本方案旨在评估从胚胎到成虫各个发育阶段的黑腹果蝇（Drosophila）存活率。该方法可用于测定并比较不同基因型或生长条件下的存活能力。
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摘要
摘要
在 黑腹果蝇，活力检测用于确定特定遗传背景的适合度。等位基因变异可能导致在不同发育阶段出现部分或完全的活力丧失。本实验室已开发出一种评估活力的方法 黑腹果蝇 从胚胎到完全成熟的成虫阶段。该方法依赖于量化发育不同阶段的子代数量，起始于孵化后的胚胎。在完成胚胎数量统计后，继续计数其他发育阶段，包括L1/L2幼虫、蛹以及成熟成虫。在检查完所有发育阶段后，采用统计学分析方法（如卡方检验）来判断起始的子代数量（孵化的胚胎）与后续各阶段最终观察到的成虫数量之间是否存在显著差异，从而拒绝或接受无效假设（即孵化的胚胎数量等于在整个发育过程中记录的幼虫、蛹和成虫数量）。该检测方法的主要优势在于其操作简便且结果准确，无需通过冲洗胚胎将其转移至培养管中的食物上，从而避免了因技术操作导致的样本损失。尽管本方案未直接检测L2/L3幼虫阶段，但可额外增加步骤以涵盖这些阶段。通过比较孵化胚胎、L1幼虫、蛹和成虫的数量，有助于判断在L2/L3阶段是否出现存活力下降的情况，为后续研究提供依据（使用染色食物有助于幼虫的视觉识别）。总体而言，该方法可帮助 黑腹果蝇 研究人员和教育工作者可借此确定果蝇生命周期中活力受损的时间点。通过该检测方法对品系进行常规评估，可防止积累可能影响原始突变体表型的次级突变，特别是当原始突变影响个体适合度时。因此，本实验室为每个品系均保留了多个备份 Dm ime4 等位基因，并利用该方法结合其他分子分析手段常规检测每个品系的纯度。
引言
寿命受到遗传和非遗传因素的影响。在实验室室温下的标准培养条件下，我们实验室观察到不同Dm ime4等位基因在相同条件下生长时，其适应性和存活力存在显著差异（图1和补充图）。在群体遗传学研究中，存活力分析常用于探究特定等位基因组合或培养条件的影响1,2,3,4。然而，在科学文献中，针对非互补突变组内存活力的详细分析较为罕见。若研究人员在维持平衡品系的培养瓶中发现少量该等位基因的纯合个体，通常会将该等位基因标记为"非必需" 5,6。然而，尚无研究报道通过精确的卡方检验来评估这些纯合子是否符合预期的孟德尔分离比5,6。果蝇品系最宽松的培养温度为室温（22–23 °C），在营养充足的情况下，野生型果蝇的生活周期大约需要12天完成7,8。由于野生型果蝇各发育阶段的持续时间已知7,8，本报告所述方法可用于检测所研究的果蝇品系在各个发育阶段的适应性是否与相应遗传背景的对照组相当。与仅关注发育某一特定方面的研究相比9，本实验方案提供了一种实用的方法，用于评估不同发育阶段的存活力。
在我们的实验室中，该方案用于评估缺乏果蝇减数分裂诱导因子4（Drosophila Inducer of Meiosis 4,Dm ime4). Dm ime4 是一个必需基因10 编码一种在RNA代谢中具有关键作用的RNA甲基转移酶 果蝇 以及其他多细胞生物5,6,10,11,12,13,14. 为了快速评估新等位基因 Dm ime4 通过 CRISPR/Cas9 生成（补充图），进行了终点存活率检测，仅计数在平衡品系小瓶中产生的成年子代图1）。所用的部分品系在先前的研究中已有描述 Dm ime4 报告5,6纯合突变体的出现频率低于孟德尔遗传预期水平，经卡方分析确定（图1 和 补充材料）。为了评估这些低于预期的数目是由于产下的胚胎数量较少、孵化的胚胎较少，还是L1/L2或蛹期的存活力丧失所致，我们将追踪范围扩大至包括每个发育阶段的计数（图2, 图3, 图4, 图5, 图6, 图7, 图8，以及 图9).
本文以野生型（OreR）果蝇为例描述该方法。为通过实验验证该方法在其他遗传背景或果蝇物种中的适用性，我们建议以OreR作为参照，并根据实验所用生物体调整时间点。 本方案还进一步通过将野生型处女雌蝇与杂合 Dm ime4 突变品系雄蝇杂交所产生的后代存活率进行了评估5,6（图4）。
方案
1. 培养基制备
- 根据制造商说明制备葡萄琼脂（见材料表），倒入35 mm培养皿中至半满（图5）。 静置约1小时使其凝固。葡萄琼脂凝固后，立即使用或于4 °C保存。
- 用小型塑料刀在琼脂平板表面轻轻划出划痕（果蝇倾向于在不平整的表面产卵），保留平板中央区域无划痕（图5）。在平板中央放置少量新鲜制备的酵母糊（见材料表）（图5）。
2. 胚胎收集小型笼具装置设置
- 在含有葡萄糖琼脂平板并添加酵母糊的胚胎收集笼内，使用两只处女雌蝇和一只年轻雄蝇进行杂交设置（图5）。
- 24小时后，在不打开笼子的情况下，通过观察琼脂平板底部检查是否有产下的胚胎。 若发现已产胚胎，将琼脂平板从培养室中取出，并置于湿润培养盒中以进行显微观察（图6）。 若需连续多天记录产卵情况（例如进行繁殖力或寿命测定），则保留亲本果蝇，并更换为按前述方法制备的新鲜琼脂平板。也可进行短于24小时的早期收集，但需注意：使用处女雌蝇时，其在羽化后48小时内不会开始产卵。
- 用培养皿盖盖住含有胚胎的琼脂平板，以防止脱水，并立即放入湿润培养盒中（图7）。在解剖显微镜下观察并记录孵化的胚胎及L1幼虫。 观察后盖好盖子，于室温下的湿润培养盒中继续培养，直至所有胚胎均孵化并发育为L1幼虫（图6）。
3. 胚胎和幼虫计数
- 48 小时后，在解剖显微镜下观察培养皿，并在将琼脂块转移至食物瓶之前最后一次记录数量。 受精卵/有活力的胚胎此时应已发育至 L1 阶段。 转移前可延长孵育时间，但需注意培养皿可能开始失水，琼脂可能出现裂纹，从而影响向食物瓶转移的无菌操作（参见图 7）。 为确保在计数过程中琼脂保持湿润且胚胎活力不受影响，应避免将可调节角度的灯管直接照射琼脂表面（图 7E 显示了合适的距离）。
- 计数完成后，盖上培养皿并将其置于湿室中，待转移时取出。记录观察结果。
4. 将葡萄琼脂圆片转移至食物小瓶以监测发育期间的存活率
- 记录数量（孵化的胚胎/L1/L2）后，使用刮铲小心地将葡萄琼脂圆片转移至一个足够大的小瓶中，该小瓶可容纳一个直径35 mm的圆片，并含有按照制造商说明制备的果蝇培养基（参见试剂列表）。将葡萄琼脂圆片的L1面朝下放置在培养基上（图7）。 将带有幼虫的琼脂圆片转移至食物小瓶后，仔细检查空的培养皿中是否遗留有幼虫（图7E）。
- 制定每日检查食物小瓶的时间表，每天大致在同一时间进行观察，以确保观察到L2/L3幼虫已迁移至小瓶中的食物上（图8）。
- 记录蛹和成年果蝇的数量（图9）。持续计数直至不再出现新的成虫，并避免计入下一代个体（首次观察到成虫后不超过9天）。
- 观察并记录结果。根据所使用的突变品系，相应调整胚胎收集、计数和记录的时间范围。
- 进行卡方分析。零假设为100%存活率，即成虫数量应等于最初记录并转移至食物小瓶中的孵化胚胎数与L1幼虫数之和。
结果
该方法结合卡方分析，可对从胚胎到成虫羽化各阶段的存活率进行准确且可重复的评估。
在初步研究中，计数胚胎和幼虫后，将葡萄琼脂直立放置于试剂瓶内壁一侧。然而，当琼脂置于瓶壁侧面时，许多胚胎和幼虫未能发育为成虫。这可能是由于葡萄琼脂圆片脱水所致（图3）。这种放置方式引入了一个环境变量（琼脂圆片的湿度），可能干扰实验结果。从胚胎到成虫阶段，约有39%的后代丢失，仅有61%的个体成功羽化为成虫。最大的损失发生在L1幼虫阶段（在葡萄琼脂平板表面计数）与蛹阶段（在培养瓶壁上计数）之间。然而，当将葡萄琼脂倒置放入试剂瓶内，并直接与培养基表面接触时，后代的损失率低于6%（图2）。由于整个葡萄琼脂圆片始终与瓶内即用型培养基的水分接触，琼脂保持了充分的湿润状态（图7，图8）。这些结果表明，琼脂在试剂瓶内的放置位置对于获得可靠数据、最小化环境变量的干扰具有重要意义。为进一步验证该方法的有效性，我们还收集了补充数据，通过比较初始方法验证中使用的野生型后代，以及将野生型 virgin 雌蝇与平衡的 Dm ime4 突变品系雄蝇（补充图2，ime4Δnull/TM3sb）杂交所产生的后代进行分析。结果显示，约91%的后代发育至成虫阶段，而野生型对照组为94%（图4），两者之间差异无统计学意义。
还使用了纯合的 Dm ime4 突变雄性个体5 以进一步验证该方法。然而，纯合突变体过于衰弱，无法繁殖，并在产下胚胎前即已死亡。因此，该实验的一个局限性在于，雄性个体必须具有足够的健康程度以完成繁殖，才能产生可用于追踪的起始胚胎群体。
图 1：Dm ime4 突变品系的孵化率低于孟德尔遗传预期水平。 显示了催化结构域或 Ado-Met 结合结构域部分发生突变的品系（详见补充图 1）。部分品系中任一结构域的某些区域被丙氨酸（Ala）取代（丙氨酸扫描诱变），而其他品系则缺失了一个或两个结构域。图中以百分比形式表示观察到的纯合子个体数量与预期数量的比值（与杂合子同胞对照组相比，分类方案及卡方分析见补充图 3）。通过卡方分析判断观察值与期望值之间的差异是否具有统计学意义，而非仅由随机因素导致（p 值 < 0.01）。误差线代表均值的标准误（每种杂交实验至少重复三次）。所有数据均记录于补充材料的电子表格中。请点击此处查看该图的高清版本。
图2：试管内琼脂的位置可能引入非预期的环境变量。 将葡萄琼脂圆盘以胚胎面朝下或琼脂侧置于食物试管中后，统计不同发育阶段个体数量的柱状图。当将琼脂圆盘以胚胎面朝下放置于试管中时，初始胚胎中有94%（标准差 ± 0.02）可存活至成虫阶段；而当将琼脂置于食物试管侧壁时，仅有61%（标准差 ± 0.07）的初始计数胚胎能够发育至成虫。所有数据的电子表格见于补充材料。各阶段的预期数量设定为转移至食物试管前在葡萄琼脂圆盘上计数的初始胚胎/L1数量（零假设：100%孵化的胚胎可完成发育）。观察数量为对应发育阶段实际计数的个体数。因此，每个阶段的数据均与葡萄琼脂板上最初计数的孵化胚胎数进行比较。采用卡方检验分析观察值与预期值之间的差异是否具有统计学意义（p值阈值设为0.05），以排除随机因素所致。对于琼脂置于食物试管侧壁的组别，差异具有统计学意义，而胚胎面朝下置于圆盘中的组别则无显著差异。误差线表示标准误（每种杂交组合至少进行三次重复实验）。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：示意图显示了将携带胚胎/L1期幼虫的葡萄琼脂圆片放入食物瓶内的两种方式。 琼脂圆片在食物瓶中的位置不同，导致胚胎总数与成年子代数量之间存在显著差异。这种差异源于琼脂圆片在瓶内放置位置所造成的环境变量（湿度）不同：当琼脂圆片贴于瓶壁时，实际观察到的幼虫和蛹的数量与预期数量之间存在统计学上的显著差异；而当琼脂圆片与食物直接接触时，观察值与预期值之间则无显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：柱状图显示野生型雄性与来自平衡的 Dm ime4 突变品系雄性在不同发育阶段的个体数量比较。 将平衡品系雄性与野生型处女雌性杂交，操作如2.1节所述。将培养基倒置于含食物的试管中，使胚胎面朝下。在葡萄琼脂平板中统计的原始胚胎，其发育为成虫的平均比例在野生型 × 野生型交配组中为94%，标准差 ± 0.02；而在 Dm ime4 突变型/+ × 野生型交配组中为91%，标准差 ± 0.01。统计分析方法如图2所述；两组之间的差异均无统计学意义。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：实验装置。（A）胚胎收集小笼和葡萄琼脂微型培养皿。将培养皿置于湿润环境中（标准培养皿内含吸水纸圆片并加水饱和），以防止脱水。每个葡萄琼脂平板中央放置少量酵母糊。（B）取下胚胎收集平板支架的盖子（红色），并将准备好的平板（酵母面朝上）放入支架中。（C）将果蝇转移至胚胎收集笼中，并立即盖上培养皿盖子以将果蝇封闭在内。（D）迅速移开盖子并将胚胎收集笼翻转，使开口端接触葡萄琼脂平板。于24–48 h内培养，并每日观察。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：葡萄糖-琼脂培养皿中胚胎的发育情况。（A）将野生型胚胎接种于葡萄糖-琼脂微型培养皿中，并在解剖显微镜下进行计数。观察时以外的存放过程中，应将培养皿置于湿润环境中，并避免直接光照以防止脱水。（B）将葡萄糖-琼脂培养皿置于湿润环境中培养，记录孵化出的野生型胚胎。本图显示了由A图所示胚胎发育而来的三条野生型L1幼虫。（C）图中展示了图5所示两个培养皿在第1天记录的胚胎数量和第2天记录的L1幼虫数量的示例。零假设下的“预期数量”由转移至食物小瓶时已孵化并发育为L1幼虫的胚胎数量确定（见下表）。对于野生型果蝇，几乎所有胚胎均可孵化并发育为L1幼虫。但其他遗传背景的果蝇可能并非如此，本方法可用于检测其在存活力上的差异。请点击此处查看该图的放大版本。
图 7：转移幼虫。 （A）记录 L1 幼虫数量后，使用洁净（经乙醇擦拭的）刮铲小心地将葡萄-琼脂圆片从培养皿中取出（B、C），并将 L1 面朝下转移至小瓶中的食物表面，如图 D 所示。（E）仔细检查空的培养皿，以确认是否有遗留的幼虫。若发现遗留的幼虫仍存活，应立即小心地将其转移至食物小瓶中（F）。若遗留的幼虫已死亡或无法转移，则需记录该情况，以便在后续计算中校正“预期数量”。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：L2期幼虫进入食物中。注意观察葡萄琼脂圆片与蓝色食物之间的缝隙和沟槽。制定每日观察小瓶的计划，最好在每天的同一时间进行。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：成虫羽化。（A）三龄幼虫从培养基中爬出，化蛹。（B）成虫从第11天开始羽化。应制定每日观察计划，最好在每天同一时间进行，并仔细记录观察结果。当所有蛹均已羽化（统计空蛹壳）后停止计数，避免将下一代果蝇计入；可在第15天终止实验，并统计死亡的蛹（黑色或干枯的蛹）。具有较长生命周期的突变体可能需要更长的观察时间，具体时长需通过实验确定。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图。 请点击此处下载这些文件。
补充材料。 请点击此处下载这些文件。
讨论
总之，该方法可对果蝇（Drosophila）的存活率进行准确且简便的评估。整个实验方案约需14天完成。该操作无需高深的技术技能，但准确的 timing、每日观察的安排以及小心地转移琼脂对于结果的准确性与可重复性至关重要。
除了将葡萄琼脂培养基圆片的胚胎面朝下放置于食物瓶中外，该实验流程中的另一个关键步骤是：在从胚胎收集小笼中取出葡萄琼脂平板后的48小时内，必须将琼脂圆片转移至食物瓶中。若超过48小时再转移琼脂圆片，会导致胚胎和幼虫丢失，原因可能是琼脂圆片脱水所致。为了统计L2/L3期的转变，平板需要培养72小时。如果该阶段至关重要，则应制备更厚的葡萄琼脂平板，并使用保湿 chamber 以防止干燥。杂交实验是在可容纳35 mm培养皿的胚胎收集笼中进行的；然而，该操作也可使用更大的胚胎收集笼完成，例如可容纳60 mm或100 mm培养皿的收集笼。 相应地，食物瓶必须足够大以容纳这些尺寸。
本方案中可增加若干步骤。如上所述，由于所需时间较长以及琼脂可能脱水，通过平板定量L2/L3期幼虫的转变较为困难。此外，幼虫在琼脂表面活动能力显著增强，给准确计数带来挑战。在计数L2/L3期幼虫前，将平板置于冰箱中冷藏30分钟，或在琼脂表面滴加少量温和麻醉剂（如利多卡因溶液），有助于减缓幼虫运动，从而提高计数准确性。 但需注意的是，这些修改可能引入新的变量（如对低温或麻醉剂的敏感性差异），从而干扰存活率的测定结果。 即使不采用上述步骤，研究人员仍可通过使用有色食物来定量游走期L3幼虫或前蛹，因为这些幼虫在准备化蛹时会迁移到食物瓶壁侧面并停留。该方法的一个局限性在于，用于杂交的成虫需在CO2麻醉后仍能存活，以便在胚胎收集笼中完成表型鉴定和杂交设置。Dm ime4纯合突变雄性个体在CO2处理后复苏能力差，通常在苏醒数小时后死亡。 因此，可探索其他成虫固定方法用于分选，例如将培养管先置于冰箱中数分钟，再转移至碎冰中进一步减缓其活动，从而快速高效地完成分选操作。
除了比较等位基因的强弱及其对存活力的影响外，该方法还可用于筛选对特定药物化合物的敏感性或抗性。与其他在细胞培养中筛选化合物毒性的方法15,16,17,18不同，该方法使用完整的生物体，使得对发育效应的评估更易于分析。总之，通过使用本实验方案及其改进方法，可定量测定等位基因强度，以及环境因素和化学化合物对黑腹果蝇（Drosophila）的存活力、繁殖力、生育力、寿命以及发育周期持续时间的影响。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为1R15GM1131-01和PA-12-149，授予CFH。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗霉添加剂 | Carolina | ||
| 烧杯 | Fisher Scientific | S76100J | 烧杯 |
| Benchmark Scientific 数字加热板 | The Lab Depot | H3760H | 加热板 |
| 经Britta过滤的自来水，用于制备葡萄糖琼脂和速溶果蝇食物 | 任意自来水过滤系统 | ||
| CO2 枪或 FlyNap | Carolina | 用于麻醉以分拣和计数成年果蝇 | |
| 解剖显微镜/体视显微镜 | Amscope | SM-1TSZ-V203 | 解剖显微镜 |
| Drosophila 培养管及塞子 | Carolina | 173120 | 用于培养 Drosophila 的食物管 |
| 胚胎收集小笼 | Genesee Scientific | 59-105 | 用于收集胚胎的装置 |
| 锥形瓶 | Sigma-Aldrich | 70980 | 锥形瓶 |
| Formula 4-24 速溶 Drosophila 培养基，蓝色 | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| 葡萄糖琼脂 | Genesee Scientific | 47-102 | 用于制备琼脂平板的培养基 |
| 速溶果蝇食物 | Carolina | 173210 | 用于食物管的蓝色培养基 |
| 大型培养皿或任何透明容器，用作保湿室：放入湿润的纸巾以保持葡萄糖琼脂平板在孵育期间及显微镜观察前后处于湿润状态 | |||
| 金属刮勺（小型） | Carolina | ||
| 微波炉 | 任意品牌 | 用于加热融化葡萄糖琼脂 | |
| 培养皿 | Kord-Valmark | 2901 | 用于盛装葡萄糖琼脂的培养皿 |
| 搅拌子 | The Lab Depot | 58948-981-EA | 磁力搅拌子 |
参考文献
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