方法文章

在氧化应激期间细胞粘附和纤维蛋白扩散动力学

DOI：

10.3791/59989

⸱

2019年10月13日

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1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Chemistry, High Point University, 3Biotechnology Program and the Department of Molecular Biomedical Sciences, North Carolina State University

本文内容

摘要

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该方法可用于量化细胞粘附的早期动力学，并将锚固依赖细胞扩散到纤维质。此外，此测定可用于研究改变的氧化还原平衡对细胞扩散和/或细胞粘附相关细胞内信号通路的影响。

摘要

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细胞粘附和扩散到细胞外基质（ECM）是有机体发育和成人组织平衡过程中必不可少的细胞过程。有趣的是，氧化应激可以改变这些过程，从而促进转移性癌症等疾病的病理生理学。因此，了解在氧化还原状态扰动期间细胞如何附着和在ECM上传播的机制，可以深入了解正常和疾病状态。下面描述是一个循序式方案，它利用基于免疫荧光的测定来具体量化细胞粘附和在体外纤维素（FN）上传播不朽的成纤维细胞。简单地说，锚固依赖细胞被悬浮，并暴露于ATM激酶抑制剂Ku55933诱导氧化应激。然后，在 FN 涂层表面上镀层，并允许在预定的时间段内附着。仍然附着的细胞是固定的，并标有荧光基抗体标记的附着力（例如，白辛）和扩散（例如，F-actin）。数据采集和分析使用常用的实验室设备进行，包括荧光显微镜和免费提供的斐济软件。此过程用途广泛，可针对各种细胞系、ECM 蛋白或抑制剂进行修改，以检查广泛的生物学问题。

引言

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细胞基质粘附（即焦点粘附）是大而动态的多分子蛋白复合物，可调节细胞粘附和扩散。这些过程对于组织发育、维护和生理功能至关重要。焦点粘附由膜结合受体（如整数）以及将细胞骨骼功能素与细胞外基质（ECM）1联系起来的脚手架蛋白组成。这些复合物能够通过激活各种信号转导途径来响应细胞外环境中的物理化学线索。因此，焦点粘附作为信号中心，将细胞外机械线索传播到许多细胞过程，包括定向迁移、细胞周期调节、分化和存活1、2。一组调节焦点粘附并与之相互作用的信号分子包括小GTPases的Rho家族的成员。Rho GTPass是关键的蛋白质，通过它们特定的时空活化3调节细胞迁移和粘附动力学。毫不奇怪，Rho蛋白功能调节障碍与一些人类病理有关，如转移、血管生成等。特别令人感兴趣的是，细胞氧化还原状态在细胞迁移和粘附的调制中起着主要作用。氧化还原平衡的改变，如活性氧物种（ROS）的增加，已被证明可以调节许多细胞类型和人类疾病中的Rho蛋白活性和附着力4、5、6 ，7，

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方案

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1. 准备工作

注: 下面描述的协议已针对 REF52 细胞和 ATM+/*或 ATM-/-人成纤维细胞的使用进行了优化。其他单元格类型可能需要进一步优化，如下面的说明和故障排除部分所述。





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结果

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实验设置的一般架构

图1显示了从REF52细胞血清饥饿开始，以获得荧光图像的计算分析结束的细胞粘附和扩散协议的一般架构。时间线中说明了协议中的关键步骤。值得注意的是，协议的第 2 步描述了 FN 涂层盖玻片的制备，该表应与步骤 3 同时进行:血清饥饿的 REF52 细胞在将其置于悬浮状态之前（图 1A）。在荧光显微镜样品固定之前，一个模拟标记的24孔板示例，指示治疗组和细胞粘附持续时间（图1B）。

聚焦粘附定量的免疫荧光图像处理

REF52细胞被暂停90分钟，在FN上镀层，并允许再粘附15分钟。在用抗白素抗体固定和染色后，获得细胞的荧光8位灰度图像。根据步骤5中规定的协议进行了图像处理分析。图2C、CLAHE（图2C）、高斯模糊（图2A）和背景.......

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讨论

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此处描述的协议是一种通用且经济的方法，可快速筛选多个与锚固相关的细胞类型，以便在细胞扩散期间进行动态细胞骨架重塑。特别是，当细胞粘附在FN上时，这种方法定量地检查氧化应激期间的应力纤维和焦点粘附形成（图1A）。此外，这些细胞表型可能建议一个监管作用的Rho家族的小GTPases的成员，因为他们有记录的作用，在细胞附件和传播15，16，22。然而，需要额外的生化技术，以确定可能参与的GTP绑定，活跃的Rho家族蛋白。

提出的方案利用F-actin和paxillin的免疫荧光检测，在ATM激酶抑制引起氧化应激作用后，专门检查FN上不朽成纤维细胞的细胞粘附和扩散情况（图2，图 3

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披露

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提交人宣称，他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

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作者感谢斯科特·赫顿博士和梅根·布莱克利奇博士对手稿的批判性评论。这项工作由高点大学的研究和赞助项目（MCS）和北卡罗来纳州立大学生物技术项目资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA （1x）Gibco25300-054细胞解离
10 cm2 培养皿细胞处理229620无菌、经组织培养处理
15 mL 锥形管Fisher Scientific05-539-5无菌
1X 磷酸盐缓冲盐水Corning Cellgro21-031-CVPBS，无菌，不含 Mg2+ 和 Ca2+
24 孔细胞培养处理板Fisher Scientific07-200-740无菌，组织培养处理
4°C 冰箱Fisher Scientific
小鼠 IgG 抗桩蛋白一抗（克隆 165）BD Transduction Laboratories610620黏着斑标志物
吸引器ArgosEV310
生物安全柜NuairNU-477-400II 类，A 型，系列 5
脱脂牛血清白蛋白（无脂肪酸）粉末Fisher科学BP9704-100dlBSA
二甲基亚砜Fisher ScientificBP231-100有机溶剂溶解 Ku55933
Dulbecco's 改良 Eagle 培养基，高葡萄糖Fisher Scientific11965092REF52 基础细胞培养基
牛血清Fisher Scientific16000044认证，斐
济细胞培养基补充剂美国国立卫生研究院http://fiji.sc/图像分析程序
过滤注射器Fisher Scientific6900-25020.2 µM，无菌
玻璃盖玻片 （12-Cir-1.5）Fisher Scientific12-545-81高压灭菌器，用于消毒
羊抗小鼠 IgG 二抗 Alexa Fluor 488InvitrogenA11001荧光二抗，Life Technologies 的光敏
山羊血清Gibco16210-064免疫荧光血细胞计数器封闭液的组分
Fisher Scientific22-600-107用于细胞计数
人血浆纤连蛋白Gibco33016-015FN
IX73 荧光倒置显微镜奥林巴斯显微镜，用于可视化荧光、细胞形态、计数和解离
Ku55933Sigma-AldrichSML1109-25MGATM 激酶抑制剂，活性氧诱导剂物种
L-谷氨酰胺Fisher Scientific25-030-081细胞培养基补充剂
单色 CMOS 16 位相机Optimos
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148-500GPFA，免疫荧光固定剂
青霉素-链霉素Fisher Scientific15-140-122P/S，培养基用抗生素溶液
Alexa Fluor 594 鬼笔环肽（F-肌动蛋白探针）InvitrogenA12381F-肌动蛋白标志物，
光敏 ProLong Gold 抗淬灭试剂，含 DAPIInvitrogenP36941盖玻片封固剂，包括细胞核染料 DAPI、光敏
REF52 细胞Graham， D.M. 等人 Journal of Cell Biology 2018
热控制的搅拌板Corning IncorporatedPC-420D
注射器BD Biosciences 30965360 mL 注射器
组织培养箱Nuair
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500用于透化细胞膜的去污剂
台盼蓝溶液Fisher Scientific15-250-061用于细胞计数
胰蛋白酶中和溶液 （1x）Life Technologies 的 GibcoR-002-100TNS，中和胰蛋白酶而不是胎牛血清
管旋转器Fisher Scientific11-676-341
水浴Fisher ScientificFSGPD02
Life Technologies 的 的 胎山Life Technologies 带

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M.

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Paxillin F actin Fiji Ku55933

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