Method Article

通过直接内切内脂多糖灌输诱导小鼠急性肺损伤

DOI:

10.3791/59999

⸱

July 6th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Hospital Bonn

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里介绍的是一个逐步的过程,通过直接的内切内脂多糖灌输诱导小鼠急性肺损伤,并执行FACS分析血液样本,支气管洗浴液和肺组织。微创性、简单处理、良好的可重复性和疾病严重程度的滴定是这种方法的优点。

Abstract

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脂多糖(LPS)气道管理是研究小动物模型中肺部炎症和急性肺损伤(ALI)的常用方法。已经描述了各种方法,例如吸入气溶胶LPS以及鼻腔或内气浸灌输。提出的方案描述了通过直接宫内LPS灌输诱导小鼠ALI的详细分步程序,并执行对血液样本、支气管性(BAL)液体和肺组织的FACS分析。腹管内镇化后,气管暴露,LPS通过22G静脉导管施用。根据使用的LPS剂量,在数到几天内诱导一种强健且可重复的炎症反应,其内为白细胞入侵、前列腺炎细胞因子的增调和白细胞屏障的中断。协议详细介绍了采集血液样本、BAL液体和肺采集以及FACS分析的处理。虽然无菌LPS的使用不适合研究传染病的药理干预,但所述方法提供最小的侵入性、简单的处理和良好的可重复性来回答机械免疫学问题。此外,剂量滴定以及使用替代LPS制剂或小鼠菌株允许调节临床效果,这可能表现出不同程度的ALI严重程度或早期与晚发病症状。

Introduction

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实验动物模型在基础免疫研究中不可或缺。管理整个细菌或微生物成分已经常用于小动物模型,以诱发局部或全身炎症1。脂多糖(LPS,或细菌内毒素)是一种细胞壁成分和克阴性细菌的表面抗原(例如,肠杆菌、伪多糖,或军团菌)。热稳定和大分子(分子量1-4 x 106 kDa)由脂质莫伊蒂(脂质A)、核心区域(寡糖)和O多糖(或O抗原)组成。脂质A,其疏水性脂肪酸链,锚定分子到细菌膜和调解(在细菌降解)的免疫活性和毒性的LPS。继与LPS结合蛋白(LBP)结合后,LPS:LBP复合物可使位于许多细胞类型的表面的CD14/TLR4/MD2受体复合物结合,通过NF-βB核易位和随后的上升调节诱导强烈的前列腺炎反应细胞因子表达2。

急性肺损伤(ALI)被定义为急性低氧呼吸衰竭与双边肺水肿,在没有心力衰竭3。LPS的气道管理是诱发肺部炎症和ALI4,5,6,7的常见方法。虽然无菌物质不适合研究传染病的药理干预,但机械免疫学问题可以足够精确地回答。LPS 注入气管诱导强大的炎症反应与白....

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Protocol

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此动物协议由当地动物护理委员会(德国莱克林豪森的LANUV;第84-02.04.2015号协议)批准,并根据国家卫生研究院使用活体动物的准则(NIH出版物)执行第85-23号,1996年修订)。

1. 阿里公司感应

  1. 在10-12周的年龄使用成年C57BL/6小鼠。将动物安置在单独通风的笼子里,免费获得水和标准啮齿动物。然而,有可能对年轻的动物和其他小鼠菌株执行这种方法。
  2. 在-20°C下以5mg/mL的浓度将LPS(大肠杆菌O111:B4)储存在等分物中。对于内切液灌输,将无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的LPS稀释至最终浓度为2,000微克/mL。
  3. 称量鼠标。注射氯胺酮 [120 毫克/千克小鼠体重 (BW)] 和木拉津 (16 mg/kg BW) 腹内 (腹部下三分之一, 副苯丙胺), 并等待麻醉开始.
  4. 通过诱导触觉刺激检查麻醉深度。在麻醉不足的情况下,用氯胺酮(30毫克/千克BW)和木拉津(4毫克/千克BW)重复注射。
  5. 将鼠标置于温度控制表上的易发位置,以保持 37°C 的体温。
  6. 应用无菌性眼科润滑剂,防止麻醉下角膜干燥。
  7. 将头部和钩形切口抬起位于桌子上方约 5 厘米的水平杆上,而前爪与桌子保持密切接触。相对于桌子,以 90° 角将颈部超延长(图 1)。用钳子握住舌头,以拉直喉....

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Results

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LPS灌输后,通过评估细胞因子表达、中性粒细胞渗透和肺毛细血管屏障破坏24小时和72小时后,通过评估小鼠诱导ALI的方法得到了验证。PBS注射的动物充当控制。内切术LPS管理诱导一个强大的肺前列腺炎反应。与对照动物相比,肺组织中TNF-α的表达明显增强,达到持续和超过50倍的增幅[RQ(TNF-+/18s);24小时:53.7(SD = 11.6);72小时:55.0(SD = 20.6);p <0.05)](图3A)。白细胞侵入组织和藻外空间是ALI13发展的标志和特征。FACS分析显示,中性粒细胞(NG)大量渗入肺间质,绝对细胞计数比24小时[65,243(SD = 15,855)与7,358(SD = 4,794)后对照组增加近9倍](SD = 4,794),p [lt; 0.05]图 3B.绝对NG计数在72小时后略有下降;然而,与对照组相比,系数增加保持稳定[48,946 (SD = 5,.......

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Discussion

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微创性、简单处理和良好的可重复性是所呈现的方法的关键特征,用于在小型啮齿动物模型中诱导 ALI。在动物模型中使用LPS代替整个细菌具有优势。它是一种稳定和纯净的化合物,可以储存在冻干形式,直到使用。它是通过TLR4途径进行先天免疫反应的有力兴奋剂,其生物活性易于量化,促进疾病严重程度的滴定,具有良好的可重复性。此外,使用LPS已被证明作为安全模型,诱导急性支气管炎在人类健康志愿者,从而允许翻译从长凳到床边16。Rittirsch等人已经证明了典型的阿尔维奥洛毛细管泄漏的剂量和时间依赖性的发展,在宫内LPS的小鼠模型6。这允许剂量滴定达到某些期望的效果,这可以说明不同程度的ALI严重程度或早期与后期发病症状。然而,如果要解决不同的感染或药理问题(例如抗生素治疗),由无菌LPS灌输引起的ALI不是一个合适的模型。

此外,与肺内或静脉注射细菌相比,肺动脉毛细血管屏障的中断被描述为相当温和3,质疑该模型的适用性,以及改变的渗透性是否应调查特别。正确.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢扬·克莱纳和苏珊娜·舒尔茨提供技术支持。作者肯定了波恩大学医学院对流式细胞学核心设施的出色支持。提交人没有得到任何外部组织的任何资助。 结果部分给出如图3所示的部分数据已在上一份出版物8中显示。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml 注射器BD，美国新泽西州富兰克林湖300013
10 ml 注射器BD，美国新泽西州富兰克林湖309110
抗 CD115 （c-fms） APCThermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆17-1152-80
抗 CD11b （M1/70） - FITCThermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆11-0112-81
抗 CD45 （30-F11） - eF450Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆48-0451-82
F4/80 抗体 （BM-8） - PE Cy7Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆25-4801-82
GR1 （RB6-8C5）BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖552093
抗 Ly6C （HK1.4） PerCP-Cy5.5Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆45-5932-82
抗 Ly6G 抗体 （1A8） APC/Cy7Bio Legend，加利福尼亚州圣地亚哥127623
盐酸丁丙诺啡Indivior UK Limited，伯克希尔，英国
C57BL/6 小鼠，雌性，10 - 12 周龄Charles River，Wilmongton，MA，USA
CaliBRITE APC 珠子（6µm）BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖340487
Canula 23 gauge 1''BD，美国新泽西州富兰克林湖300800
Canula 26 gauge 1/2''BD，美国新泽西州富兰克林湖303800
细胞过滤器 70 µmBD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖352350
I 型胶原酶Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯1148089
脱氧核糖核酸酶 IISigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯D8764 
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），无菌Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯D8662
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），不含氯化钙和氯化镁，无菌Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯D8537
乙二胺四乙酸 （EDTA） 溶液Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯E7889
FACS 管，5 mlSarstedt，Nümbrecht， 德国551579
胎牛血清 （FCS）Sigma-Aldrich， St. Louis， MO， USAF2442
镊子精细科学工具，德国海德堡11049-10
异氟醚Baxter， Unterschleißheim，德国
胺酮盐酸盐Serumwerk Bernburg，Bernburg，德国
来自大肠杆菌 O111：B4Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯的L2630
LIVE/DEAD 可固定死细胞绿色试剂盒Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆L23101
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc Block™），克隆2.4G2BD，美国新泽西州富兰克林湖553141
红细胞裂解缓冲液Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆00-4333-57
RPMI-1640，含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易R8758
剪刀精细科学工具，德国海德堡14060-09
叠氮化钠 （NaN3）Sigma-Aldrich，圣美国密苏里州路易S2002
弹簧剪刀精细科学工具，德国海德堡15018-10
组织镊子精细科学工具，德国海德堡11021-12
管Eppendorf，德国汉堡30125150
静脉导管，22 号B.Braun，Melsungen，德国4268091B
甲苯噻嗪hydrochlorideSerumwerk Bernburg， 德国
氯脂多糖 （LPS） 斯 斯 Bernburg

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
  2. Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
  3. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R.

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