通过直接内切内脂多糖灌输诱导小鼠急性肺损伤

实验动物模型在基础免疫研究中不可或缺。管理整个细菌或微生物成分已经常用于小动物模型,以诱发局部或全身炎症1。脂多糖(LPS,或细菌内毒素)是一种细胞壁成分和克阴性细菌的表面抗原(例如,肠杆菌、伪多糖,或军团菌)。热稳定和大分子(分子量1-4 x 10⁶ kDa)由脂质莫伊蒂(脂质A)、核心区域(寡糖)和O多糖(或O抗原)组成。脂质A,其疏水性脂肪酸链,锚定分子到细菌膜和调解(在细菌降解)的免疫活性和毒性的LPS。继与LPS结合蛋白(LBP)结合后,LPS:LBP复合物可使位于许多细胞类型的表面的CD14/TLR4/MD2受体复合物结合,通过NF-βB核易位和随后的上升调节诱导强烈的前列腺炎反应细胞因子表达2。

急性肺损伤(ALI)被定义为急性低氧呼吸衰竭与双边肺水肿,在没有心力衰竭3。LPS的气道管理是诱发肺部炎症和ALI4,5,6,7的常见方法。虽然无菌物质不适合研究传染病的药理干预,但机械免疫学问题可以足够精确地回答。LPS 注入气管诱导强大的炎症反应与白细胞入侵, 前列腺炎细胞因子的调节, 和中断的白细胞 - 毛细血管屏障在几个小时到几天内, 取决于 LPS 剂量^{3, 6,7}.

提出的协议描述了通过内切液LPS灌输诱导小鼠的ALI的详细分步程序。该模型已经通过评估细胞因子表达、中性粒细胞细胞入侵和肺泡内白蛋白泄漏进行了验证,如前所述8。

此动物协议由当地动物护理委员会(德国莱克林豪森的LANUV;第84-02.04.2015号协议)批准,并根据国家卫生研究院使用活体动物的准则(NIH出版物)执行第85-23号,1996年修订)。

1. 阿里公司感应

1. 在10-12周的年龄使用成年C57BL/6小鼠。将动物安置在单独通风的笼子里,免费获得水和标准啮齿动物。然而,有可能对年轻的动物和其他小鼠菌株执行这种方法。
2. 在-20°C下以5mg/mL的浓度将LPS(大肠杆菌O111:B4)储存在等分物中。对于内切液灌输,将无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的LPS稀释至最终浓度为2,000微克/mL。
3. 称量鼠标。注射氯胺酮 [120 毫克/千克小鼠体重 (BW)] 和木拉津 (16 mg/kg BW) 腹内 (腹部下三分之一, 副苯丙胺), 并等待麻醉开始.
4. 通过诱导触觉刺激检查麻醉深度。在麻醉不足的情况下,用氯胺酮(30毫克/千克BW)和木拉津(4毫克/千克BW)重复注射。
5. 将鼠标置于温度控制表上的易发位置,以保持 37°C 的体温。
6. 应用无菌性眼科润滑剂,防止麻醉下角膜干燥。
7. 将头部和钩形切口抬起位于桌子上方约 5 厘米的水平杆上,而前爪与桌子保持密切接触。相对于桌子,以 90° 角将颈部超延长(图 1)。用钳子握住舌头,以拉直喉咙,以简化插管条件。
8. 将 22 号 (G) 静脉导管切割至 20 mm 的长度,沿舌头根部沿垂直方向轻轻插入导管。在喉上方的皮肤上放置冷光源,以帮助可视化声带,并瞄准气管。如果发生喉部阻力,在再次前进之前,将导管缩回几毫米。
9. 将导管插入气管约 10 mm。确保插入不要太深,因为这将导致液体单方面注入右侧或左侧主支气管。
10. 使用移液器在 PBS 中稀释的注射 LPS (5 μg/g BW) [注射体积取决于小鼠体重(例如,20 g 体重 = 使用 50 μl 的 LPS 溶液)]。
    注:小鼠通常会咳嗽或喘息,以适当将液体注入气管。
11. 连接注射器并加入 50 mL 空气,以确保完全的液体体积分布在肺部。慢慢取下导管。
12. 保持鼠标上半身直立姿势 30 s,以避免液体从气管泄漏。
13. 在假手术的动物中,在气管内注射50μL无菌PBS,而不是LPS。
14. 在ALI诱导后立即将盐酸氯丁丙诺啡0.08毫克/千克BW皮下注射到颈部松弛的皮肤中,此后每12小时,在前48小时。
15. 保持37°C的体温,直到将鼠标放在加热垫上,恢复完全的意识。
16. 将鼠标转移到单独通风的笼子里,免费获得食物和水。定期监视鼠标。体温下降和呼吸抑郁表明ALI的诱导正确。

2. 血液取样、支气管肠活管、器官采集

注:安乐死的时机取决于所处理的科学问题。通常,在LPS灌输3、4、9、10之后执行12-72小时。ALI的严重程度可以通过定期观察体温和呼吸窘迫^症状11临床确定。

1. 通过将鼠标放入一个充满单曲子的房间里,诱导麻醉。使用含氧量为1升/分钟的3 vol%无氧。在麻醉深度不足的情况下,增加的共分增达5 vol%。
2. 通过亚特兰托-腹肌错位在深层麻醉中牺牲小鼠。
3. 用胶带将鼠标固定在手术台上,然后用70%乙醇对腹部的毛皮进行消毒。用剪刀和钳子小心地打开中间线的腹腔。取出部分肠道,以达到对椎骨柱和腹部主塔的维纳斯卡瓦低劣(IVC)的通道。
4. 找到肾静脉,并将连接到1 mL注射器的弯曲23 G卡努拉插入静脉汇合处正下方的IVC中。吸气250μL的血液,并转移到一个1.5 mL管,填充20μL的0.5M乙烯二甲酸(EDTA)溶液。轻轻摇动,以方便EDTA混合,并将管放在冰上。
5. 对于支气管静脉排管 (BAL),准备三个 1 mL 注射器,每个注射器的无菌 PBS 为 0.5 mL,空气为 0.1 mL。很快用70%乙醇对喉咙的皮毛进行消毒,用剪刀和钳子小心地暴露气管。调动气管,包裹缝合线。
6. 执行 BAL:用微剪刀刺穿气管,插入22G静脉导管切口至20毫米长。用缝合线固定导管,并注入0.5 mL的无菌PBS和0.1 mL的空气。60s后吸气。用额外的两个注射器重复这个程序,并在冰上的15 mL管中收集整个吸气液。
7. 用剪刀和钳子小心地打开胸腔,以收获肺部。沿成本边角切割隔膜,用两个横向切口穿过肋骨。小心避免刺穿肺部。提起胸骨颅,并修复或移除它。
8. 用37°C暖PBS(不含钙和镁)制备两个10mL注射器。在左心室做一个小切口。用 26 G 卡努拉刺穿右心室,用预热的 PBS 冲洗肺循环。请注意,在手术过程中肺部会变苍白。
9. 取出肺的右叶,切成两半。将它们在液氮中冷冻,然后长期储存在-80°C,以进一步进行基因表达和蛋白质分析。
10. 取出整个左肺,并通过用剪刀和钳子切碎组织,将其在48孔板中均匀化。在2 mL消化缓冲液[RPMI 1640中孵育组织,用10%胎儿小牛血清(FCS)和0.1%NaN_3,胶原酶I(1mg/mL)和DNase II(7mg/mL)]在37°C下进行60分钟。通过仔细移液肺组织片断,进一步进行均质化。下来。

3. FACS分析的组织准备

1. 准备新鲜的FACS缓冲液(表1):始终使用无钙和镁的PBS,以减少阳离子依赖细胞对细胞的粘附,防止结块。补充 FCS (1%)保护细胞免受凋亡,防止非特异性染色,并防止细胞粘附在FACS管上。包括 EDTA (0.5 mM),以防止在使用粘附和粘附细胞(如巨噬细胞)时,基于阳离子的细胞对细胞粘附。加入阿齐德钠(0.1%),因为它可以防止细菌污染和氟铬的光漂白,并阻止抗体脱落。
2. 将血液样本(步骤2.4)转移到5 mL FACS管中,将血液与2 mL红细胞莱沙缓冲液轻轻混合。将管子放在冰上,在2分钟后通过加入2 mL的冷PBS终止反应。在 400 x g下将样品离心 5 分钟,并丢弃上清液。根据前面描述的协议12,用60μL的FACS缓冲液重新悬浮细胞颗粒,并处理后续的FACS染色过程。
   注:小鼠安乐死的时机影响白细胞计数作为全身炎症的一部分。因此,建议在此步骤中将细胞数调整为 1 x 10⁶细胞/60 μL,以实现流式细胞测定分析的最佳染色结果。
3. 离心 BAL 流体(步骤 2.6)在 400 x g下 5 分钟。将上清液吸出并冷冻在液氮中,然后长期储存在-80°C,以便进一步分析蛋白质。用2 mL的冷FACS缓冲液重新悬浮BAL细胞颗粒,然后用100μm网状过滤器将悬浮液转移到5mL FACS管中,以抑制毛发。
4. 再次,在400 x g下将样品离心5分钟。根据前面描述的协议12,用60μL的FACS缓冲液重新悬浮颗粒,并处理后续的FACS染色。
   注:小鼠安乐死的时机影响BAL中的白细胞计数,作为炎症的一部分。因此,建议在此步骤中将细胞数调整为 1 x 10⁶细胞/60 μL,以实现流式细胞测定分析的最佳染色结果。
5. 使用 100 μL 网状过滤器将消化的左肺组织(步骤 2.10)转移到 5 mL FACS 管中,通过添加 2 mL 的冰冷 FACS 缓冲液提取团块并终止消化过程。在 400 x g下将样品离心 5 分钟。丢弃上清液,用60μL的FACS缓冲液重新悬浮颗粒,并按照前面描述^的协议12进行后续FACS染色处理。
   注:小鼠安乐死的时机影响肺组织中的白细胞计数,作为炎症的一部分。因此,建议将细胞数调整为1 x 10⁶细胞/60 μL,以达到流动细胞测定分析的最佳染色结果。
6. 对于FACS分析,用CD16/CD32抗体孵育细胞在4°C下15分钟,以阻止免疫球蛋白与Fc受体的非特异性结合。在 5 mL 管中向 1 x 10⁶个细胞中加入 20 μL 的阻断溶液。
7. 同时,如表2所述,准备一个与FACS缓冲液和抗体的母体混合物。
8. 阻塞后,不要清洗细胞。每个样品加入20μL的抗体主混合物,以获得100μL的最终体积。
9. 用1 mL的FACS缓冲液清洗每个样品,在400 x g下用离心机清洗5分钟。丢弃上清液,用FACS缓冲液将颗粒重新悬浮到适当的细胞浓度,用于FACS测量。
   注:在使用该协议的FACS分析中,建议使用1 x 10⁶细胞/500μL的细胞数,以达到最佳的免疫附称结果。然而,建议抗体必须单独打上定位。
10. 如果需要,使用特定的市售套件⁸在表面染色之前添加活/死染色。
11. 最后,在每个样品中添加固定数量的市售氟铬耦合校准磁珠(20 μL FACS缓冲液中的3 x 10⁵个珠子),以确定绝对细胞^数12。血液、BAL和组织细胞的浇注策略如图2所示。

LPS灌输后,通过评估细胞因子表达、中性粒细胞渗透和肺毛细血管屏障破坏24小时和72小时后,通过评估小鼠诱导ALI的方法得到了验证。PBS注射的动物充当控制。内切术LPS管理诱导一个强大的肺前列腺炎反应。与对照动物相比,肺组织中TNF-α的表达明显增强,达到持续和超过50倍的增幅[RQ(TNF-+/18s);24小时:53.7(SD = 11.6);72小时:55.0(SD = 20.6);p <0.05)](图3A)。白细胞侵入组织和藻外空间是ALI13发展的标志和特征。FACS分析显示,中性粒细胞(NG)大量渗入肺间质,绝对细胞计数比24小时[65,243(SD = 15,855)与7,358(SD = 4,794)后对照组增加近9倍](SD = 4,794),p [lt; 0.05]图 3B.绝对NG计数在72小时后略有下降;然而,与对照组相比,系数增加保持稳定[48,946 (SD = 5,223) 与 5,510 (SD = 654),p < 0.05]。与间质NG渗透一致,整个肺组织的MMP-9表达在总观察期[RQ(MMP-9/18s),24小时:7.4(SD = 1.5);72 h:10.4(SD = 2.0);p [lt; 0.05](图3C) 中同样显著增加。

NG不仅在肺组织增加,而且在BAL流体中增加。与对照动物相比,增加的倍数比肺组织更明显,在ALI诱导52,005(SD = 21,906)后,绝对NG计数为24小时,而1,829(SD = 1,724)(p <0.05)(图3D)。72小时后,NG增加到37,254(SD = 4,478)对17.0(SD = 10.8)(p <0.05)。肺水肿由于严重损伤的肺毛细血管屏障是发展ALI的病变,与LPS迅速诱导内皮凋亡和增加渗透性14,15。ELISA对BAL流体中白蛋白含量的分析表明,阻隔功能显著丧失。LPS灌输后24小时,BAL流体中的白蛋白为43纳克/mL(SD = 13),而在控制条件下为20纳克/mL(SD = 9)(图3E)。72小时后,在ALI动物中,白蛋白含量为48纳克/mL(SD = 14),而29纳克/mL(SD = 9)(p <0.05)。

图 1:插管设置的原理图。需要注意的是,鼠标的颈部应相对于手术台以 90° 角超长。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:血液、BAL和组织细胞的FACS门控策略。FACS 分析的模范点缀以双参数(双色荧光)伪色图显示。各个样本的浇注策略基于单个单元。(A) 血细胞的浇注树:a = 死细胞;b = 活细胞(根据活细胞/死细胞染色;没有必要的CD45染色,如血液中,高自荧光使细胞群体明显可区分);d = 中性粒细胞;e = 单核细胞(根据 Gr1 和 CD115 染色)。(B) 支气管活杨洗浴液(BAL)液的浇注树:a= 死细胞;b = 活细胞(根据活细胞/死细胞染色);c = CD45=免疫细胞;d = 中性粒细胞;e = 巨噬细胞(根据 Ly6G 和 F4/80 染色)。(C) 肺组织用树:a = 死细胞;b = 活细胞(根据活细胞/死细胞染色);c = CD45=免疫细胞;d = 中性粒细胞;e = 巨噬细胞(根据 Ly6G 和 F4/80 染色)。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:对照动物验证鼠ALI模型。(A) 在雌性 C57BL/6 小鼠的肺组织中表达 TNF-α 24 小时和 72 小时后,在宫内 LPS 灌输(假手术动物的表达的折叠变化)。(B) FACS对肺组织中绝对中性粒细胞计数的分析。(C) 肺组织中MMP-9的表达(假动物表情的折叠变化)。(D) FACS分析支气管活菌洗液中绝对中性粒细胞计数。(E) BAL 流体中的白蛋白含量 [均值 = SD, n = 7, 曼-惠特尼 U 测试, [p < 0.05 (与 PBS 控制)]。这个数字已由埃伦特等人8修改。请点击此处查看此图的较大版本。

表1:FACS缓冲区的组成。

表2:为FACS染色准备主混合物。该表描述了 10 个样本的主混合准备。

作者没有什么可透露的。