陶子细胞定位作为研究疾病相关基因表达的工具的调制

Summary

Tau 是一种神经元蛋白，存在于细胞质中，它结合微管，在细胞核中，它发挥非常规功能，包括与阿尔茨海默氏病相关基因的调制。在这里，我们描述了一种研究核Tau功能的方法，同时排除了来自细胞质陶的任何干扰。

Abstract

Tau是一种在神经元中表达的微管结合蛋白，其主要已知功能与维持细胞骨骼稳定性有关。然而，最近的证据表明，Tau也存在于其他亚细胞室中，包括其与DNA保护、rRNA转录、逆转录泊剂流动性和结构组织有关的细胞核。核仁。我们最近已经证明，核Tau参与VGluT1基因的表达，建议一种分子机制，可以解释谷氨酸释放在阿尔茨海默氏病的早期阶段的病理增加。直到最近，由于技术限制，防止了细胞质Tau的贡献或其它影响，核陶参与调节目标基因的表达一直相对不确定和模糊。下游因素与核陶无关。为了克服这种不确定性，我们开发了一种方法，研究由核Tau蛋白专门调节的目标基因的表达。我们采用了一种协议，将定位信号和亚细胞分馏的使用耦合在一起，从而排除了细胞质Tau分子的干扰。最值得注意的是，该协议是容易的，由经典和可靠的方法组成，广泛适用于研究Tau在其他细胞类型和细胞条件下的核功能。

Introduction

Tau蛋白在核中的功能近年来引起了极大的兴趣，因为它已被证明与核酸^{1，2，3，4，5，6}密切相关。事实上，最近的一项全基因组研究表明，Tau在体内结合基因和基因DNA序列^。在核组织中的作用已被建议8，9，10，11。此外，Tau被建议参与DNA保护，免受氧化和高热应激^{5、10、12、13}的影响，而突变的陶已与染色体不稳定和抗倍体14、15、16有关。^<....

Protocol

1. 细胞培养

1. 培养SH-SY5Y细胞（人类神经母细胞瘤细胞系，CRL-2266）在完整的介质（Dulbeco的改性鹰培养基:营养混合物F12[DMEM/F-12]补充10%胎儿牛血清[FBS]，2mM L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100微克/mL链霉素）。将孵化器中的细胞保持在37°C和_5%CO2。在10厘米的板中生长细胞，并在汇入时分裂。

2. 细胞分化

1. 为了区分SH-SY5Y细胞，在电镀后的第二天，加入10μM视黄酸（RA）以完成5天的培养基。
2. 第六天用分化介质替换介质:DMEM/F-12辅以50纳克/mL BDNF、2 mM L-谷氨酰胺。不要添加FBS或抗生素。
3. 在分化培养基中生长细胞3天。

3. 奇美构造克隆

1. 通过通过在 Tau 序列 0N4R （383aa） 3xNLS （SV40NLS） 的 3xNLS （SV40NLS） 的 3xNLS （SV40NLS）的帧中限制酶消化来生成 Tau-NLS 构造:5'-CCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA....

Results

图1描述了用于剖析核陶在基因表达中避免细胞质Tau蛋白贡献的策略。简单地说，标有NLS或NES标记的Tau蛋白分别在核隔间中积累或排除。这种不平衡的功能效应是作为VGluT1基因产物测量的基因表达的改变。

按照协议描述，SH-SY5Y细胞用RA处理5天，然后用BDNF治疗3天，以获得后线神经样细胞（图2）。在没有RA和BDNF的情况下，未分化的SH-SY5Y细胞假定为圆形形态并形成细胞团块。正如所料，开始分化协议，团块展开，细胞扩散神经酸盐;在分化结束时，细胞通过分支神经酸盐网络均匀分布和互连。

播种后的第二天，细胞被转染为陶-NLS或Tau-NES质粒（第4.2节），具有阳离子脂质。对于表达Tau-NLS或Tau.......

Discussion

我们描述了一种测量核Tau蛋白对基因表达影响的方法。有了这个协议，细胞质陶的贡献是强烈的限制。该协议的关键步骤如下:人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的分化、亚细胞分馏和Tau蛋白在核腔中的定位。

首先，如代表性结果部分所示，通过添加RA和BDNF来分化SH-SY5Y细胞对于在培养中获得神经元样细胞的良好制备至关重要。播种的细胞密度特别重要，因为较低的密度可能会影响细胞增殖。此外，对于需要大量细胞的实验（如细胞分馏和西体斑点），必须注意BDNF分化步骤阻止细胞增殖，从而允许终端分化，从而限制培养细胞的数量。替代差别化协议只使用RA或NGF，而不是BDNF。然而，虽然在RA后添加BDNF允许达到更好的形态分化32，33，NGF诱导在SH-SY5Y细胞³⁴中较弱的神经质外生长。此外，已经证明，RA和BDNF的组合允许获得一个同质神经元群体与神经元标记的表达和减少增殖^35。因此.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 633 山羊抗小鼠 IgG	Life Technologies	A21050	IF 1：500
抗肌动蛋白抗体	BETHYL LABORATORIE	A300-485A	抗兔 WB 1：10,000
抗 GAPDH 抗体	Fitzgerald Industries International	10R-G109a	抗小鼠 WB 1：10,000
抗 H2B 抗体	Abcam	ab1790	抗兔 WB 1：15,000
抗 Tau-13 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	抗小鼠 WB 1：1,000;IF 1：500
抗微管蛋白 α 抗体	Thermo Fisher Scientific	PA5-16891	抗小鼠 WB 1：5,000
抗 VGluT1 抗体	Sigma-Aldrich	AMAb91041	抗小鼠 WB 1：500
BCA 蛋白质检测试剂盒	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
印迹级封闭剂	BioRad	1706404	脱脂奶粉
博文血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	蛋白酶抑制剂
Criterion TGX 4-20% 免染，10 孔	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
Dulbecco 改良 Eagle的中低葡萄糖	Euroclone	ECM0060L
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH = 8,0.5 M
胎牛血清	Euroclone	EC50182L
甘油	Sigma-Aldrich	G5516-500ml
山羊抗小鼠 IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	WB 1：1,000
山羊抗兔 IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004	WB 1：1,000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	辛基苯氧基聚（乙烯氧基）乙醇
固定子	MERCK	WBKLS0500
Lab-Tech Chamber 载玻片 8 孔载玻片	Nunc	177402
L-谷氨酰胺	Euroclone	ECB3000D	100X
Lipofectamine 2000 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	12566014	阳离子脂质
甲醇	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl<亚>2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM 还原血清培养基	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40,872-7
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL，100 mL
磷酸盐缓冲盐水 （Dulbecco A）	OXOID	BR0014G
PhosStop	Roche	4906837001	磷酸酶抑制剂
QIAGEN 质粒 Maxi 试剂盒	Qiagen	12163	步骤 3.10
用于培养细胞的视黄酸	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
亚细胞蛋白分离试剂盒	Thermo Fisher Scientific	78840
支持的硝酸纤维素膜	Biorad	1620097
TC 板 6 孔	SARSTEDT	833,920
TCS SP2 激光扫描共聚焦显微镜	Leica	N/A
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	非离子表面活性剂
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	15400054	0.50%
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
VECTASHIELD 抗淬灭封固剂	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA 纯化系统	Promega	A1330	步骤 3.5