方法文章

一种可定制的二萜类天然产物酶法合成与纯化方法

DOI：

10.3791/59992

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2019年10月4日

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1Department of Plant Biology, University of California Davis

本文内容

摘要

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本文介绍了通过在大肠杆菌（Escherichia coli）或本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中组合表达生物合成酶，进而生产并纯化二萜类代谢产物的简便实验方案。所获得的代谢产物适用于多种研究，包括分子结构表征、酶功能研究以及生物活性测定。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

二萜类化合物是一类结构多样的小分子天然产物，广泛分布于生物界的各个类群中，在发育过程、生物间相互作用以及环境适应中具有重要的生物学功能。由于这些多样的生物活性，许多二萜类化合物作为药物、食品添加剂、生物燃料及其他生物制品，也具有重要的经济价值。先进的基因组学和生化研究方法极大地促进了人们对二萜类代谢基因、酶及代谢通路的认识。然而，二萜类化合物结构复杂，且单个化合物通常仅存在于少数物种甚至单一物种中，这种有限的分类分布仍是其高效生产的制约因素。目前，越来越多的代谢酶资源已被获得，为实现足够滴度和纯度的二萜类化合物生产提供了可能，从而推动对该类重要代谢物的深入研究。基于已建立的微生物和植物酶共表达技术，本文提供了一种操作简便且可定制的实验方案，可用于在大肠杆菌（Escherichia coli）或本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中酶法合成二萜类化合物，并通过硅胶色谱和半制备型高效液相色谱（HPLC）纯化目标产物。以玉米（Zea mays） dolabralexin 类二萜化合物为例，我们展示了如何通过模块化组合二萜合酶（diTPS）与细胞色素P450单加氧酶（P450）来生成不同的二萜类骨架结构。所获得的纯化化合物可用于多种后续应用，如代谢物结构分析、酶的结构与功能研究，以及体外和植物体内的生物活性实验。

引言

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二萜类化合物是一类化学结构多样的天然产物，主要由超过12,000种多环状的20碳分子组成，在多种生物体中发挥关键作用1。真菌和植物产生的二萜类化合物种类最为丰富，但研究也发现细菌能够合成具有生物活性的二萜类化合物（参见综述2,3,4,5）。基于其广泛的结构多样性，二萜类化合物具有多种生物学功能。少数二萜类化合物（如赤霉素类生长激素）在发育过程中具有必需的生理功能5。然而，大多数二萜类化合物主要作为化学防御和生物间相互作用的介导分子。其中，针叶树中用于抵御害虫和病原体的二萜树脂酸，以及在玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）等主要粮食作物中发现的物种特异性抗菌二萜类化合物混合物，已被广泛研究6,7。这些生物活性特性为商业应用提供了丰富的化学资源，部分二萜类化合物已被用作重要的药物、食品添加剂、粘合剂以及其他现代日常生活中的生物制品8,9,10。为了推动对二萜类化合物天然多样性及其生物学功能的研究，并最终促进其更广泛的商业化应用，亟需开发能够高效、低成本制备高纯度化合物的技术手段。目前，少数二萜类生物制品（如造纸工业副产物中的二萜树脂酸）已实现从植物材料中的大规模提取8。然而，二萜类化合物通常仅在特定组织中积累，且其合成受到环境刺激的严格调控，这常常限制了从天然来源获得足够量的目标产物2。此外，二萜类化合物结构复杂，也阻碍了其通过化学合成途径进行生产，尽管在某些情况下化学合成已取得成功11,12。随着基因组学和生物化学技术的进步，酶法生产平台在合成多种二萜类化合物方面正受到越来越多的关注（参见综述13,14,15,16,17,18）。

所有萜类化合物（包括二萜类化合物）均来源于两种异构的异戊二烯前体：异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。19 这些物质分别通过甲羟戊酸（MVA）途径或甲基赤藓糖醇-5-磷酸（MEP）途径形成。在细菌中，萜类化合物的生物合成通过MEP途径进行，而在真菌中则通过MVA途径进行；植物则同时具有存在于细胞质中的MVA途径和存在于质体中的MEP途径，其中后者是二萜类化合物形成的主要途径。20由焦磷酸异戊烯酯（IPP）与二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）经 prenyl 转移酶缩合生成所有二萜类化合物的中心20碳前体——香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）20在GGPP形成之后，萜类合酶（TPSs）和细胞色素P450单加氧酶（P450s）这两个酶家族主要调控萜类代谢中广泛化学多样性的形成21,22二萜合酶（diTPSs）催化GGPP发生碳正离子驱动的环化和重排反应，生成多种立体专一性的双环、多环或大环二萜骨架1,3,23,24随后通过P450酶和某些其他酶家族实现这些支架的氧化及进一步功能化修饰22,25TPSs 和 P450s 通常以物种特异性的多基因家族形式存在，可形成模块化的生物合成网络，通过在共同的合成蓝图上组合不同的酶模块，从而生成多种多样的化合物2,26近年来，模块化萜类代谢途径中功能各异的酶被迅速发现，这为将其用作代谢工程的多功能元件库提供了日益广泛的机会，可用于在微生物和植物生产平台中构建部分或完整的代谢途径。例如，酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）已成功应用于构建多酶代谢通路，以生产萜类生物产品，例如抗疟药物青蒿素27倍半萜类生物燃料β-榄香烯和法尼烯28，还选择性地筛选二萜类化合物29,30,31同样地，经过改造的 大肠杆菌 已为少数二萜类代谢产物建立了工业规模生产的平台，包括用作抗癌药物的紫杉醇前体紫杉二烯，以及香料工业中使用的二萜醇香紫苏醇13,32,33,34遗传工程和转化技术的进步也使得植物宿主系统在生产植物天然产物方面变得越来越可行。9,14,35,36特别是与烟草亲缘关系较近的物种， Nicotiana benthamiana，已成为萜类化合物途径分析与工程改造中广泛使用的底盘细胞，因其易于操作 农杆菌介导的多基因组合转化、内源前体的高效生物合成以及高生物量14,35,36.

基于这些已建立的萜类生物合成平台，本文介绍了一种易于使用且成本效益高的二萜类化合物酶法生产及单体化合物纯化方法。所展示的实验方案说明了如何利用经过改造以增强二萜类前体生物合成的 E. coli 和 N. benthamiana 平台，通过组合表达不同的二萜合酶（diTPS）和P450酶，生成目标二萜类化合物。本方案通过玉米（Zea mays）中一类特化的二萜类化合物——dolabralexins 的生产和纯化实例，展示了其在结构各异的二萜类化合物制备中的应用。dolabralexins 的内源性生物合成涉及两种二萜合酶和一种P450酶。不同类型的dolabralexins（从烯烃类到含氧衍生物）的纯化，可通过分液漏斗萃取结合大规模硅胶柱层析和制备型高压液相色谱（HPLC）联用实现。所述实验方案已针对二萜类化合物的生产进行了优化，但也可便捷地拓展应用于其他具有可用酶资源的萜类化合物及其他天然产物。利用该方法制得的化合物适用于多种下游应用，包括但不限于通过核磁共振（NMR）分析进行结构表征、作为酶功能研究的底物，以及多种生物活性检测。

方案

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警告：本文所述实验方案涉及危险化学品、尖锐物品、电气设备、高温物体及其他可能导致伤害的危险因素。应佩戴适当的个人防护装备，并遵循相应的安全操作规程，包括接受安全培训。

1. 材料与溶液的准备

  1. 制备并高压灭菌溶菌肉汤培养基（LB）30分钟：每1 L培养基，称取10 g胰蛋白胨、5 g细菌酵母提取物和10 g NaCl，溶于1 L去离子水（DI水）中。
  2. 对于1 L共表达培养，制备并高压灭菌优质肉汤（TB）培养基30分钟：在2.8 L的锥形瓶中加入12 g胰蛋白胨、24 g细菌酵母提取物和40 mL 10%（v/v）甘油，溶于860 mL去离子水中。另制备并高压灭菌1.3 L的10倍浓度磷酸盐缓冲液［1.3 L去离子水、30.03 g磷酸二氢钾（KH2PO4）和163.02 g磷酸氢二钾（K2HPO4）］，然后加入上述培养基中。
  3. 制备含分解代谢抑制的超级优化肉汤（SOC）培养基。
    1. 制备含有2%（w/v）胰蛋白胨、0.5%（w/v）细菌酵母提取物、8.5 mM NaCl和2.5 mM KCl的溶液，并高压灭菌30分钟。
    2. 加入无菌的MgSO4和葡萄糖，使其终浓度均为20 mM。用1 M NaOH调节pH至7.0。将SOC培养基储存于-20 °C。
  4. 制备1 L 1 M丙酮酸钠溶液，高压灭菌15分钟，储存于4 °C。
  5. 在无菌去离子水中制备20 mL 1 M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）溶液。分装成1–2 mL每份，储存于-20 °C。
  6. 制备浸润缓冲液：将10 mM MES（1.952 g）和10 mM MgCl2（2.033 g）溶于1 L去离子水中，储存于4 °C。
  7. 制备并高压灭菌LB琼脂培养基30分钟：每100 mL去离子水中加入1 g胰蛋白胨、0.5 g细菌酵母提取物、1 g NaCl和1.5 g琼脂。待LB琼脂冷却至可操作温度后，根据所需质粒组合加入相应的抗生素。使用培养皿倒制琼脂平板，并储存于4 °C。
    1. 有关大肠杆菌（E. coli）和本氏烟草（N. benthamiana）中化合物生产的具体信息，请参见表1。含利福平的平板需用铝箔包裹，以防止储存过程中降解。
工作浓度（µg/mL）
抗生素储存液浓度（mg/mL）溶剂1 个质粒2 个质粒3 或 4 个质粒
羧苄西林50H2O502520
氯霉素30EtOH302020
卡那霉素50H2O502520
链霉素30H2O302520
庆大霉素50H2O30
利福平10MeOH10

表1：在 E. coli 或 N. benthamiana 中进行质粒共表达时所用抗生素浓度。

2. 二萜类代谢产物的生产 E. coli

注意：此处所述在大肠杆菌（E. coli）中生产二萜类代谢物的实验方案，已根据美国爱荷华州立大学 Reuben J. Peters 博士团队先前报道的酶共表达平台进行调整13,32。

  1. 用质粒组合转化感受态细胞
    1. 解冻化学感受态细胞 E. coli 冰上的细胞（本方案使用 BL21DE3-C41 细胞）。
    2. 向1.5 mL微量离心管中的25 µL感受态细胞中加入1 µL浓度为100 ng/µL的各共表达质粒溶液。切勿涡旋或用移液器吹打混匀。
      注意：为了实现TPS和P450酶的最佳表达与活性，需考虑若干序列修饰。对于TPS，通常必须去除N端质体转运肽。具体而言，质体单萜和二萜合酶通常需要去除预测的转运肽（可使用常见的预测算法）。37），而细胞质中的倍半萜合酶（sesqui-TPS）通常可直接使用全长基因。对于P450酶，密码子优化以及去除或替换其N端跨膜结构域，并代之以信号肽序列MAKKTSSKGK，在许多情况下已被证明是有效的策略。38,39此外，在共表达P450酶时，应同时共表达细胞色素P450还原酶（CPR），以确保足够的P450酶活性。
    3. 将混合物置于冰上孵育30分钟。每隔10分钟，轻轻将离心管在微量离心管架上刮擦混匀。
    4. 将含有相应抗生素的 SOC 培养基和 LB 琼脂平板在 37 °C 预温育，抗生素种类根据所需构建组合确定。
      注意：每种需共转化的质粒必须具有不同的抗生素抗性基因和不同的复制起点，以确保最佳的蛋白表达。
    5. 将细胞混合物在 42 °C 下热激 1 分钟，然后在冰上孵育至少 2 分钟。
    6. 加入 200 µL 预热的 SOC 培养基。
    7. 将细胞混合物在37 °C、200 rpm条件下振荡1小时。
    8. 向预热的LB琼脂平板中加入约10颗已灭菌的玻璃珠。加入100 µL细胞混合液，盖上平板盖。盖上盖子后水平摇动平板，使细胞均匀分布。通过轻敲将玻璃珠抖入废液容器中去除。也可采用其他常用的涂布方法。
    9. 将LB琼脂平板于37 °C过夜培养，涂布面朝下。含有转化菌的平板 E. coli 菌落可在次日使用，或用石蜡膜密封后在4 °C保存长达2周。
  2. 接种培养物的制备
    1. 第二天，根据所提供的浓度，配制含有转化质粒组合所需抗生素的LB培养基溶液 表1.
    2. 在无菌操作台中，将5 mL LB培养基转移至带有塑料透气盖的15 mL无菌玻璃试管中。每种需要扩大培养（1 L）的菌种各准备一支小规模培养管。
    3. 选择单个 E. coli 使用移液枪枪头从LB琼脂平板上挑取菌落。将每个菌落接种至LB培养基试管中。 E. coli 通过将含有选定菌落的移液枪头逐个排入各试管中，实现菌落分离。
    4. 用透气塑料盖盖住每支接种培养试管。将盖好盖的 E. coli 在37 °C摇床培养箱中培养12–24小时的小规模培养物。
  3. 共表达培养物的制备与诱导
    1. 第二天，将100 mL已配制的10倍磷酸盐缓冲液加入900 mL已配制的TB培养基中，使磷酸盐缓冲液的终浓度为1倍。根据需要加入相应浓度的抗生素 表1.
    2. 在37 °C、140 rpm条件下振荡至温热（约30分钟）。
    3. 用5 mL接种培养物分别接种每瓶1 L培养基。接种时使用的移液器吸头应保留在接种培养物的试管中，以便在后续步骤中用有机溶剂提取时，避免引入塑料污染物。
    4. 在200 rpm条件下振荡培养，直至600 nm处的光密度（OD600) 达到 0.6，约需 3 小时。测量 OD600 使用分光光度计时，以无菌TB与磷酸盐缓冲液的混合液作为空白对照。
    5. 在所需的 OD 值时600，将培养箱设置为16 °C。
    6. 共表达P450时，需新鲜配制核黄素和氨基乙酰丙酸，二者对充足的P450辅因子生成至关重要。每次实验均需配制4 g/L核黄素和150 g/L氨基乙酰丙酸。溶液配制后需用铝箔包裹避光保存，直至使用，因核黄素对光敏感。
    7. 当培养箱温度达到16 °C（约30分钟）后，向每份培养物中加入1 mL 1 M IPTG、1 mL 4 g/L 核黄素和1 mL 150 g/L 5-氨基乙酰丙酸。为促进二萜类化合物的生产，需向每份培养物中添加25 mL 1 M 丙酮酸钠，以确保前体物质的充分生成。
      注意：本实验中使用的所有构建体均位于相同的IPTG诱导型启动子下。可根据需要使用不同的启动子。
    8. 在16 °C、140 rpm条件下培养72 h。若生产二萜类化合物，则在诱导后的每一天添加25 mL丙酮酸钠。培养物立即用于分液漏斗法提取代谢物；切勿收获或储存培养物。

3. 代谢物的分离与纯化

  1. 代谢物的分液漏斗萃取
    注意：使用有机溶剂时，必须仅使用玻璃器皿和玻璃移液管，以防止塑化剂污染。
    1. 在通风橱内，将分液漏斗固定在铁架台上，并在分液漏斗下方放置一个废液烧杯。
    2. 向分液漏斗中加入 500 mL 的 50/50（v/v）乙酸乙酯/己烷混合溶剂。
      注意：应根据目标代谢物的溶解度和极性调整溶剂混合比例。应避免使用与水互溶的溶剂，以确保适当的相分离。
    3. 将 500 mL 的 E. coli 培养液加入分液漏斗中，并盖上玻璃塞。
    4. 摇动漏斗以使培养液与萃取溶剂充分混合，约 5–10 次。在倒置漏斗并将其开口朝向通风橱内时，频繁打开活塞排气以释放压力。重复摇动和排气操作 2 次。
    5. 将漏斗正立放置于铁架台上，静置约 1 分钟，直至上层溶剂相与下层水相（培养液）完全分离。
      注意：若在两相界面处观察到大量气泡，可加入少量（5–10 mL）乙醇以改善相分离效果。
    6. 取下玻璃塞，将 E. coli 水相层排入废液烧杯中，保留在漏斗中的溶剂层。
    7. 使用剩余的 500 mL E. coli 培养液和第一次萃取所用的同一份 500 mL 溶剂，重复上述操作。
    8. 将含有萃取代谢物的溶剂层排入洁净的烧瓶中，避免混入 E. coli 培养液造成污染。
  2. 旋转蒸发浓缩
    1. 准备旋转蒸发仪（rotovap）设备：注满水浴并设定温度为 25 °C。对于热敏感化合物，应使用更低的温度设置或在水浴中加入冰块。向冷凝腔内填充干冰，并将旋转速度设定为 60–80 rpm。
    2. 将约 700 mL 萃取得到的代谢物溶液加入 1 L 蒸发瓶中，连接至旋转蒸发仪，并将其浸入水浴中。开启水浴加热器，并设定温度为 25 °C。
    3. 启动蒸发瓶旋转，打开真空系统，并逐步增加抽力，以避免代谢物溶液剧烈沸腾进入废液瓶。蒸发的溶剂应开始冷凝并滴入冷凝液收集（废液）瓶中。
    4. 当蒸发瓶中仅剩几毫升代谢物溶液时，停止旋转并关闭真空系统。升起蒸发瓶，通过关闭真空管路进行泄压。保留蒸发瓶中剩余的浓缩代谢物溶液。将废液瓶中的废液妥善处理。
    5. 继续向蒸发瓶中加入最多 700 mL 的额外萃取代谢物溶液，进行后续旋转蒸发操作。重复该过程，直至所有萃取代谢物溶液均被浓缩。
    6. 使用玻璃移液管将浓缩后的代谢物从蒸发瓶转移至新的试管中。用 5 mL 的 50/50（v/v）乙酸乙酯/己烷或其他所需溶剂混合液冲洗蒸发瓶两次，并将洗涤液一并转移至试管中。
    7. 将浓缩后的代谢物储存于 -20 °C 或 -80 °C（根据产物稳定性决定），以备后续使用。
  3. 硅胶柱纯化
    1. 用己烷和乙酸乙酯分别冲洗 1 L 烧杯、玻璃漏斗、50 mL 试管以及容量为 3.2 L 的层析柱（配备玻璃烧结板）各一次，以完成玻璃器皿的预处理。标记将用于收集馏分的 50 mL 试管。
    2. 向具有 2 L 储液能力并配有烧结板的 3.2 L 层析柱中加入 2 L 硅胶（230–400 目，60 级），然后在柱顶加入砂层，形成约 5 cm 厚的砂层。
    3. 用 2 L 己烷彻底冲洗层析柱，以准备进行层析。在整个操作过程中，砂层上方应始终保持一层薄薄的溶剂（约 0.5 cm），以防止柱体干燥或产生气泡。可通过连接空气软管的玻璃进样适配器，轻微增加流速，而不仅依赖重力流动。
    4. 将浓缩的代谢物提取物（见第 3.2 节）上样至层析柱中。用己烷冲洗样品原容器 3 次，并将冲洗液全部加入柱中，以确保样品完全转移。
    5. 采用以下梯度，每次加载 100 mL 溶剂，并在标记的试管中收集 50 mL 馏分：100% 己烷 ×3，10%（v/v）乙酸乙酯/己烷 ×3，12.5%（v/v）乙酸乙酯/己烷 ×3，15%（v/v）乙酸乙酯/己烷 ×3，20%（v/v）乙酸乙酯/己烷 ×3，40%（v/v）乙酸乙酯/己烷 ×3，60%（v/v）乙酸乙酯/己烷 ×3，以及 100% 乙酸乙酯 ×4。
      注意：应根据化合物的分子大小、极性及所需的分离效果调整梯度。
    6. 使用玻璃移液管，从每个馏分中取 1 mL 转移至标记好的 GC 小瓶中。通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析各样品，以确定哪些馏分含有目标代谢物及其纯度水平。
      注意：适用于本方法所产代谢物的 GC-MS 分析方法已在 Mafu 等人 201839 中描述。简而言之，所有分析均在配备 XL MS 检测器的气相色谱仪上进行，使用 HP-5MS 柱（见材料表），进样体积为 1 µL，程序升温从 50 °C 升至 300 °C，升温速率为 20 °C min-1。
    7. 确定含有目标化合物的馏分后，合并所有含相同化合物的馏分。将不含任何目标化合物的馏分妥善弃置于废液容器中。如有需要，可重复旋转蒸发步骤以进一步浓缩纯化后的代谢物。
    8. 若需进一步纯化，可采用（半）制备型高效液相色谱（HPLC）以提高产物纯度。HPLC 方案应根据具体仪器参数和目标化合物特性进行调整。
      1. 将干燥的硅胶柱层析样品重悬于 1 mL 己烷（适用于二萜烃类）或乙腈（适用于含氧二萜类）中，并通过滤膜注射器过滤，以防止微小颗粒污染。
      2. 对于非极性二萜类化合物，使用 CN 柱（见材料表），推荐流速为 1 mL/min，采用己烷:乙酸乙酯梯度洗脱，每 1 分钟收集一次馏分。
      3. 对于极性二萜类化合物，使用 C18 柱（见材料表），推荐流速为 3 mL/min，采用乙腈:水梯度洗脱，每 1 分钟收集一次馏分。
      4. 在氮气流下干燥所有 HPLC 纯化的馏分，然后在进行 GC-MS 分析前重悬于 1 mL 己烷中，以评估产物丰度和纯度。

4. 利用N. benthamiana生产二萜类代谢产物

注意：本文所述在N. benthamiana中生产二萜类代谢物的实验方案已根据先前报道的研究进行过调整35,36,40,41。以下方案专用于N. benthamiana叶片的注射式浸润。其他浸润方法，如真空浸润，同样适用。适用于本实验方案的双元T-DNA载体系统包括pCAMBIA130035Su（pLIFE33）或pEAQ-HT40,41,42，这些载体可在E. coli和A. tumefaciens中扩增，并能在植物宿主中实现基因表达。

  1. 种植 Nicotiana benthamiana
    1. 用盆栽土填满一个750 mL的花盆，并浇水。加入约20粒烟草种子，用手指轻轻敲击，使种子落入土壤中。不要用土壤覆盖种子。
      注意：种子可通过自花授粉进行繁殖获得。本实验所用种子来自加州大学戴维斯分校植物生物学系，可通过美国农业部种质资源库公开获取（https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450）。
    2. 将花盆置于生长室中，在以下条件下培养，每隔一天浇水一次，以确保土壤不会干燥。本方案所有步骤均在26 °C、60%湿度、16:8小时光暗循环的条件下培养植株。
    3. 1 周后，将约 20 个花盆装满盆栽土并浇水。用镊子夹住烟草幼苗的茎部，从原花盆中轻轻取出，将每株幼苗移栽至新的花盆中，小心覆土覆盖根部。注意不要损伤叶片或根系。
    4. 每隔一天向花盆所在的托盘内加水来浇灌植物（也称为“底部浇水法”）。每第四次浇水时，按照包装说明在水中加入通用型肥料。
  2. 冻融转化 Agrobacterium tumefaciens GV3101 感受态细胞
    1. 解冻 农杆菌 根癌农杆菌 将GV3101菌株（或其他优选菌株）的感受态细胞置于冰上（约1小时）。将0.2 mL微量离心管预冷于冰上。将SOC培养基预热至28 °C。
    2. 用移液枪枪头轻轻混匀细胞（切勿反复吹打），并将15 µL细胞分装至预冷的1.5 mL离心管中，每管用于一次转化。
    3. 向每管感受态细胞中加入 1–5 µL（约 400 ng）DNA，通过轻轻刮擦试管在试管架上来回移动混匀。
      注意：由于各个目的载体将分别进行转化，并在侵染前混合，因此无需具有不同的抗生素抗性。
    4. 将微量离心管置于液氮中5分钟。
    5. 从液氮中取出微量离心管，置于室温试管架上。在37 °C培养箱中解冻5分钟。
    6. 向每支微量离心管中加入250 µL预热（28 °C）的SOC培养基，在28–30 °C、225 rpm条件下振荡培养3小时。
    7. 将50 µL转化后的细胞接种到含有必要抗生素的LB琼脂平板上，具体抗生素见下文描述 表1 使用无菌玻璃珠，具体步骤如2.1.8所述。
    8. 将培养皿倒置于28–30 °C培养48 h。观察1内的生长情况st 培养天数可能是污染的迹象。转化 A. tumifaciens 可在2天培养后使用，或用石蜡膜密封后于4 °C保存长达2周。
  3. 农杆菌介导的瞬时酶共表达 Nicotiana benthamiana
    1. 修剪4周大的 Nicotiana benthamiana 在侵染前2天去除下部叶片，保留最上部的4片叶子。给植株浇水，但在侵染前24小时停止浇水，以保持气孔开放，便于侵染。
    2. 加入10 mL含有相应抗生素（针对所选构建体的工作浓度）的LB培养基 农杆菌 菌株（在下文描述） 表1) 加入一个带铝箔盖的50 mL无菌玻璃试管中。
    3. 使用移液枪枪头挑取单个转化后的菌落进行接种 农杆菌 并将枪头排入LB培养基中。每个 农杆菌 转化子应至少含有两个小规模培养物。
    4. 28 °C、220 rpm 条件下过夜培养。
    5. 在600 nm处测定光密度（OD）600) 使用分光光度计测定过夜培养物的OD值。将过夜培养物稀释至指定OD值600 1 的
      注意：最佳 OD600 使用其他方法时，数值可能会有所不同 农杆菌 菌株
    6. 将10 mL稀释后的过夜培养物分装至50 mL锥形管中。
    7. 在室温下以3500 rpm离心15分钟收集细菌。倾去并弃除上清液。
    8. 轻轻摇动试管并在试管架上滚动，用 10 mL 浸润缓冲液重悬菌液。OD600 每个构建体的值应等于1。
    9. 通过将每种转化后的细胞系取等体积混合，制备所需渗透组合。OD600 每次浸润的值应为1。每片叶子估计使用5 mL浸润溶液，每株植物使用2片叶子。
    10. 将离心管水平固定于摇床上，室温下轻轻摇动2小时。
    11. 每株浸润约2片叶片 N. benthamiana 用约5 mL浸润混合液处理每片叶片。使用无针注射器在叶片背面进行浸润，同时用手指在叶片正面施加反向压力，以确保浸润液充分渗透至叶片组织。
    12. 用黑色记号笔或其他标记物标记所有渗透过的叶片。将渗透处理的植株放入培养室中培养5天，并保持充分浇水。
      注意：五天的培养时间已足以积累满足大多数后续分析所需的二萜类化合物含量，同时保持产物生成的时间效率。若需要更高产量，可尝试延长培养时间。
  4. 转化体中代谢物的提取与纯化 Nicotiana benthamiana
    1. 剪下植株上已浸润的叶片进行收集。将约100 mL液氮和一片叶片加入研钵中，使用研钵和研杵或组织研磨仪研磨，直至形成细粉状。
    2. 将组织粉末加入气相色谱-质谱（GC-MS）小瓶至500 µL刻度线处。向小瓶中加入1.5 mL体积比为50/50（v/v）的乙酸乙酯/正己烷或所需溶剂混合液，盖紧瓶盖。
      1. 对于已验证可产生目标产物的表达样本，将研磨后的组织收集至较大的烧瓶或试管中，加入约为组织体积2倍的溶剂，振荡过夜。随后进行4.4.5步骤纯化。
    3. 将所有小瓶放入微量离心管架中，并用胶带牢固固定。在室温下剧烈振荡提取过夜。
    4. 将400 µL提取物和600 µL正己烷转移至新的GC-MS小瓶中。不要分装任何叶片组织。使用3.3.6.1步骤中所述方法通过GC-MS分析样品。
    5. 通过气相色谱-质谱法分析目标代谢物的存在后，将叶片提取物合并，并按照第3.2和3.3节所述步骤进行旋转蒸发、硅胶柱层析和高效液相色谱，以获得纯化合物。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用二萜类化合物生产的示意图工作流程 E. coli
图1 展示了所描述的二萜类化合物生产的流程。此处所述方案改编自先前报道的方法 E. coli 二萜类生物合成平台13,32 用于大体积培养物的培养以及通过硅胶色谱纯化目标二萜类产物。为展示本方案的应用，我们采用了一条 recently identified 玉米 dolabralexin 生物合成途径，该途径包含两个二萜合酶（diTPS）ZmAN2 (Zm00001d029648) 和 ZmKSL4 (Zm00001d032858)、一个多功能 P450 酶（CYP71Z18, Zm00001d014134）以及一个细胞色素 P450 还原酶（ZmCPR2, Zm00001d026483）（图2简而言之， E. coli BL21DE3-C41 感受态细胞预先转化了 pCDFDuet:IRS 和 pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 质粒13,32.pCDFDuet:IRS 质粒包含二萜类前体合成的关键酶，包括1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（dxs），1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶（dxr），以及异戊烯基二磷酸异构酶（idi），并被证明可促进二萜类化合物的形成 E. coli13.pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 质粒包含玉米的 ent-玉米copalyl二磷酸合酶ZmAN2和一种GGPP合酶 Abies grandis随后，将催化 dolabralexin 生物合成中限速步骤的酶以质粒 pET28b:ZmKSL4 和 pETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z18 共转化。有关序列和质粒构建的详细信息参见 Mafu 等，201839.

提取的酶促反应产物的气相色谱-质谱（GC-MS）色谱图如图3A所示，显示生成了三种多拉布雷素类化合物，分别为多拉布二烯（1.2 ± 0.25 mg/L 培养液）、环氧多拉布烯（0.65 ± 0.2 mg/L 培养液）和环氧多拉布醇（11.4 ± 1.1 mg/L 培养液），其定量依据是以二萜类化合物 sclareol 构建的标准曲线进行测定。由于 sclareol 与多拉布雷素在结构和化学性质上相似，因此被用作参比标准品。通常观察到的少量副产物包括氯霉素、吲哚衍生物羟吲哚和5-醛基吲哚，以及前体物质香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）（图3）。吲哚通常是主要的副产物，但因其保留时间短于设定的7分钟溶剂延迟时间，为保护GC-MS仪器的完整性而未在此图中显示。

利用二萜类化合物生产的示意图工作流程 N. benthamiana
图4 展示了刀状素通路表达的总体情况 N. benthamiana对于此处描述的产品，以下载体被分别转化进入 A. tumefaciens 菌株GV3101：pLife33:p19（表达p19基因沉默抑制蛋白），pLife33:ZmCYP71Z18，pLife33:ZmAN2，pLife33:ZmKSL4。玉米刀豆素生物合成途径基因的全长天然序列被克隆至双元T-DNA载体pLife33中41 带有卡那霉素抗性，用于在 E. coli 和 A. tumefaciens 上游萜类化合物途径基因的共表达是可选的，因为前体物质香叶基香叶基焦磷酸在体内可内源性生成 N. benthamiana 然而，已有若干研究成功采用此类方法以提高二萜类化合物的生成 N. benthamiana14,36,41如图所示 图3共表达成功合成了二环松香二烯和15,16-环氧二环松香烯。与酶的共表达不同，在 E. coli未在代谢物提取物中检测到15,16-epoxydolabranol。

叶片提取物中15,16-环氧二环杜松烯（15,16-epoxydolabrene）的存在表明CYP71Z18在N. benthamiana中具有活性。由于先前研究已证明15,16-环氧杜松醇（15,16-epoxydolabranol）在从微生物培养物中提取后（图3）以及从玉米根组织中分离后均保持稳定39，因此推测该羟基化产物可能被内源性糖基转移酶糖基化，并随后被隔离至液泡中，导致其无法被本研究所用的有机溶剂混合物提取36,43,44,45,46。此前已有研究报道，在N. benthamiana中进行代谢通路工程时出现过类似的非预期产物修饰现象47。如在E. coli中共表达所示，N. benthamiana中的瞬时表达也会导致多种副产物的提取，包括基于与标准质谱数据库比对鉴定出的不同链长的直链烷烃。从叶片材料中提取的化合物滴度平均为每克干重叶片组织含2.4 ± 0.5 mg杜松二烯（dolabradiene）和0.9 ± 0.3 mg 15,16-环氧二环杜松烯（15,16-epoxydolabrene）。由于实验设计不同，这些滴度无法直接与E. coli共表达系统的结果进行比较。

二萜类化合物纯化
采用硅胶柱层析和后续的半制备型高效液相色谱（HPLC）实现二萜类化合物的纯化。来自12 L集中的大肠杆菌（E. coli）培养物的代谢物提取物通过硅胶柱层析进行纯化，以分离三种目标 dolabralexin 化合物（图3A）。硅胶层析非常适合获得高纯度的目标化合物，因为它能够简单地分离二萜烯烃及其含氧衍生物，并可有效去除主要杂质——被保留在硅胶基质上的氧吲哚（oxindole）（图3A）。

E. coli transformation process diagram with silica chromatography and HPLC purification setup.
图1：二萜类化合物在中的生产流程 E. coli 从液体细菌培养物中提取和纯化代谢物。 虚线框表示需要额外纯化的可选步骤。A提取后的代表性图像 E. coli 使用分液漏斗进行培养。B使用硅胶色谱法纯化代谢物提取物的代表性图像。   请点击此处以查看此图的放大版本。

显示利用酶将GGPP转化为15,16-环氧杜拉布拉烷的化学合成途径。
图2：本研究中使用的杜拉布拉素生物合成途径及基因构建体。 请点击此处查看该图的放大版本。

色谱结果；来自大肠杆菌和本氏烟草的化合物纯化；硅胶分析。
图3：GC-MS结果。 图中显示了通过酶共表达实验在 (A) E. coli 和 (B) N. benthamiana 中获得的纯化二萜类产物的代表性GC-MS色谱图。产物鉴定基于与真实标准品以及美国国家标准与技术研究院（NIST）质谱库参考质谱图的比对。1，氧代吲哚；2，吲哚-5-醛；3，吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，六氢-3-(2-甲基丙基)-；4，6-O-乙酰基-1-[[4-溴苯基]硫代]-α-d-葡萄糖苷 S,S-二氧化物；5，杜巴烯；6，15,16-环氧杜巴烯；7，吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，六氢-3-(苯甲基)-；8，15,16-环氧杜巴醇；9 和 12，未知；10，氯霉素；11，3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇；13–16，烷烃。请点击此处查看该图的放大版本。

N. benthamiana metabolite production; process flowchart and plant images; syringe infiltration method.
图4：二萜类化合物在 N. benthamiana (A) 二萜类化合物生产的流程 N. benthamiana 从叶片材料中提取和纯化代谢物. (B代表性图像 N. benthamiana 用于侵染实验的植株，修剪前状态。C代表性图像 N. benthamiana 修剪后的植物。D注射器渗透叶片的图像。颜色较深的区域为已渗透区域。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对二萜类天然产物的更广泛研究与应用需要简单且低成本的方案来合成并纯化足量的目标化合物。近年来，来自多种物种的二萜类代谢酶数量迅速增加，为利用微生物和植物宿主系统进行二萜类化合物的酶法生产提供了丰富的酶资源。此外，许多二萜类生物合成途径具有模块化结构，使得可将同种或不同物种的酶组合使用于“即插即用” & 播放’组合工程方法以生成一系列天然及类天然二萜类天然产物2,14,26,35.

E. coli 因其稳健性、易于放大培养、化学复杂性较低从而减少副产物污染，以及拥有大量可用于DNA组装和表达优化的工具，成为天然产物生物合成的首选微生物宿主。根据我们的经验，本文所述平台适用于生产高达数百毫克的二萜烯烃和二萜醇产物，足以满足包括本文所提出应用在内的多种下游应用需求。尽管尚未达到工业生产规模，但本文描述的生产平台可为进一步优化代谢通路、宿主菌株及发酵工艺提供基础，此前已在紫杉二烯和香紫苏醇等相关的二萜类化合物中成功实现此类优化33,34。过表达限速的甲羟戊酸（MVA）或甲基赤藓醇磷酸（MEP）通路基因已被成功用于克服二萜类生物合成中产量受限的问题，例如前体供应不足或前体流入竞争性通路等问题13,32,33,39。尽管已有多个研究证实其有效性，但萜类代谢相关的真核P450酶及其他膜结合酶在E. coli中表达水平低、催化活性差，仍是可能的限制因素33,39,48,49,50,51,52。使用密码子优化序列以及蛋白质修饰（如去除内质网信号肽或引入质体信号肽）已被证明有助于提高P450酶的可溶性表达水平14,38,49,50,53。本研究中作为示例通路使用的玉米CYP71Z1839的微生物共表达也采用了上述修饰策略。所述实验方案基于使用每个质粒构建体携带一个或两个基因，并均由同一诱导型启动子驱动表达。当需要更大规模的基因组合时，建议采用现有的多种多基因表达盒或基因堆叠系统，以减轻因使用多个质粒和抗生素所带来的转化效率降低和菌体生长抑制问题13。

随着遗传学和基因组学资源的日益普及，植物宿主系统也逐渐成为天然产物生产的适宜平台。其优势包括植物可通过光合作用自身合成所需的天然前体，从而无需额外添加前体分子即可实现产物合成54,55。N. benthamiana 已被广泛用于萜类及其他天然产物通路的体内功能鉴定和组合表达14,35,36,40。以 N. benthamiana 作为宿主系统的优势显著，包括内源性合成二萜类前体、可直接使用天然基因序列、真核P450酶的表达更为简便、组合基因转化操作简单（瞬时共转化时无需使用不同的抗生素筛选），以及可从叶片材料中简便提取目标产物。在需要时，可通过共表达MEP通路中的关键基因以增加前体供应，从而提高二萜类化合物的产量36,41。然而，与液态微生物培养相比，N. benthamiana 中可放大的二萜类生产仍面临更多复杂限制，例如需要生成足够的植物生物量、从化学成分复杂的植物组织中提纯产物的过程更为耗时费力，以及内源酶可能对目标产物造成非预期的代谢修饰，如氧化、糖基化或去磷酸化等36,43,44,45,46,47。尽管如此，通过增加用于农杆菌浸润的植株数量，该方法仍可实现毫克级产物的规模化生产56。

本文所述的产物提取与纯化方案适用于大肠杆菌（E. coli）、本氏烟草（N. benthamiana）以及酿酒酵母（S. cerevisiae）和其他植物或微生物宿主系统，提供了一种成本效益高、易于在生物学和化学实验室中建立的方法，且无需昂贵的纯化设备。使用分液漏斗进行代谢物提取，非常适合在色谱纯化前实现高效的提取和相分离。漏斗尺寸可根据需要灵活调整，以适应更大的培养体积，减少从大规模培养物中提取所需的时间。我们发现，采用正己烷/乙酸乙酯梯度洗脱体系非常适合提取不同极性的二萜类化合物，本文以包含烃类和含氧化合物的多拉布拉莱辛（dolabralexins）族化合物为例进行了验证（图3）。根据目标产物的性质，其他溶剂组合可能更具优势。然而，所用溶剂必须不与水混溶，以确保分液漏斗法能够成功实现提取和相分离。此外，当利用该方法制备挥发性有机化合物（VOCs）时，例如低分子量的单萜和倍半萜类化合物及其他VOCs，必须考虑产物因蒸发而损失的问题。根据我们的经验，采用较大规模（约2 L）的硅胶柱进行不同氧化程度二萜类化合物的色谱分离具有明显优势，因其可实现更佳的产物分离效果，并在使用较小柱体积时减少重复纯化步骤的需要。柱体积和填料可根据所需培养体积及天然产物类型按需调整。本方案所获得的目标产物纯度适用于多种后续应用，例如生物活性检测或酶活性分析。然而，若需要更高纯度，例如通过核磁共振（NMR）进行结构分析时，可通过（半）制备型高效液相色谱（HPLC）进一步纯化，以高效提升产物纯度。

本方案已针对二萜类天然产物的制备进行了优化，但通过构建所需的酶模块以进行组合表达，也可轻松适用于单萜、倍半萜及三萜类化合物，以及其他天然产物类别14,57。然而，对于挥发性较高的化合物（如单萜和倍半萜），或极性更高并具有功能修饰（如三萜类、苯丙素类及其他天然产物类别的糖基化修饰）的化合物，在提取和纯化步骤上必须相应调整。

尽管已有用于天然产物生产的工业化规模平台，但本文所述方案提供了一种低成本、可定制的工具，可在大多数实验室中快速建立。如本文及其他研究39中玉米 Dolabralexins 的生产所示，采用该方法所获得的产物数量和纯度通常足以支持多种下游分析与应用，包括但不限于各种生物活性研究、生物体间相互作用分析，以及作为酶底物或半合成方法的起始原料使用。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们衷心感谢美国爱荷华州立大学的 Reuben Peters 博士提供了 pIRS 和 pGGxZmAN2 载体。本研究工作得到了美国国家科学基金会植物-生物互作项目（资助号：1758976，授予 P.Z.）、美国能源部早期职业研究项目（资助号：DE-SC0019178，授予 P.Z.）、美国能源部联合基因组研究所社区科学项目（资助号：CSP2568，授予 P.Z.）、美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（授予 K.M.M.）以及加州大学戴维斯分校院长导师奖学金（授予 K.M.M.）的资助，特此致谢。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1020 培养盘Greenhouse MegastoreCN-FLHD
2-(N-吗啉代)乙磺酸SigmaM8250-500gMES
4" Tech Square 培养盆McConkey Wholesale Grower's SupplyJMCTS4
5977 Extractor XL MSAgilent-
7890B 气相色谱仪Agilent-
乙腈Sigma271004
琼脂FisherBP1423-2
细菌酵母提取物FisherBP9727-2
烧杯CTechGlassBK-2001-015B
盖子，9 mm 蓝色螺旋盖，聚四氟乙烯（PFTE）Agilent5185-5820气相色谱小瓶盖
羧苄青霉素Genesee25-532Carb
氯霉素Fisher50247423Chlor
层析柱CTechGlassCL-0015-022
透明保湿罩Greenhouse MegastoreCN-DOME
ColiRollers 涂布珠Sigma71013玻璃珠
CoorsTek 瓷制研钵Fisher12-961A研钵
CoorsTek 瓷制研杵Fisher12-961-5A研杵
δ-氨基乙酰丙酸盐酸盐Sigma50981039氨基乙酰丙酸
乙醇FisherA962-4EtOH
乙酸乙酯FisherE1454
Falcon 50 mL 圆锥形离心管Fisher14-432-22Falcon 管
Fisherbrand 一次性比色皿Fisher14-955-127比色皿
Fisherbrand 带透明盖的培养皿FisherFB0875713培养皿
Fisherbrand 聚丙烯微量离心管储存架Fisher05-541微量离心管架
葡萄糖SigmaG7021
甘油FisherG33-500
己烷FisherH292-4 (CS)
HP-5MSAgilent19091S-433气相色谱柱
进样口适配器CTechGlassAD-0006-003玻璃进样口适配器
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷FisherBP1755-100IPTG
卡那霉素FisherBP9065Kan
KIM-KAP 盖子，一次性，聚丙烯，Kimble ChaseVWR60825-798透气试管盖
氯化镁Acros223210010MgCl2
硫酸镁SigmaM7506-500gMgSO4
Miracle-Gro 水溶性通用植物营养液Miracle-Gro2756810
Mixer Mill MM 200Retsch20.746.0001组织研磨仪
Nalgene Fernbach 培养瓶SigmaZ3602362.8 L 培养瓶
New Brunswick I26EppendorfM1324-0000摇床培养箱
Nicotiana benthamiana 种子USDA 种质库编号 TW16N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) 化学感受态细胞Lucigen60442C41-DE3 细胞
Parafilm M 封口膜FisherS37440Parafilm
氯化钾SigmaP-9541KCl
无水磷酸氢二钾FisherP288-3磷酸氢二钾
磷酸二氢钾磷酸二氢钾
Pyrex 一次性无边培养管SigmaCLS9944516试管
丙酮酸钠盐Fisher501368477丙酮酸钠
铁架台CTechGlassST00铁圈架
核黄素Amresco0744-250g
利福平SigmaR7382Rif
旋转蒸发仪
砂，粒径 50–70 目Sigma274739-1KG
硅胶FisherAC241660010硅胶
氯化钠Fisher5271-3NaCl
氢氧化钠FisherSS266-1NaOH
壮观霉素Fisher501368607Spec
Squibb 分液漏斗CTechGlassFN-1060-006分液漏斗
Sunshine Mix #1Sungro Horticulture盆栽土
Thermo Scientific Snap Cap 低吸附微量离心管Fisher21-402-902微量离心管
三角漏斗CTechGlassFN-0035漏斗
胰蛋白胨FisherBP14212
小瓶，螺旋盖，2 mL，棕色，可书写Agilent5182-0716气相色谱小瓶
可见光分光光度计，V-1200VWR634-6000P分光光度计
ZORBAX Eclipse XDB-C18Agilent990967-202高效液相色谱柱
ZORBAX Eclipse XDB-CNAgilent990967-905高效液相色谱柱

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