在氧化应激条件下研究上皮细胞在纤连蛋白上的细胞黏附与铺展动态过程

摘要

该方法可用于定量分析贴壁依赖性细胞在纤连蛋白上的早期黏附和铺展动态。此外，该实验还可用于研究氧化还原稳态改变对细胞铺展和/或细胞黏附相关胞内信号通路的影响。

摘要

细胞在细胞外基质（ECM）上的黏附与铺展是生物体发育过程中以及成体组织稳态维持所必需的基本细胞过程。有趣的是，氧化应激可改变这些过程，从而参与转移性癌症等疾病的病理生理机制。因此，了解在氧化还原状态发生扰动时细胞如何在ECM上黏附和铺展的机制，有助于深入理解正常生理状态及疾病状态。下文所述是一种分步实验方案，利用基于免疫荧光的检测方法，在体外定量分析永生化成纤维细胞在纤连蛋白（FN）上的细胞黏附与铺展。简言之，将依赖贴壁生长的细胞保持在悬浮状态，并用ATM激酶抑制剂Ku55933处理以诱导氧化应激。随后将细胞接种于FN包被的表面，在预设的时间段内使其黏附。对仍保持黏附的细胞进行固定，并使用基于荧光的抗体标记物对黏附（如paxillin）和铺展（如F-actin）进行标记。数据的采集与分析采用实验室常见的设备完成，包括落射荧光显微镜和免费开源的Fiji软件。该方法具有高度的可变通性，可根据需要调整用于多种细胞系、ECM蛋白或抑制剂，以探究广泛的生物学问题。

引言

细胞-基质黏附（即局灶性黏附）是介导细胞黏附和铺展的大型动态多分子蛋白复合物。这些过程对于组织发育、维持及生理功能至关重要。局灶性黏附由膜结合受体（如整合素）以及将细胞骨架肌动蛋白与细胞外基质（ECM）连接起来的支架蛋白组成¹。这些复合物能够通过激活多种信号转导通路，响应细胞外环境中存在的理化信号。因此，局灶性黏附作为信号传导中心，将细胞外机械信号传递至多种细胞过程，包括定向迁移、细胞周期调控、分化和存活^1,2。其中一组调控并参与局灶性黏附的信号分子是小GTP酶Rho家族成员。Rho GTP酶是通过其特定时空激活来调控细胞迁移和黏附动态的关键蛋白³。毫不奇怪，Rho蛋白功能失调已被证实与多种人类病理过程相关，如转移、血管生成等。特别值得关注的是，细胞氧化还原状态在调控细胞迁移和黏附中起主导作用。在多种细胞类型和人类疾病中，氧化还原稳态的改变（如活性氧（ROS）水平升高）已被证明可调控Rho蛋白活性以及细胞黏附行为^4,5,6,7,

方案

1. 准备工作

注意：以下所述方案已针对 REF52 细胞以及 ATM^+/+ 或 ATM^-/- 人成纤维细胞的使用进行了优化。其他细胞类型可能需要进一步优化，具体请参见下文的注意事项与故障排除部分。

1. 配制500 mL REF52细胞完全培养基。向500 mL含高糖的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中加入10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和100单位/mL青霉素-链霉素。
2. 制备一种 25 μg/mL 通过添加纤连蛋白（FN）溶液 300 μL 将1 mg/mL的FN溶液12 mL加入到12 mL无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，充分混匀。
3. 配制0.5% (w/v) 脱脂（即无脂肪酸）牛血清白蛋白（dlBSA）溶液：将0.5 g dlBSA加入100 mL无血清DMEM细胞培养基中。充分混匀，但勿涡旋振荡。使用 0.22 μM 使用前用注射器滤器过滤。储存于 4 °C.
4. 配制3.7%的多聚甲醛溶液：将3.7 g多聚甲醛溶解于100 mL 1× PBS中。使用温和加热并搅拌以促进多聚甲醛溶解。
   注意：多聚甲醛溶液对光敏感，应避光保存。在4 °C下保存时，可稳定存放长达一周。 4 °C.
   警告：多聚甲醛具有毒性、易燃、腐蚀性，且对健康有害。使用前请查阅多聚甲醛的材料安全数据表。操作时应佩戴适当个人防护装....

结果

实验设置的通用示意图

图1展示了从REF52细胞的血清饥饿开始，到获取荧光图像后的计算分析结束的细胞黏附与铺展实验的整体流程示意图。该流程中的关键步骤在时间轴上进行了图示说明。值得注意的是，步骤2描述了纤连蛋白（FN）包被盖玻片的制备，应与步骤3同时进行：即在将REF52细胞置于悬浮状态之前对其进行血清饥饿处理（图1A）。图中还给出了一个模拟标记的24孔板示例，用于指示固定样品进行荧光显微镜观察前的不同处理分组及细胞黏附持续时间（图1B）。

用于黏着斑定量的免疫荧光图像处理

将REF52细胞悬浮培养90分钟，然后接种于纤连蛋白（FN）表面，继续黏附15分钟。固定后使用抗paxillin抗体进行染色，获取细胞的荧光8位灰度图像。图像处理分析按照步骤5中所述方案进行。图中展示了各关键处理步骤的代表性图像，包.......

讨论

本文所述方案是一种快速、经济且用途广泛的方法，可用于筛选多种贴壁依赖性细胞在铺展过程中细胞骨架动态重塑的情况。特别是，该方法可定量分析细胞在黏附于纤连蛋白（FN）时，氧化应激条件下应力纤维和黏着斑的形成情况（图1A）。此外，这些细胞表型可能提示Rho家族小GTP酶成员具有调控作用，因为已有文献报道其在细胞黏附与铺展过程中发挥功能^15,16,22。然而，仍需借助其他生化技术来确定GTP结合态的活性Rho家族蛋白是否可能参与其中。

本方案采用F-actin和paxillin的免疫荧光检测，以特异性观察ATM激酶抑制诱导氧化应激后，永生化成纤维细胞在纤连蛋白（FN）上的细胞黏附与铺展情况（图2、 图3

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25300-054	细胞解离
10 cm² 培养皿	Cell Treat	229620	无菌，组织培养处理
15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	05-539-5	无菌
1× 磷酸盐缓冲液	Corning Cellgro	21-031-CV	PBS，无菌，不含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺
24 孔细胞培养板	Fisher Scientific	07-200-740	无菌，组织培养处理
4°C 冰箱	Fisher Scientific
小鼠 IgG 抗 paxillin 一抗（克隆 165）	BD Transduction Laboratories	610620	黏着斑标记物
吸液器	Argos	EV310
生物安全柜	Nuair	NU-477-400	II 级，A 型，series 5
去脂牛血清白蛋白（无脂肪酸）粉末	Fisher Scientific	BP9704-100	dlBSA
二甲基亚砜	Fisher Scientific	BP231-100	溶解 Ku55933 的有机溶剂
杜尔贝科改良伊格尔培养基，高糖	Fisher Scientific	11965092	REF52 基础细胞培养基
胎牛血清	Fisher Scientific	16000044	经认证的细胞培养基补充剂
Fiji	美国国立卫生研究院	http://fiji.sc/	图像分析程序
滤器注射器	Fisher Scientific	6900-2502	0.2 µm，无菌
玻璃盖玻片 (12-Cir-1.5)	Fisher Scientific	12-545-81	用铝箔包裹后高压灭菌
山羊抗小鼠 IgG 二抗 Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	荧光二抗，避光
山羊血清	Gibco by Life Technologies	16210-064	免疫荧光封闭液组分
血细胞计数板	Fisher Scientific	22-600-107	用于细胞计数
人血浆纤连蛋白	Gibco by Life Technologies	33016-015	FN
IX73 荧光倒置显微镜	Olympus		用于观察荧光、细胞形态、计数和解离
Ku55933	Sigma-Aldrich	SML1109-25MG	ATM 激酶抑制剂，活性氧诱导剂
L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	25-030-081	细胞培养基补充剂
单色 CMOS 16 位相机	Optimos
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148-500G	PFA，免疫荧光固定剂
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	15-140-122	P/S，培养基用抗生素溶液
Alexa Fluor 594 鬼笔环肽（F-肌动蛋白探针）	Invitrogen	A12381	F-肌动蛋白标记物，避光
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36941	含细胞核染料 DAPI 的封片介质，避光
REF52 细胞			Graham, D.M. 等，Journal of Cell Biology 2018
带加热控制的搅拌板	Corning Incorporated	PC-420D
注射器	BD Biosciences	309653	60 mL 注射器
组织培养孵箱	Nuair
曲拉通 X-100	Fisher Scientific	BP151-500	用于细胞膜通透的去垢剂
台盼蓝溶液	Fisher Scientific	15-250-061	用于细胞计数
胰蛋白酶中和液 (1x)	Gibco by Life Technologies	R-002-100	TNS，用于中和胰蛋白酶，替代胎牛血清
管式旋转仪	Fisher Scientific	11-676-341
水浴锅	Fisher Scientific	FSGPD02