本文介绍了一种通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤的逐步操作方法，以及对血液样本、支气管肺泡灌洗液和肺组织进行流式细胞术分析的方法。该方法具有侵入性小、操作简便、可重复性好以及可滴定疾病严重程度等优点。
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本文内容
摘要
摘要
气道给予脂多糖（LPS）是研究小动物模型中肺部炎症和急性肺损伤（ALI）的常用方法。已有多种方法被报道，例如吸入雾化LPS，以及经鼻或经气管滴注。本方案详细描述了通过直接经气管滴注LPS在小鼠中诱导ALI，并对血液样本、支气管肺泡灌洗（BAL）液和肺组织进行流式细胞术（FACS）分析的逐步操作流程。在腹腔注射麻醉后，暴露气管，并通过22 G静脉导管给予LPS。根据所用LPS剂量的不同，数小时至数天内即可诱导出稳定且可重复的炎症反应，表现为白细胞浸润、促炎细胞因子上调以及肺泡-毛细血管屏障的破坏。本方案详细说明了血液样本、BAL液的采集、肺组织的获取，以及用于FACS分析的样品处理步骤。尽管无菌LPS不适合用于感染性疾病中药物干预的研究，但该方法具有侵入性小、操作简便和可重复性好的优点，适用于回答机制性免疫学问题。此外，通过调整LPS剂量、使用不同的LPS制剂或小鼠品系，可调节其临床效应，从而表现出不同程度的ALI严重性或疾病症状的早期与晚期出现。
引言
实验动物模型在基础免疫学研究中不可或缺。在小型动物模型中，常通过给予全菌或微生物组分来诱导局部或全身性炎症1。脂多糖（LPS，或称细菌内毒素）是革兰氏阴性菌（如肠杆菌科、假单胞菌属或军团菌属）的细胞壁组分和表面抗原。该分子具有热稳定性，为大分子结构（分子量为1-4 × 106 kDa），由脂质部分（脂质A）、核心区域（寡糖）和O多糖（或称O抗原）组成。脂质A含有疏水性脂肪酸链，可将分子锚定于细菌膜中，并在细菌降解后介导LPS的免疫活性与毒性。LPS与脂多糖结合蛋白（LBP）结合后，形成的LPS:LBP复合物可与多种细胞表面的CD14/TLR4/MD2受体复合物结合，从而引发强烈的促炎反应，导致NF-κB向细胞核转位，并继而上调细胞因子的表达2。
急性肺损伤（ALI）是指在无心力衰竭的情况下出现的急性低氧性呼吸衰竭，并伴有双侧肺水肿3。通过气道给予LPS是诱导肺部炎症和ALI的常用方法4,5,6,7。尽管该无菌性刺激物不适用于感染性疾病中药物干预的研究，但可用于精确回答机制性免疫学问题。气管内灌注LPS可在数小时至数天内引发强烈的炎症反应，表现为白细胞浸润、促炎细胞因子上调以及肺泡-毛细血管屏障的破坏，具体反应程度取决于LPS的剂量3,6,7。
本方案介绍了一种通过气管内滴注脂多糖（LPS）在小鼠中诱导急性肺损伤（ALI）的详细逐步操作流程。该模型已通过检测细胞因子表达、中性粒细胞浸润以及肺泡内白蛋白渗漏进行验证，相关方法此前已有描述8。
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方案
本动物实验方案已获当地动物护理委员会（德国雷克林豪森，LANUV；方案编号：84-02.04.2015）批准，并严格遵循美国国立卫生研究院关于活体动物使用的指南（NIH 出版物编号 85-23，1996 年修订版）执行。
1. ALI 诱导
- 使用成年个体 约10-12周龄的C57BL/6小鼠 周。将动物饲养在独立通风的笼具中，自由饮水并饲喂标准啮齿类动物饲料。然而，该方法也可用于较年轻的动物及其他品系的小鼠。
- 将脂多糖（LPS，Escherichia coli O111:B4）分装保存，浓度为 5 mg/mL，置于 -20 °C。用于气管内滴注时，将 LPS 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至终浓度为 2,000 µg/mL。
- 称量小鼠体重。按120 mg/kg小鼠体重（BW）剂量腹腔注射氯胺酮（ketamine），同时注射赛拉嗪（xylazine）16 mg/kg BW（注射部位为腹部下三分之一区域，旁正中位置），随后等待麻醉起效。
- 通过施加触觉刺激检查麻醉深度。若麻醉不足，需重复注射氯胺酮（30 mg/kg 体重）和赛拉嗪（4 mg/kg 体重）。
- 将小鼠俯卧位放置于控温平台上，以维持其体温在37 °C。
- 涂抹无菌眼用润滑剂，以防止麻醉状态下角膜干燥。
- 将头部抬起，用门齿钩住位于桌面上方约5 cm处的水平横杆，同时前肢紧贴桌面保持接触。将颈部相对于桌面超伸展至90°角（图1用镊子夹住舌头以拉直咽喉，便于插管。
- 将22号（G）静脉导管剪至20 mm长度。沿舌根垂直方向轻柔插入导管。将冷光源置于喉部上方皮肤处，以帮助观察声带并定位气管。若遇到喉部阻力，先将导管回撤数毫米，再重新推进。
- 将导管插入气管约10 mm。注意插入深度不宜过深，以免导致液体单侧灌注至右侧或左侧主支气管。
- 使用移液器将溶于PBS的LPS（5 µg/g体重）注射 注射体积根据小鼠体重而定（例如，20 g 体重 → 使用 50 µL LPS 溶液
注意：将液体正确注入气管后，小鼠通常会出现咳嗽或喘息反应。 - 连接注射器，注入50 μL空气团，以确保液体完全分布于肺部。缓慢拔出导管。
- 将小鼠上半身保持直立姿势30秒，以防止液体从气管泄漏。
- 在假手术组动物中，改为气管内注射 50 µL 无菌 PBS，而非 LPS。
- 在诱导急性肺损伤（ALI）后立即于颈部松弛皮肤处皮下注射盐酸丁丙诺啡 0.08 mg/kg 体重，并在最初 48 小时内每 12 小时重复给药一次。
- 将小鼠置于加热垫上，维持体温为37°C，直至其完全恢复意识。
- 将小鼠转移至独立通风笼具中，自由摄取食物和水。定期监测小鼠状态。体温下降和呼吸抑制表明急性肺损伤（ALI）造模成功。
2. 血液采样、支气管肺泡灌洗、器官采集
注意：处死动物的时间取决于所研究的科学问题，通常在LPS滴注后12–72小时进行3,4,9,10。急性肺损伤（ALI）的严重程度可通过定期观察体温和呼吸窘迫症状在临床上确定11。
- 将小鼠置于充满异氟烷的麻醉舱内以诱导麻醉。使用3 vol%异氟烷，氧流量为1 L/min。通过施加触觉刺激确认深度麻醉状态；若麻醉深度不足，可将异氟烷浓度提高至最高5 vol%。
- 在深度麻醉状态下通过枕寰关节脱位法处死小鼠。
- 用胶带将小鼠固定于手术台上，用70%乙醇短暂消毒腹部毛发。使用剪刀和镊子沿中线小心切开腹腔，移开部分肠道，暴露位于脊柱右侧的下腔静脉（IVC）和腹主动脉。
- 定位肾静脉，在肾静脉汇合处下方的下腔静脉（IVC）插入连接1 mL注射器的弯头23 G套管。吸取250 µL血液，并转移至含有20 µL 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液的1.5 mL离心管中。轻轻振荡以促进EDTA混合，随后将管子置于冰上。
- 进行支气管肺泡灌洗（BAL）前，准备三支1 mL注射器，每支装有0.5 mL无菌PBS和0.1 mL空气。用70%乙醇短暂消毒颈部毛发，使用剪刀和镊子小心暴露气管。游离气管并用缝线环绕固定。
- 进行BAL操作：使用显微剪刀刺穿气管，插入一段剪裁至20 mm长度的22 G静脉导管。用缝线固定导管，注入0.5 mL无菌PBS和0.1 mL空气。60秒后回吸灌洗液。重复该操作两次，使用另外两支注射器，将全部回吸液收集于冰上的15 mL离心管中。
- 使用剪刀和镊子小心打开胸腔以取出肺组织。沿肋缘切断膈肌，并通过两侧切口剪断肋骨，注意避免刺破肺组织。将胸骨向上（头侧）抬起并固定或移除。
- 准备两支10 mL注射器，装入37 °C预热的PBS（不含钙和镁）。在左心室做一小切口，用26 G套管穿刺右心室，用预热的PBS冲洗肺循环。注意观察操作过程中肺组织逐渐变苍白的现象。
- 取下右肺叶并切成两半，迅速在液氮中冷冻，随后于-80 °C长期保存，用于后续基因表达和蛋白质分析。
- 完整取出左肺，在48孔板中使用剪刀和镊子将组织剪碎进行匀浆。将组织置于2 mL消化缓冲液[RPMI 1640培养基含10%胎牛血清（FCS）、0.1% NaN3、I型胶原酶（1 mg/mL）和II型DNase（7 mg/mL）]中，于37 °C孵育60分钟。通过轻柔吹打肺组织碎片进一步完成匀浆。
3. FACS 分析的组织制备
- 配制新鲜的FACS缓冲液（表1）：始终使用不含钙和镁的PBS，以减少阳离子依赖性的细胞间黏附，防止细胞成团。添加FCS（1%），以保护细胞免于凋亡、防止非特异性染色以及避免细胞黏附于FACS管壁。对于巨噬细胞等易黏附的细胞，加入EDTA（0.5 mM）以防止阳离子介导的细胞间黏附。添加叠氮化钠（0.1%），因其可防止细菌污染、减少荧光染料的光漂白，并抑制抗体脱落。
- 将血液样本（步骤2.4）转移至5 mL FACS管中，轻轻混匀2 mL红细胞裂解缓冲液。将管子置于冰上，2分钟后加入2 mL预冷的PBS终止反应。以400 x g离心5分钟，弃去上清液。用60 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，并根据先前描述的方案进行后续FACS染色12。
注意：小鼠安乐死的时间会影响白细胞计数，这是系统性炎症的一部分。因此，建议在此步骤中将细胞数量调整为1 × 106 个细胞/60 µL ，以获得最佳的流式细胞术分析染色效果。 - 将支气管肺泡灌洗液（BAL液，步骤2.6）以400 x g离心5分钟。吸除上清液，用液氮速冻后于-80 °C长期保存，用于后续蛋白质分析。用2 mL预冷的FACS缓冲液重悬BAL细胞沉淀，然后通过100 µm孔径滤网转移至5 mL FACS管中，以去除毛发等杂质。
- 再次以400 x g离心样品5分钟。用60 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，并根据先前描述的方案进行后续FACS染色12。
注意：小鼠安乐死的时间会影响BAL液中的白细胞计数，这是炎症反应的一部分。因此，建议在此步骤中将细胞数量调整为1 × 106 个细胞/60 µL，以获得最佳的流式细胞术分析染色效果。 - 将消化后的左肺组织（步骤2.10）通过100 µm孔径滤网转移至5 mL FACS管中，以去除细胞团块，并加入2 mL预冷的FACS缓冲液终止消化过程。以400 x g离心5分钟。弃去上清液，用60 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，并根据先前描述的方案进行后续FACS染色12。
注意：小鼠安乐死的时间会影响肺组织中的白细胞计数，这是炎症反应的一部分。因此，建议将细胞数量调整为1 × 106 个细胞/60 µL，以获得最佳的流式细胞术分析染色效果。 - 进行FACS分析时，将细胞与CD16/CD32抗体在4 °C孵育15分钟，以阻断免疫球蛋白与Fc受体的非特异性结合。在5 mL管中，向60 µL含1 × 106 个细胞的悬液中加入20 µL封闭液。
- 同时，按照表2所述，用FACS缓冲液和抗体配制主混合液。
- 封闭后无需洗涤细胞。每份样品加入20 µL抗体主混合液，使终体积达到100 µL。将样品在4 °C避光孵育20分钟。
- 每份样品用1 mL FACS缓冲液洗涤，以400 x g离心5分钟。弃去上清液，用FACS缓冲液将细胞沉淀重悬至适合FACS检测的细胞浓度。
注意：建议将细胞数量调整为1 × 106 个细胞/500 µL，以在此方案中获得最佳的免疫表型分析结果。然而，建议对每种抗体进行单独的滴定优化。 - 如需要，可在表面染色前使用特定的市售活/死细胞染色试剂盒进行活/死细胞染色8。
- 最后，向每份样品中加入固定数量的市售荧光偶联校准微球（3 × 105 颗微球溶于20 µL FACS缓冲液），用于确定绝对细胞数量12。血液、BAL液及组织细胞的设门策略见图2。
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结果
通过检测脂多糖（LPS）滴注后24小时和72小时的小鼠细胞因子表达、中性粒细胞浸润以及肺泡-毛细血管屏障的破坏情况，验证了本研究所述诱导小鼠急性肺损伤（ALI）的方法。PBS注射动物作为对照组。经气管给予LPS可诱导强烈的肺部促炎反应。肺组织中TNF-α的表达显著上调，与对照组动物相比，其表达水平持续升高，增幅超过50倍[RQ (TNF-α/18s)；24小时：53.7（SD = 11.6）；72小时：55.0（SD = 20.6）；p < 0.05]（图3A）。白细胞向组织和肺泡腔的侵袭是ALI发生发展的标志性特征13。流式细胞术分析显示，中性粒细胞（NG）显著浸润至肺间质，24小时后其绝对细胞数较对照组几乎增加了9倍[65,243（SD = 15,855）vs. 7,358（SD = 4,794），p < 0.05]（图3B）。72小时后NG的绝对计数略有下降，但相对于对照组的升高倍数仍保...
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讨论
在小型啮齿类动物模型中，本研究所提出的方法具有微创性、操作简便和良好的可重复性等关键特征。在动物模型中使用脂多糖（LPS）而非完整细菌具有多项优势。LPS是一种稳定且纯净的化合物，可冻干保存直至使用。它通过TLR4通路强烈激活先天免疫反应，其生物活性易于定量，便于精确滴定以实现良好可重复性的疾病严重程度调控。此外，已有研究表明，LPS可作为安全的模型用于在健康志愿者中诱导急性支气管炎，从而实现从实验室到临床的转化16。Rittirsch 等人已在小鼠气管内滴注LPS的模型中，证实了特征性的肺泡-毛细血管屏障通透性增加呈剂量和时间依赖性的发展过程6。这使得可通过调节LPS剂量来实现特定的实验效应，从而模拟不同程度的急性肺损伤（ALI）严重性，或疾病症状的早期与晚期出现。然而，若需研究特定的感染学或药理学问题（例如抗生素治疗），则无菌LPS滴注所诱导的ALI并非合适的模型。
此外，与细菌的肺内或静脉递送相比，肺泡-毛细血管屏障的破坏被描述为相对较轻3
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Jan Kleiner和Susanne Schulz提供的技术支持。作者对波恩大学医学院流式细胞术核心设施提供的出色支持表示感谢。作者未从任何外部机构获得资助。 结果部分给出的部分数据及图3中所示内容已在先前的出版物中发表8。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 ml 注射器 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | 300013 | |
| 10 ml 注射器 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | 309110 | |
| 抗 CD115（c-fms）APC | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 17-1152-80 | |
| 抗CD11b（M1/70）-FITC | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 11-0112-81 | |
| 抗 CD45（30-F11）- eF450 | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 48-0451-82 | |
| 抗F4/80（BM-8）-PE Cy7 | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 25-4801-82 | |
| 抗Gr1（RB6-8C5） | 美国新泽西州富兰克林湖，BD 生物科学公司 | 552093 | |
| 抗-Ly6C（HK1.4）PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 45-5932-82 | |
| 抗Ly6G（1A8）APC/Cy7 | Bio Legend，加利福尼亚州圣地亚哥 | 127623 | |
| 盐酸丁丙诺啡 | 英国伯克郡，Indivior UK Limited公司 | ||
| C57BL/6小鼠，雌性，10–12周龄 | 查尔斯河实验室，威尔明顿，马萨诸塞州，美国 | ||
| CaliBRITE APC-微球（6µm) | 美国新泽西州富兰克林湖，BD 生物科学公司 | 340487 | |
| 23 号 1 英寸针头 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | 300800 | |
| 26 号半英寸套管针 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | 303800 | |
| 70 微米细胞滤网 µm | BD 生物科学，美国新泽西州富兰克林湖 | 352350 | |
| I型胶原酶 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | 1148089 | |
| 脱氧核糖核酸酶 II | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | D8764 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS），无菌 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | D8662 | |
| 杜尔贝科’不含氯化钙和氯化镁的无菌磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | D8537 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | E7889 | |
| FACS 管，5 ml | Sarstedt, Nü德国马尔布雷希特 | 551579 | |
| 胎牛血清（FCS） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | F2442 | |
| 镊子 | Fine Science Tools，德国海德堡 | 11049-10 | |
| 异氟烷 | Baxter, Unterschleiß德国海姆 | ||
| 盐酸氯胺酮 | Serumwerk Bernburg，德国贝尔恩堡 | ||
| 大肠杆菌O111:B4脂多糖（LPS） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | L2630 | |
| LIVE/DEAD 可固定死细胞绿色试剂盒 | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | L23101 | |
| 纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体）™），克隆 2.4G2 | BD，美国新泽西州富兰克林湖 | 553141 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640，含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | R8758 | |
| 剪刀 | Fine Science Tools，德国海德堡 | 14060-09 | |
| 叠氮化钠（NaN3） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | S2002 | |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools，德国海德堡 | 15018-10 | |
| 组织镊 | Fine Science Tools，德国海德堡 | 11021-12 | |
| 管子 | Eppendorf，德国汉堡 | 30125150 | |
| 静脉导管，22 号 | B. Braun，美尔松根，德国 | 4268091B | |
| 盐酸赛拉嗪 | 德国贝尔恩堡血清厂，贝尔恩堡，德国 |
参考文献
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), Baltimore, Md. 7664-7672 (2008).
- D'Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12(2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), Augusta, Ga. 378-384 (2017).
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