方案，SH-SY5Y 细胞先用 RA 处理 5 天，再用 BDNF 处理 3 天，以获得终末分化、具有神经元样形态的细胞（图 2）。在未添加 RA 和 BDNF 的情况下，未分化的 SH-SY5Y 细胞呈现较圆的形态，并形成细胞团块。正如预期，启动分化程序后，细胞团块散开，细胞开始延伸出神经突；分化结束时，细胞均匀分布，并通过分支状神经突网络相互连接。

讨论

我们描述了一种用于检测核内Tau蛋白对基因表达影响的方法。该实验方案显著限制了细胞质Tau蛋白的干扰。本方案的关键步骤包括：人源神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的分化、亚细胞组分分离以及Tau蛋白在细胞核区室中的定位。

首先，如代表性结果部分所示，通过添加RA和BDNF诱导SH-SY5Y细胞分化，对于在体外培养中获得高质量的类神经元细胞至关重要。接种细胞的密度尤为关键，因为密度过低可能影响细胞增殖。此外，对于需要大量细胞的实验（如细胞组分分离和Western blot），需特别注意：BDNF诱导分化阶段会阻断细胞增殖，以促进终末分化，从而限制了培养中细胞的数量。其他替代性分化方案可能仅使用RA或NGF代替BDNF。然而，已有研究表明，在RA处理后添加BDNF可实现更优的形态学分化^32,33，而NGF在SH-SY5Y细胞中诱导的 neurite outgrowth（ neurite 生长）较弱³⁴。此外，大量研究已充分证实.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 633 山羊抗小鼠 IgG	Life Technologies	A21050	免疫荧光 1:500
抗肌动蛋白抗体	BETHYL LABORATORIE	A300-485A	抗兔 WB 1:10,000
抗 GAPDH 抗体	Fitzgerald Industries International	10R-G109a	抗小鼠 WB 1:10,000
抗 H2B 抗体	Abcam	ab1790	抗兔 WB 1:15,000
抗 Tau-13 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	抗小鼠 WB 1:1,000；免疫荧光 1:500
抗微管蛋白 α 抗体	Thermo Fisher Scientific	PA5-16891	抗小鼠 WB 1:5,000
抗 VGluT1 抗体	Sigma-Aldrich	AMAb91041	抗小鼠 WB 1:500
BCA 蛋白定量检测试剂盒	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
印迹级封闭剂	Biorad	1706404	脱脂奶粉
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	蛋白酶抑制剂
Criterion TGX 4-20% 无染预染胶，10 孔	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
杜氏改良伊格尔培养基低糖型	Euroclone	ECM0060L
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH = 8, 0.5 M
胎牛血清	Euroclone	EC50182L
甘油	Sigma-Aldrich	G5516-500ml
山羊抗小鼠 IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	WB 1:1,000
山羊抗兔 IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004	WB 1:1,000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	辛基苯氧基聚乙氧基乙醇
Immobilon Western	MERCK	WBKLS0500
Lab-Tech 8 孔腔室载玻片	nunc	177402
L-谷氨酰胺	Euroclone	ECB3000D	100X
Lipofectamine 2000 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	12566014	阳离子脂质
甲醇	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM 减血清培养基	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40,872-7
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL，100 mL
磷酸盐缓冲液（Dulbecco A）	OXOID	BR0014G
PhosStop	Roche	4906837001	磷酸酶抑制剂
QIAGEN 质粒大提试剂盒	Qiagen	12163	步骤 3.10
视黄酸	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
培养细胞亚细胞蛋白分级分离试剂盒	Thermo Fisher Scientific	78840
支撑型硝酸纤维素膜	Biorad	1620097
TC-6 孔培养板	SARSTEDT	833,920
TCS SP2 激光共聚焦显微镜	Leica	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	非离子型表面活性剂
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	15400054	0.50%
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV 小量质粒 DNA 纯化系统	Promega	A1330	步骤 3.5