本方案描述了使用 commercially available 的 DNA 凝胶染料对线粒体核样体进行特异性标记，通过超分辨率结构照明显微镜（SR-SIM）获取活细胞标记后的时间序列图像，以及对核样体运动的自动追踪。
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本文内容
摘要
摘要
线粒体核样体是由线粒体DNA分子及其结合蛋白形成的致密颗粒。线粒体DNA编码多种tRNA、rRNA以及若干重要的线粒体多肽。线粒体核样体可在动态的线粒体网络中进行分裂并分布，该网络会经历分裂/融合及其他形态变化。高分辨率活细胞荧光显微镜技术可直接用于表征核样体的位置与运动。在该技术中，通常通过荧光标记其蛋白质组分（即转录因子A（TFAM））来标记核样体。然而，该策略需要过表达荧光蛋白融合构建体，可能导致实验假象（已有TFAM相关报道），并且在许多情况下不可行。有机DNA结合染料则无此类缺点。但这类染料总是同时染色细胞核DNA和线粒体DNA，因此缺乏对线粒体核样体的特异性。基于此类染料的理化特性，我们选用了一种核酸凝胶染料（SYBR Gold），实现了在活细胞中优先标记线粒体核样体。该染料在结合DNA后具有极高的荧光亮度，使得后续可通过超分辨率结构光照明显微镜的时间序列图像，对线粒体核样体的运动进行定量分析。
引言
16.5 kbp 的环状 DNA 分子构成了线粒体的遗传物质，编码 22 种 tRNA、2 种 rRNA 以及线粒体氧化磷酸化复合物所需的 13 种多肽。与线粒体转录因子 A（TFAM）及其他多种蛋白质结合的线粒体 DNA 形成线粒体核样体1,2,3,4线粒体核样体在线粒体网络的各个组分之间移动并重新分布5,6 在其形态重塑过程中，会根据细胞周期阶段、应激状态及其他因素发生分裂或融合（详见 Pernas 等人的综述）7此外，线粒体核样体的运动与系统性红斑狼疮疾病相关8 可能在其他疾病中也发挥作用。荧光显微镜是一种用于细胞器活细胞研究的简便技术，但该技术的分辨率为 >200 nm，大于线粒体拟核的尺寸（约100 nm）9,10,11,
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方案
注意：此处提到的所有细胞系均在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、青霉素/链霉素和丙酮酸钠。在标记和成像当天，将所有培养基和补充物置于 5% CO2 培养箱中预热至 37 °C 以平衡温度。所有细胞培养操作（包括标记步骤）均在超净工作台内的无菌条件下进行。
1. 活细胞标记
- 标记操作前一天，在35 mm玻璃底培养皿（#1.5玻璃）中加入2 mL培养基，接种4 × 105个HeLa细胞。也可使用多孔板腔室载玻片，但体积需根据孔体积按比例调整。将细胞悬液稀释至约50,000个细胞/mL，并向35 mm培养皿中接种2 mL细胞悬液。
- 配制SYBR Gold（SG）商品化储存液的稀释液：1:5,000。在不含酚红的培养基中配制Mitotracker Deep Red（远红染料）或Mitotracker CMXRos Red（红色染料）（材料表；商品化储存液稀释1:2,000）。picoGreen的稀释比例与SG相同。
注意： 步骤1.2中所述溶液为2倍标记工作液。所有含荧光染料的溶液应尽可能避光保存。 - 用2 mL PBS轻柔洗涤贴壁细胞一次。向35 mm培养皿中加入1 mL不含酚红....
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结果
SG 活细胞标记的表征
首先，通过共聚焦显微镜观察了细胞在不同稀释倍数的染料孵育后 SG 在细胞内的分布情况。当使用高浓度 SG 或 PicoGreen 孵育时，两种染料主要标记细胞核，并在细胞质中呈现点状染色（图 1），这与已发表的另一种带正电荷的花青染料（即 PicoGreen）的结果相似15。然而，在使用 1:10,000 稀释度的 SG 孵育时，细胞核中仅出现微弱染色，而在细胞质中则观察到明亮斑点的染色模式（图 1）。相比之下，使用 1:10,000 稀释的 PicoGreen 染料孵育后，染色主要位于细胞核。在相同浓度下，SG 的信号明显强于 PicoGreen。实验结果表明，与其他类似的 DNA 结合染料相比，SG 更适用于线粒体 DNA 的成像。
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讨论
该实验方案包含几个关键步骤：为实现对线粒体DNA的优先标记，孵育过程中DNA结合染料的浓度应保持极低（例如，将常见的商品化原液稀释1:10,000），孵育时间应为30分钟，且绝不能超过1小时。必须使用SYBR Gold染料；其他DNA结合染料在低浓度标记时亮度不足，无法产生强信号。
本方案的局限性在于，染料会在透化步骤中从线粒体核样结构中被洗脱。因此，所述操作步骤不适用于常规的免疫荧光实验。在此情况下，可使用其他技术对固定细胞中的核样结构进行有效标记，例如针对DNA或线粒体转录因子（TFAM）的抗体标记法。
使用DNA结合有机染料对线粒体核样体进行直接标记，相较于荧光蛋白标记具有多项优势：可在不到<1 h的时间内对任何类型的细胞进行标记，无需考虑瞬时或稳定表达荧光蛋白融合构建体所需的时间或其他限制条件。此外，现有方案中报道，对TFAM进行常规荧光蛋白标记可能导致假象。而且，SG仅在线粒体膜电位完整时才能有效染色核样体，这可避免对生物学上无关的"状态不良"和死亡细胞进行成像，而基于荧光蛋白的染色方法无法避.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Asifa Akhtar和Angelika Rambold（均来自马克斯·普朗克免疫生物学与表观遗传学研究所）提供了HeLa细胞。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | 包含超分辨率结构光照明显微镜（SR-SIM）模块的多模态超分辨率显微镜 | |
| 高糖DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35 mm培养皿，玻璃底 | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8孔微孔载玻片，玻璃底 | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | 图像处理与可视化软件包 | |
| iXon 885 | Andor Technologies | 配备背照式传感器的EMCCD相机 | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | 带阵列探测器的激光扫描共聚焦显微镜 | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | 红色活细胞线粒体染料 |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | 远红活细胞线粒体染料 |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | 细胞通透性DNA染料 |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil物镜 | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | 细胞通透性DNA染料 |
| Zen Black 2012软件 | Carl Zeiss | 图像采集与处理软件 |
参考文献
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al.
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重印与许可
