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方法文章

线粒体核样体的特异性标记用于延时结构光照明显微镜观察

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DOI：

10.3791/60003

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2020年6月4日

 ,  , 
1Imaging Facility, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

本文内容

摘要

本方案描述了使用 commercially available 的 DNA 凝胶染料对线粒体核样体进行特异性标记，通过超分辨率结构照明显微镜（SR-SIM）获取活细胞标记后的时间序列图像，以及对核样体运动的自动追踪。

摘要

线粒体核样体是由线粒体DNA分子及其结合蛋白形成的致密颗粒。线粒体DNA编码多种tRNA、rRNA以及若干重要的线粒体多肽。线粒体核样体可在动态的线粒体网络中进行分裂并分布，该网络会经历分裂/融合及其他形态变化。高分辨率活细胞荧光显微镜技术可直接用于表征核样体的位置与运动。在该技术中，通常通过荧光标记其蛋白质组分（即转录因子A（TFAM））来标记核样体。然而，该策略需要过表达荧光蛋白融合构建体，可能导致实验假象（已有TFAM相关报道），并且在许多情况下不可行。有机DNA结合染料则无此类缺点。但这类染料总是同时染色细胞核DNA和线粒体DNA，因此缺乏对线粒体核样体的特异性。基于此类染料的理化特性，我们选用了一种核酸凝胶染料（SYBR Gold），实现了在活细胞中优先标记线粒体核样体。该染料在结合DNA后具有极高的荧光亮度，使得后续可通过超分辨率结构光照明显微镜的时间序列图像，对线粒体核样体的运动进行定量分析。

引言

16.5 kbp 的环状 DNA 分子构成了线粒体的遗传物质，编码 22 种 tRNA、2 种 rRNA 以及线粒体氧化磷酸化复合物所需的 13 种多肽。与线粒体转录因子 A（TFAM）及其他多种蛋白质结合的线粒体 DNA 形成线粒体核样体1,2,3,4线粒体核样体在线粒体网络的各个组分之间移动并重新分布5,6 在其形态重塑过程中，会根据细胞周期阶段、应激状态及其他因素发生分裂或融合（详见 Pernas 等人的综述）7此外，线粒体核样体的运动与系统性红斑狼疮疾病相关8 可能在其他疾病中也发挥作用。荧光显微镜是一种用于细胞器活细胞研究的简便技术，但该技术的分辨率为 >200 nm，大于线粒体拟核的尺寸（约100 nm）9,10,11,12）。这一限制已通过所谓的 "超分辨率" 技术，如受激发射损耗（STED）和单分子定位显微镜（SMLM）13,14到目前为止，线粒体核样体及其他DNA已在活细胞中通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）成像。15在活细胞中，通过STED观察到与mtDNA位置相关的精细亚线粒体结构16然而，这些超分辨率技术需要高强度的照明，这会对活细胞产生光毒性效应17因此，对线粒体核样体进行超越衍射极限分辨率的活细胞成像具有挑战性。为解决这一问题，我们采用了超分辨率结构光照明显微镜（SR-SIM）18SIM所需的照明功率剂量远低于STED和SMLM19此外，与STED和SMLM技术相比，SIM能够实现简便的多色三维（3D）成像，且无需荧光染料具备特殊的光物理特性，也无需特定的成像缓冲液成分19.

在活细胞中标记线粒体核样体的传统策略是使用荧光标记的线粒体核样体蛋白，例如TFAM20。然而，在许多情况下，该策略并不适用。此外，荧光蛋白标记的TFAM过表达会产生严重的假象21。与基于荧光蛋白（FP）的策略相比，使用有机染料对DNA进行标记具有优势。有机染料不受FP标记相关限制的影响：它们可用于任何类型的细胞或组织，并可在实验的任意时间点施用。已有研究报道使用多种DNA结合染料对活细胞中的线粒体核样体进行成像，包括DAPI22、SYBR Green23、Vybrant DyeCycle24和picoGreen15,25,26。然而，大多数DNA结合染料用于核样体标记的一个显著缺点是它们会染色细胞内的全部DNA。因此，将染料特异性地靶向线粒体DNA具有重要意义。为实现这一目标，必须谨慎选择具有合适理化性质的染料。已知具有离域正电荷的亲脂性染料（如罗丹明123）会在线粒体膜电位保持负值的活线粒体中富集。此外，理想的线粒体核样体特异性标记染料应能以高亲和力结合DNA，并在结合DNA后发出明亮的荧光。基于这些要求，某些菁类染料（如picoGreen）具有应用前景，但这些染料在染色线粒体DNA的同时也会强烈染色细胞核DNA15,25,26。本实验方案描述了使用另一种菁类染料SYBR Gold（SG）在活细胞中特异性标记线粒体核样体，并通过时间序列超分辨率SIM视频追踪核样体动态的方法。此外，经SG染色的活细胞可使用任何配备488 nm光源、适用于活细胞成像的倒置荧光显微镜（如共聚焦、转盘式、落射荧光等）进行观察。

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方案

注意：此处提到的所有细胞系均在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、青霉素/链霉素和丙酮酸钠。在标记和成像当天，将所有培养基和补充物置于 5% CO2 培养箱中预热至 37 °C 以平衡温度。所有细胞培养操作（包括标记步骤）均在超净工作台内的无菌条件下进行。

1. 活细胞标记

  1. 标记操作前一天，在35 mm玻璃底培养皿（#1.5玻璃）中加入2 mL培养基，接种4 × 105个HeLa细胞。也可使用多孔板腔室载玻片，但体积需根据孔体积按比例调整。将细胞悬液稀释至约50,000个细胞/mL，并向35 mm培养皿中接种2 mL细胞悬液。
  2. 配制SYBR Gold（SG）商品化储存液的稀释液：1:5,000。在不含酚红的培养基中配制Mitotracker Deep Red（远红染料）或Mitotracker CMXRos Red（红色染料）（材料表；商品化储存液稀释1:2,000）。picoGreen的稀释比例与SG相同。
    注意： 步骤1.2中所述溶液为2倍标记工作液。所有含荧光染料的溶液应尽可能避光保存。
  3. 用2 mL PBS轻柔洗涤贴壁细胞一次。向35 mm培养皿中加入1 mL不含酚红的培养基。对于8孔腔室载玻片，加入体积为总孔容量一半的培养基（例如，若总孔容量为250 µL，则加入125 µL）。
  4. 向35 mm培养皿中加入1 mL步骤1.2配制的2倍标记溶液。对于8孔腔室载玻片，加入体积为总孔容量一半的标记溶液。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。
    注意： 不得将细胞与SG标记溶液孵育超过1小时，否则会导致细胞核DNA被标记。
  5. 小心吸除含荧光染料的培养基，并用PBS洗涤细胞一次。
  6. 加入不含酚红的细胞培养基，将细胞置于37 °C、CO2培养箱中避光保存，直至成像。
  7. 使用配备孵育装置的SR-SIM显微镜对活细胞进行成像（见下文）。

2. 超分辨结构光照明显微成像采集

  1. 在显微镜载物台上安装台式培养箱。设定所需的温度和CO2浓度（例如，哺乳动物细胞通常为37 °C和5%），并在开始图像采集前至少预热1小时。
  2. 开启SR-SIM显微镜的所有组件（包括激光器），并让其预热至少1小时。
  3. 选择显微镜制造商推荐用于SR-SIM的高倍率、高数值孔径（NA）浸油物镜（例如，100倍，1.46 NA油镜）。
  4. 将带有标记细胞的腔室载玻片或35 mm培养皿（来自步骤1.6）安装到恒温显微镜载物台上。
  5. 使用目镜定位样品中的目标区域。为获得最佳的SR-SIM成像质量，应选择牢固贴附在玻璃表面的细胞。
  6. 使用背照式高端电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）相机采集SR-SIM图像。
  7. 通过图像采集软件，设置适用于所用相机的高EM增益（例如，300）。
  8. 在进行核质体动态追踪的时间序列采集前，先对同一视野采集双色SR-SIM图像：一个通道用于线粒体染色，另一个通道用于SG信号。根据所用线粒体染料设置第一通道参数（例如，对于远红染料，激发波长设为633 nm或更长，发射滤光片使用650 nm长通滤光片）。对于SG信号，激发波长设为488 nm，发射滤光片使用500–550 nm带通滤光片。
  9. 通过软件将488 nm和远红染料激光线的激光功率设为尽可能低的水平。
    注意：典型设置是通过声光可调滤波器（AOTF）将激光输出功率调节至1%。
  10. 如果SIM显微镜只能顺序采集通道（单相机系统），则关闭远红染料检测通道。
  11. 通过取消勾选软件中的Z-stack选项，关闭Z轴层扫功能，仅设置单个焦平面的采集。
  12. 将EM-CCD相机的曝光时间设为最短可能值。
  13. 将光栅旋转次数设为三次，而非五次。
  14. 为提高帧率，在软件的Acquisition选项卡中，设置相机仅读取传感器中央区域的数据，而不是"Full Chip"全芯片模式。
    注意：例如，将读取区域从完整的1,000 × 1,000像素传感器缩小至仅256 × 256像素，可使相机曝光时间从50 ms减少至13.4 ms，总帧时间从1.8 s减少至1.2 s。若仅读取传感器中央部分，则对于SR-SIM常用的63倍或100倍物镜而言，视场将非常小。较短的曝光时间会降低图像的信噪比。
  15. 优化激光功率和相机曝光时间：在多个激光功率水平（例如0.5%、1%、1.5%、2%）和多个曝光时间（例如13.4 ms、25 ms、50 ms）下，采集标记细胞的SR-SIM二维（2D）图像。
  16. 处理原始SIM数据集（参见步骤3.1）。
  17. 选择能够产生清晰线粒体内亮点（即核质体）且SIM处理后无明显伪影的激光功率和相机曝光时间组合。检查线粒体外区域的背景信号（例如，488 nm固态激光器1%功率，EM-CCD相机25 ms曝光）。
  18. 使用在步骤2.15–2.17中优化后的参数设置，开始时间序列图像的采集。

3. 数据处理与分析

  1. 使用合适软件的结构照明显微成像模块（材料表）处理原始SIM数据集：在SIM处理参数中选择自动复选框。若需批量自动处理多个文件，请使用批量处理工具，取消勾选对批处理使用当前设置，点击运行批处理，然后选择多个文件进行SIM处理。
  2. 使用Imaris文件转换软件（即与Imaris软件版本相对应的版本）将经过SIM处理的时间序列数据集转换为ims格式。
  3. 在已获得Lineage（或Track）模块许可的软件（版本8.4.1或更高版本）中打开已转换的文件。
  4. 点击添加新斑点图标，启动"斑点"创建向导，系统将启动创建向导。
  5. 选择该向导中的创建选项卡。
  6. 在向导的第一步中，点击追踪斑点（随时间），然后进入向导的第二步。
  7. 将估计的XY直径设置为0.1–0.15 µm，点击背景减除，然后进入第三步。
  8. 通过拖动直方图中的垂直线，调整"质量"滤波器中的阈值，使大多数类核体被检测为"斑点"，而伪影不被检测（即检测到的斑点以叠加在图像上的球体形式标出）。检查每一帧是否符合此情况，必要时重新调整阈值。随后进入向导的第四步和第五步。
  9. 选择自回归运动算法。将最大距离设为0.5 µm，将最大间隙大小设为0。
  10. 查看时间序列中的每一帧，检查是否存在错误的轨迹或轨迹间出现间隙（向导根据当前设置生成的轨迹会立即以叠加在图像上的线条形式标出）。如有必要，调整"最大距离"。进入向导的第六步，选择轨迹持续时间滤波器，并将阈值设为3–5秒。
  11. 如果当前检测到的斑点或轨迹并非最优，可使用向导窗口底部的导航按钮返回之前的步骤，以微调斑点或轨迹创建的任何参数。
  12. 当经过微调的参数使软件能够正确检测所有斑点并构建轨迹后，点击向导中的绿色箭头导航按钮，确认轨迹的创建。
  13. 点击统计图标窗口，提取轨迹的统计数据。选择所需的统计参数（在统计下的详细信息和平均值选项卡），然后点击软盘图标，将数值导出为csv文件，用于定量分析和可视化。
    注意：最大轨迹速度、平均轨迹速度、轨迹长度和轨迹位移是重要参数的示例。
  14. 如果图像数据集需要展示或发表，可使用快照或动画工具创建代表延时序列的静态图像和/或视频文件，可选择性地叠加轨迹。

4. 共聚焦图像采集

  1. 在显微镜载物台上安装台式培养箱，设定所需的温度和CO2浓度（例如，哺乳动物细胞为37 °C和5%），并在开始图像采集前至少预热1小时。
  2. 开启共聚焦激光扫描显微镜的所有组件，包括激光器，并使其预热至少1小时。
  3. 根据奈奎斯特采样标准，选择合适的中高倍物镜和空间采样参数。
  4. 对于SG通道，设定激发波长为488 nm，检测范围为500–550 nm；对于线粒体染料通道，若使用红色染料，则设定激发波长为561 nm，发射波长范围为570–630 nm；若使用远红染料，则设定激发波长为633 nm，发射波长大于>650 nm。
  5. 设置尽可能低的激光功率（通常为1%或更低），以确保在PMT探测器增益为700 mV时仍能获取信号。
  6. 采集细胞的双色共聚焦图像，其中线粒体核样结构在"SG通道"中检测，线粒体则在"红色"或"远红"通道中检测。

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结果

SG 活细胞标记的表征
首先，通过共聚焦显微镜观察了细胞在不同稀释倍数的染料孵育后 SG 在细胞内的分布情况。当使用高浓度 SG 或 PicoGreen 孵育时，两种染料主要标记细胞核，并在细胞质中呈现点状染色（图 1），这与已发表的另一种带正电荷的花青染料（即 PicoGreen）的结果相似15。然而，在使用 1:10,000 稀释度的 SG 孵育时，细胞核中仅出现微弱染色，而在细胞质中则观察到明亮斑点的染色模式（图 1）。相比之下，使用 1:10,000 稀释的 PicoGreen 染料孵育后，染色主要位于细胞核。在相同浓度下，SG 的信号明显强于 PicoGreen。实验结果表明，与其他类似的 DNA 结合染料相比，SG 更适用于线粒体 DNA 的成像。

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讨论

该实验方案包含几个关键步骤：为实现对线粒体DNA的优先标记，孵育过程中DNA结合染料的浓度应保持极低（例如，将常见的商品化原液稀释1:10,000），孵育时间应为30分钟，且绝不能超过1小时。必须使用SYBR Gold染料；其他DNA结合染料在低浓度标记时亮度不足，无法产生强信号。

本方案的局限性在于，染料会在透化步骤中从线粒体核样结构中被洗脱。因此，所述操作步骤不适用于常规的免疫荧光实验。在此情况下，可使用其他技术对固定细胞中的核样结构进行有效标记，例如针对DNA或线粒体转录因子（TFAM）的抗体标记法。

使用DNA结合有机染料对线粒体核样体进行直接标记，相较于荧光蛋白标记具有多项优势：可在不到<1 h的时间内对任何类型的细胞进行标记，无需考虑瞬时或稳定表达荧光蛋白融合构建体所需的时间或其他限制条件。此外，现有方案中报道，对TFAM进行常规荧光蛋白标记可能导致假象。而且，SG仅在线粒体膜电位完整时才能有效染色核样体，这可避免对生物学上无关的"状态不良"和死亡细胞进行成像，而基于荧光蛋白的染色方法无法避...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Asifa Akhtar和Angelika Rambold（均来自马克斯·普朗克免疫生物学与表观遗传学研究所）提供了HeLa细胞。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Elyra PS1Carl Zeiss包含超分辨率结构光照明显微镜（SR-SIM）模块的多模态超分辨率显微镜
高糖DMEMGIBCO/ThermoFisher31966021
ibidi 35 mm培养皿，玻璃底Ibidi Gmbh81158
ibidi 8孔微孔载玻片，玻璃底Ibidi Gmbh80827
Imaris 8.4.1Bitplane/Oxford Instruments图像处理与可视化软件包
iXon 885Andor Technologies配备背照式传感器的EMCCD相机
LSM880 AiryscanCarl Zeiss带阵列探测器的激光扫描共聚焦显微镜
Mitotracker CMXRos RedThermoFischerM7512红色活细胞线粒体染料
Mitotracker Deep Red FMThermoFischerM22426远红活细胞线粒体染料
picoGreenThermoFischerP7581细胞通透性DNA染料
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil物镜Carl Zeiss
SYBR GoldThermoFischerS11494细胞通透性DNA染料
Zen Black 2012软件Carl Zeiss图像采集与处理软件

参考文献

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