本文介绍了一种通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤的逐步操作方法，以及对血液样本、支气管肺泡灌洗液和肺组织进行流式细胞术分析的方法。该方法具有侵入性小、操作简便、可重复性好以及可滴定疾病严重程度等优点。
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本文内容
摘要
摘要
气道给予脂多糖（LPS）是研究小动物模型中肺部炎症和急性肺损伤（ALI）的常用方法。已有多种方法被报道，例如吸入雾化LPS，以及经鼻或经气管滴注。本方案详细描述了通过直接经气管滴注LPS在小鼠中诱导ALI，并对血液样本、支气管肺泡灌洗（BAL）液和肺组织进行流式细胞术（FACS）分析的逐步操作流程。在腹腔注射麻醉后，暴露气管，并通过22 G静脉导管给予LPS。根据所用LPS剂量的不同，数小时至数天内即可诱导出稳定且可重复的炎症反应，表现为白细胞浸润、促炎细胞因子上调以及肺泡-毛细血管屏障的破坏。本方案详细说明了血液样本、BAL液的采集、肺组织的获取，以及用于FACS分析的样品处理步骤。尽管无菌LPS不适合用于感染性疾病中药物干预的研究，但该方法具有侵入性小、操作简便和可重复性好的优点，适用于回答机制性免疫学问题。此外，通过调整LPS剂量、使用不同的LPS制剂或小鼠品系，可调节其临床效应，从而表现出不同程度的ALI严重性或疾病症状的早期与晚期出现。
引言
实验动物模型在基础免疫学研究中不可或缺。在小型动物模型中，常通过给予全菌或微生物组分来诱导局部或全身性炎症1。脂多糖（LPS，或称细菌内毒素）是革兰氏阴性菌（如肠杆菌科、假单胞菌属或军团菌属）的细胞壁组分和表面抗原。该分子具有热稳定性，为大分子结构（分子量为1-4 × 106 kDa），由脂质部分（脂质A）、核心区域（寡糖）和O多糖（或称O抗原）组成。脂质A含有疏水性脂肪酸链，可将分子锚定于细菌膜中，并在细菌降解后介导LPS的免疫活性与毒性。LPS与脂多糖结合蛋白（LBP）结合后，形成的LPS:LBP复合物可与多种细胞表面的CD14/TLR4/MD2受体复合物结合，从而引发强烈的促炎反应，导致NF-κB向细胞核转位，并继而上调细胞因子的表达2。
急性肺损伤（ALI）是指在无心力衰竭的情况下出现的急性低氧性呼吸衰竭，并伴有双侧肺水肿3。通过气道给予LPS是诱导肺部炎症和ALI的常用方法4,5,6,7。尽管该无菌性刺激物不适用于感染性疾病中药物干预的研究，但可用于....
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方案
本动物实验方案已获当地动物护理委员会（德国雷克林豪森，LANUV；方案编号：84-02.04.2015）批准，并严格遵循美国国立卫生研究院关于活体动物使用的指南（NIH 出版物编号 85-23，1996 年修订版）执行。
1. ALI 诱导
- 使用成年个体 约10-12周龄的C57BL/6小鼠 周。将动物饲养在独立通风的笼具中，自由饮水并饲喂标准啮齿类动物饲料。然而，该方法也可用于较年轻的动物及其他品系的小鼠。
- 将脂多糖（LPS，Escherichia coli O111:B4）分装保存，浓度为 5 mg/mL，置于 -20 °C。用于气管内滴注时，将 LPS 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至终浓度为 2,000 µg/mL。
- 称量小鼠体重。按120 mg/kg小鼠体重（BW）剂量腹腔注射氯胺酮（ketamine），同时注射赛拉嗪（xylazine）16 mg/kg BW（注射部位为腹部下三分之一区域，旁正中位置），随后等待麻醉起效。
- 通过施加触觉刺激检查麻醉深度。若麻醉不足，需重复注射氯胺酮（30 mg/kg 体重）和赛拉嗪（4 mg/kg 体重）。
- 将小鼠俯卧位放置于控温平台上，以维持其体温在37 °C。
- 涂抹无菌眼用润滑剂，以防止麻醉状态下角膜干燥。
- 将头部抬起，用门齿钩住位于桌面上方约5 cm处的水平横杆，....
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结果
通过检测脂多糖（LPS）滴注后24小时和72小时的小鼠细胞因子表达、中性粒细胞浸润以及肺泡-毛细血管屏障的破坏情况，验证了本研究所述诱导小鼠急性肺损伤（ALI）的方法。PBS注射动物作为对照组。经气管给予LPS可诱导强烈的肺部促炎反应。肺组织中TNF-α的表达显著上调，与对照组动物相比，其表达水平持续升高，增幅超过50倍[RQ (TNF-α/18s)；24小时：53.7（SD = 11.6）；72小时：55.0（SD = 20.6）；p < 0.05]（图3A）。白细胞向组织和肺泡腔的侵袭是ALI发生发展的标志性特征13。流式细胞术分析显示，中性粒细胞（NG）显著浸润至肺间质，24小时后其绝对细胞数较对照组几乎增加了9倍[65,243（SD = 15,855）vs. 7,358（SD = 4,794），p < 0.05]（图3B）。72小时后NG的绝对计数略有下降，但相对于对照组的升高倍数仍保.......
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讨论
在小型啮齿类动物模型中，本研究所提出的方法具有微创性、操作简便和良好的可重复性等关键特征。在动物模型中使用脂多糖（LPS）而非完整细菌具有多项优势。LPS是一种稳定且纯净的化合物，可冻干保存直至使用。它通过TLR4通路强烈激活先天免疫反应，其生物活性易于定量，便于精确滴定以实现良好可重复性的疾病严重程度调控。此外，已有研究表明，LPS可作为安全的模型用于在健康志愿者中诱导急性支气管炎，从而实现从实验室到临床的转化16。Rittirsch 等人已在小鼠气管内滴注LPS的模型中，证实了特征性的肺泡-毛细血管屏障通透性增加呈剂量和时间依赖性的发展过程6。这使得可通过调节LPS剂量来实现特定的实验效应，从而模拟不同程度的急性肺损伤（ALI）严重性，或疾病症状的早期与晚期出现。然而，若需研究特定的感染学或药理学问题（例如抗生素治疗），则无菌LPS滴注所诱导的ALI并非合适的模型。
此外，与细菌的肺内或静脉递送相比，肺泡-毛细血管屏障的破坏被描述为相对较轻3
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Jan Kleiner和Susanne Schulz提供的技术支持。作者对波恩大学医学院流式细胞术核心设施提供的出色支持表示感谢。作者未从任何外部机构获得资助。 结果部分给出的部分数据及图3中所示内容已在先前的出版物中发表8。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 ml 注射器 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | 300013 | |
| 10 ml 注射器 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | 309110 | |
| 抗 CD115（c-fms）APC | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 17-1152-80 | |
| 抗CD11b（M1/70）-FITC | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 11-0112-81 | |
| 抗 CD45（30-F11）- eF450 | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 48-0451-82 | |
| 抗F4/80（BM-8）-PE Cy7 | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 25-4801-82 | |
| 抗Gr1（RB6-8C5） | 美国新泽西州富兰克林湖，BD 生物科学公司 | 552093 | |
| 抗-Ly6C（HK1.4）PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 45-5932-82 | |
| 抗Ly6G（1A8）APC/Cy7 | Bio Legend，加利福尼亚州圣地亚哥 | 127623 | |
| 盐酸丁丙诺啡 | 英国伯克郡，Indivior UK Limited公司 | ||
| C57BL/6小鼠，雌性，10–12周龄 | 查尔斯河实验室，威尔明顿，马萨诸塞州，美国 | ||
| CaliBRITE APC-微球（6µm) | 美国新泽西州富兰克林湖，BD 生物科学公司 | 340487 | |
| 23 号 1 英寸针头 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | 300800 | |
| 26 号半英寸套管针 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | 303800 | |
| 70 微米细胞滤网 µm | BD 生物科学，美国新泽西州富兰克林湖 | 352350 | |
| I型胶原酶 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | 1148089 | |
| 脱氧核糖核酸酶 II | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | D8764 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS），无菌 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | D8662 | |
| 杜尔贝科’不含氯化钙和氯化镁的无菌磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | D8537 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | E7889 | |
| FACS 管，5 ml | Sarstedt, Nü德国马尔布雷希特 | 551579 | |
| 胎牛血清（FCS） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | F2442 | |
| 镊子 | Fine Science Tools，德国海德堡 | 11049-10 | |
| 异氟烷 | Baxter, Unterschleiß德国海姆 | ||
| 盐酸氯胺酮 | Serumwerk Bernburg，德国贝尔恩堡 | ||
| 大肠杆菌O111:B4脂多糖（LPS） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | L2630 | |
| LIVE/DEAD 可固定死细胞绿色试剂盒 | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | L23101 | |
| 纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体）™），克隆 2.4G2 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | 553141 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640，含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | R8758 | |
| 剪刀 | Fine Science Tools，德国海德堡 | 14060-09 | |
| 叠氮化钠（NaN3） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | S2002 | |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools，德国海德堡 | 15018-10 | |
| 组织镊 | Fine Science Tools，德国海德堡 | 11021-12 | |
| 管子 | Eppendorf，德国汉堡 | 30125150 | |
| 静脉导管，22 号 | B. Braun，美尔松根，德国 | 4268091B | |
| 盐酸赛拉嗪 | 德国贝尔恩堡血清厂，贝尔恩堡，德国 |
参考文献
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R.
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重印与许可
