轻度创伤性脑损伤大鼠海马区的高级扩散成像

摘要

本实验的总体目标是获取轻度创伤性脑损伤大鼠海马体的定量微结构信息。该目标通过采用先进的扩散加权磁共振成像方案，并对参数化扩散图进行基于感兴趣区域的分析来实现。

摘要

轻度创伤性脑损伤（mTBI）是最常见的获得性脑损伤类型。由于创伤性脑损伤患者的临床表现具有极大的变异性与异质性（如年龄、性别、创伤类型及其他可能的病理状况等），动物模型在揭示临床研究中难以克服的限制性因素方面发挥着关键作用。动物模型可提供标准化且可控的环境，用于研究创伤性脑损伤（TBI）后损伤与修复的生物学机制。然而，并非所有动物模型均能有效模拟mTBI的弥散性和细微性特点。例如，常用的控制性皮层冲击（CCI）和侧向液体冲击损伤（LFPI）模型需通过开颅手术暴露脑组织，从而诱发广泛的局灶性损伤，而这类损伤在mTBI中并不常见。因此，这些实验模型不适合用于模拟mTBI。为此，应采用更合适的模型来研究mTBI。Marmarou大鼠落锤模型可诱导出与经历轻度创伤的患者相似的微结构改变和认知功能障碍，因此本实验方案选择该模型。常规的计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）在轻度损伤后通常无法显示明显损伤，因为mTBI常仅引起细微且弥散性的损伤。而通过弥散加权MRI，可以研究脑组织的微结构特性，从而更深入地了解轻度创伤后的微观变化。因此，本研究的目标是在造成轻度且弥散性脑损伤后，获取特定感兴趣区域（即海马）的定量信息，以追踪疾病进展。

引言

近年来，创伤性脑损伤（TBI）受到越来越多的关注，因为人们逐渐认识到这类脑损伤可能导致终身的认知、身体、情绪和社会功能后果¹。尽管公众意识不断提高，轻度创伤性脑损伤（mTBI，即脑震荡）仍经常被漏报和未确诊。mTBI 被称为“隐性流行病”，有 mTBI 病史的个体出现物质滥用或精神健康问题的比例更高²。由于此类损伤具有弥散性和隐匿性的特点，常常在常规的计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）中不可见，导致每年有大量 mTBI 患者未能得到诊断。由于缺乏脑损伤的影像学证据，研究人员已开发出更先进的成像技术，例如弥散 MRI，其对微观结构变化具有更高的敏感性³。

弥散磁共振成像（diffusion MRI）能够实现对组织微结构的活体映射，该磁共振技术已在创伤性脑损伤（TBI）研究中得到广泛应用^4,5,6。通过弥散张量可计算出分数各向异性（fractional anisotropy, FA）和平均弥散率（mean diffusivity, MD），用于量化损伤后微结构组织的改变。近期针对轻度创伤性脑损伤（mTBI）患者的综述报道，损伤后FA升高、MD降....

方案

本方案已获得根特大学动物伦理委员会批准（ECD 15/44Aanv），所有实验均按照欧洲委员会指南（Directive 2010/63/EU）进行。

1. 动物准备与头盔固定

1. 称重一只雌性Wistar H大鼠（± 250 g 或 12 周龄）并在充满异氟烷（5%）与 O₂ 混合气体的小型诱导室中进行麻醉₂ 至少 1 分钟。
2. 在大鼠颈部皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡，然后将其放回饲养笼中，并至少给予30分钟的预先镇痛时间以发挥药效。
   注意：在等待的30分钟内，可准备手术区域。
3. 将加热垫设置在37℃ °手术区域下方的 C。 将已灭菌的手术器械放置于经70%乙醇消毒的手术区域。
4. 将大鼠放回诱导室中，麻醉至对足 paw 或尾部夹捏无反应。
5. 将大鼠置于手术区域，并在尾侧静脉插入导管。 接下来，剃除大鼠头部的毛发，清除多余毛发，并用氯己定对头皮及手术区域其余部分进行消毒。 
6. 注射 100 μ头皮局部注射 2% 利多卡因 L。
7. 使用11号手术刀做正中切口以暴露颅骨，并用小剪刀去除多余的膜组织。使用眼睑拉钩（最大张开距离1 cm）牵开皮肤。  此外，用无菌棉签轻轻擦拭颅骨表面，直至完全去除骨膜。
8. 在颅骨上滴一....

结果

在本研究中，所有TBI大鼠（n = 10）均在撞击后存活，并在脱离麻醉后15分钟内恢复意识²³。CT影像显示无颅骨骨折证据，T2加权图像在创伤后1天未显示挫伤部位有出血、脑室扩大或水肿形成等异常表现（图5）。因此，基于对解剖图像的肉眼观察，未发现明显的局灶性病灶，证实了该损伤具有弥散性和轻度的特征。

通过将T2图像叠加到彩色编码的FA图上，检查T2图像与扩散数据集之间配准（非刚性）步骤（步骤4.4）的质量图6）。随后，计算FA、MD、AD和RD参数图（图1) 并导入 Amide 软件。根据 FA 图，在包含海马结构的区域绘制了感兴趣区（ROI）图4）。扩散指标的统计值通过计算感兴趣区域内所有体素的平均值获得，并将各DTI指标的平均值导出用于进一步分析。另一种对扩散数据的质量控制方法是检查DTI指标中.......

讨论

由于轻度创伤性脑损伤（mTBI）通常是由弥散性且细微的损伤所致，其在CT和常规MRI扫描中往往不显示异常，因此对轻度创伤后微结构损伤的评估仍是一项挑战。因此，需要更先进的成像技术来可视化创伤的全部范围。在过去的十年中，扩散磁共振成像在TBI研究中的应用受到越来越多的关注，其中最常用的是扩散张量成像⁵。DTI模型的一个局限性在于其假设了高斯扩散过程，而这一假设对于脑微结构（由轴突和细胞构成的复杂网络，其膜结构作为扩散屏障）而言并不精确，导致DTI指标对潜在生物学微结构缺乏特异性²⁴。扩散峰度成像（DKI）是DTI模型的扩展，旨在表征非高斯扩散的程度¹⁷，这可能提供有关组织异质性或复杂性的额外信息。

然而，DTI和DKI模型的一个缺点是，它们仅是对扩散信号的表征，用于描述水分子概率性位移的分布特征，但并不特异于微观结构。⁶另一方面，基于峰度张量的白质纤维束完整性模型是一种结合了微观结构成像技术的方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>创伤诱导
0.9% NaCl 生理溶液	B Braun	394496
黄铜砝码 450g	定制	定制	直径18 mm，高度210 mm
导管	Terumo	Versatus-W	26G
ethilon II	Ethicon	EH7824	FS-3，4-0，3/8，16 mm
Matrass	泡沫定型	E型
有机玻璃管	ISPA 塑料	416564	M1 PMMA XT GOO 管 25×19 mm（内径 19 mm，最小长度 1.50 m）
临床前CT扫描仪	Molecubes	X-cube
钢盔	定制	定制	直径10 mm，厚度3 mm
Vetbond 组织粘合剂	3M	1469SB
Vetergesic（布托啡诺）	EcuPhar	VETERG20	0.05 mk/kg
2% 利多卡因凝胶	阿斯利康	2% 利多卡因	凝胶
利多卡因（Xylocaine，2%）	Aspen/AstraZeneca	2% 利多卡因凝胶	100 μ注射
<强>扩散 MRI
临床前 MRI 采集软件	Bruker Biospin MRI GmbH	Z400_PV51_CENTOS55	ParaVision 5.1 MRI 软件
临床前 MRI 扫描仪	Bruker Biospin MRI GmbH	PharmaScan 70/16	7T MRI 扫描仪
四极体积线圈	Bruker Biospin MRI GmbH	RF RES 300 1H 075/040 QSN TR	型号：1P T13161C3
小型动物生理监测仪	快速生物医学	EKGHR02-0571-043C01	呼吸监测单元
水浴加热装置	赛默飞世尔科技	Haake S 5P	型号：1523051
<强>麻醉
麻醉移动装置	兽医技术		BDO - Medipass，伊江登
异氟烷：Isoflo	硕腾	B506
氧气发生器	兽医技术	7F-3	BDO - Medipass，伊江登
<强>扩散成像处理
酰胺	http://amide.sourceforge.net	版本 1.0.5	医学影像数据检查员工具箱（Loening AM，Gambhir SS， " AMIDE：一种用于多模态医学图像分析的免费软件工具"，分子影像学，2(3):131-137，2003）
ExploreDTI	http://www.exploredti.com	版本 4.8.6	用于扩散加权磁共振图像（预）处理与分析的工具箱（Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, Jones DK. ExploreDTI：一种用于处理、分析和可视化扩散磁共振数据的图形化工具箱。载于：国际磁共振医学学会第17届年会，摘要号3537，美国夏威夷，2009年）
MRtrix3	http://www.mrtrix.org	版本 3.0_RC3-86-g4b523b41	弥散加权磁共振图像预处理与分析工具箱