我们提出了一种基于环状RT-PCR的策略，结合了环状RT-PCR、定量RT-PCR、RNA 5'多磷酸酶处理以及Northern印迹技术。该方案包含一个标准化步骤，以最大限度减少不稳定的5'三磷酸末端的影响，适用于区分并定位在玉米线粒体中稳定积累的初级转录本和加工后转录本。
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摘要
摘要
在植物线粒体中，一些稳态转录本的5'端带有来自转录起始的三磷酸基团（初级转录本），而另一些则含有转录后生成的5'单磷酸基团（加工型转录本）。为了区分这两类转录本，已发展出多种策略，其中大多数依赖于5'三磷酸的存在与否。然而，初级5'末端的三磷酸基团不稳定，这会阻碍对两类转录本的清晰区分。为了系统性地区分并绘制在玉米线粒体中稳定积累的初级转录本和加工型转录本，我们开发了一种基于环形反转录PCR（cRT-PCR）的策略，结合了cRT-PCR、RNA 5'多磷酸酶处理、定量反转录PCR（RT-qPCR）以及Northern印迹技术。作为改进，该策略引入了RNA标准化步骤，以最大限度减少不稳定5'三磷酸的影响。
在本实验方案中，富集的线粒体 RNA 首先经 RNA 5' 多磷酸酶预处理，将 5' 三磷酸转化为单磷酸。经过环化和反转录后，分别来自经 5' 多磷酸酶处理和未处理 RNA 的两种 cDNA 通过玉米 26S 成熟 rRNA 进行归一化，该 rRNA 具有已加工的 5' 末端，对 5' 多磷酸酶不敏感。归一化后，通过比较处理与未处理 RNA 获得的 cRT-PCR 和 RT-qPCR 产物，区分初级转录本与加工后的转录本。转录本末端通过克隆和测序 cRT-PCR 产物确定，并进一步通过 Northern 印迹验证。
通过使用该策略，已确定了玉米线粒体中的大多数稳态转录本。由于某些线粒体基因的转录模式较为复杂，尽管在Northern印迹中检测到了一些稳态转录本，但这些转录本尚未被区分和/或定位。目前尚不确定该策略是否适用于区分和定位其他植物线粒体或质体中的稳态转录本。
引言
在植物线粒体中，许多成熟和前体RNA以多种异构体形式积累，根据其5'端的差异，稳态转录本可分为两类1,2,3,4。初级转录本具有5'三磷酸末端，来源于转录起始；而加工后的转录本则具有由转录后加工产生的5'单磷酸末端。区分并定位这两类转录本对于揭示转录及转录本末端成熟过程的分子机制至关重要。
为了区分植物线粒体中的初级转录本和加工后转录本，已发展出四种主要策略。第一种策略是用烟草酸焦磷酸酶（tobacco acid pyrophosphatase, TAP）预处理线粒体RNA，该酶可将5'三磷酸转化为单磷酸，从而使初级转录本能够被RNA连接酶环化。随后通过cDNA末端快速扩增（RACE）或环状RT-PCR（cRT-PCR）比较TAP处理与未处理RNA样品的转录本丰度2,3,4。第二种策略是利用依赖于5'磷酸的外切核酸酶（terminator 5'-phosphate-dependant exonuclease, TEX）从线粒体RNA中去除....
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方案
1. 引物设计
- 根据引物设计的一般规则，使用PCR引物设计软件（材料表）设计用于逆转录（RT）的基因特异性引物17。
注意：逆转录引物对目标转录本具有高度特异性，通常锚定在编码序列的5’端（成熟mRNA和前体RNA），或位于预期5’端下游约500–600 nt处（如18S和26S rRNA）。 - 设计成对的反向引物，用于通过cRT-PCR扩增环化转录本。
注意：成对的反向引物应位于环化转录本的5’-3’连接区域两侧，其具体位置因分析的目标转录本而异（图S1）。某些转录本具有较长的非翻译区（UTR）；例如，nad2-1的5’ UTR以及rps4-1的3’ UTR分别为1,985 nt和1,826/1,834 nt1。若两个引物均锚定在编码区，则难以有效扩增目标转录本。相反，某些UTR较短；例如，nad2-1和nad4-1的3’ UTR分别为34/35 nt和29–31 nt1。若成对引物距离编码序列过远，则PCR扩增将失败。通常为每个目标转录本设计两对反向引物，而对于转录模式复杂和/或UTR非常长的转录本，可能需要设计多对引物以完成定位。
....
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结果
线粒体RNA环化效率的估算
在之前的一项研究中，总RNA和线粒体RNA均被用于通过cRT-PCR方法绘制线粒体转录本末端图谱 拟南芥 (拟南芥），两种RNA的比对结果相似12最初，我们也曾使用总RNA进行玉米线粒体转录本末端的cRT-PCR定位。经过多次尝试后，我们发现目标转录本难以检测。作为改进，我们从玉米发育中的籽粒中富集了线粒体RNA，从而使目标转录本在环化后仅需一轮PCR即可实现扩增。
为了阐明富集后目标转录本易于扩增的原因，我们通过针对代表性线粒体基因nad5进行逆转录PCR（RT-PCR），估算了RNA环化效率（图3和
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讨论
在之前的一项研究中，来自细胞悬浮培养的总RNA和线粒体RNA 拟南芥 采用cRT-PCR方法对线粒体转录本末端进行定位，获得了相似的结果12然而，在许多其他研究中，仅使用富集的线粒体RNA来绘制线粒体转录本的末端1,2,3,9我们发现，线粒体RNA的富集是玉米线粒体转录本末端cRT-PCR定位中的关键步骤。经过该富集处理后，环化线粒体RNA的比例从0.3%–3.7%显著提高至约30%（图3 和 图S2），从而使得在一轮PCR中扩增环化的目标转录本成为可能。
通过玉米nad1和nad5的RT-PCR分析估算了线粒.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（项目编号：31600250，Y.Z.）、广州市科技计划项目（项目编号：201804020015，H.N.）和中国农业研究体系（项目编号：CARS-04-PS09，H.N.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | Aladdin, 中国 | A112880 | 用于配制 1x TAE 缓冲液 |
| Applied Biosystems 2720 热循环仪 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 4359659 | 用于 PCR 扩增的热循环仪 |
| 抗坏血酸 | Sigma-aldrich, 美国 | V900134 | 用于配制提取缓冲液 |
| Biowest 琼脂糖 | Biowest, 西班牙 | 9012-36-6 | 用于分离 PCR 产物和 RNA |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-aldrich, 美国 | A1933 | 用于配制提取缓冲液 |
| 溴酚蓝 | Sigma-aldrich, 美国 | B8026 | 用于配制琼脂糖凝胶电泳和 Northern 印迹的上样缓冲液 |
| DEPC | Sigma-aldrich, 美国 | V900882 | 灭活 RNase |
| DIG Northern 起始试剂盒 | Roche, 美国 | 12039672910 | 用于 DIG-RNA 标记和 Northern 印迹。该试剂盒包含使用 DIG 和 T7 RNA 聚合酶进行 RNA 转录标记、杂交及化学发光检测所需的试剂。 |
| EDTA | Sigma-aldrich, 美国 | V900106 | 用于配制提取缓冲液和 1x TAE 缓冲液 |
| EGTA | Sigma-aldrich, 美国 | E3889 | 用于配制洗涤缓冲液 |
| 凝胶成像系统 | Bio-Rad, 美国 | Gel Doc XR+ | 用于成像琼脂糖凝胶 |
| 甘油 | Sigma-aldrich, 美国 | G5516 | 用于配制琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液 |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio, 中国 | G8142 | 用于 DNA 染色 |
| Hybond-N+ 尼龙膜 | Amersham Biosciences, 美国 | RPN119 | 用于 Northern 印迹 |
| Image Lab | Bio-Rad, 美国 | Image Lab 3.0 | 用于凝胶成像及比较 PCR 产物的丰度 |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, 美国 | V900041 | 用于配制提取缓冲液 |
| KOH | Aladdin, 中国 | P112284 | 用于配制提取缓冲液 |
| L-半胱氨酸 | Sigma-aldrich, 美国 | V900399 | 用于配制提取缓冲液 |
| Millex | Millipore, 美国 | SLHP033RB | 通过过滤对提取缓冲液和洗涤缓冲液进行无菌处理 |
| Miracloth | Calbiochem, 美国 | 475855-1R | 用于过滤研磨后的胚乳组织 |
| MOPS | Sigma-aldrich, 美国 | V900306 | 用于配制 Northern 印迹的电泳运行缓冲液 |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 2000C | 用于 RNA 浓度和纯度测定 |
| NaOH | Sigma-aldrich, 美国 | V900797 | 用于配制洗涤缓冲液 |
| pEASY-Blunt 简单克隆载体 | TransGen Biotech, 中国 | CB111 | 用于凝胶回收条带的克隆。该载体在插入位点上游数个碱基处含有 T7 启动子。 |
| Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶 | Vazyme, 中国 | P505 | 用于 PCR 扩增的 DNA 聚合酶 |
| 聚乙烯吡咯烷酮 40 | Sigma-aldrich, 美国 | V900008 | 用于配制提取缓冲液 |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, 美国 | Primer Premier 6.24 | 用于设计逆转录和 PCR 扩增引物 |
| PrimeScript II 逆转录酶 | Takara, 日本 | 2690 | 用于合成第一条 cDNA 链 |
| PureLink RNA Mini 试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 12183025 | 用于 RNA 纯化 |
| RNA 5' 多磷酸酶 | Epicentre, 美国 | RP8092H | 将 5' 三磷酸转化为单磷酸 |
| RNase 抑制剂 | New England Biolabs, 英国 | M0314 | RNA 自连接反应和 5' 多磷酸酶处理反应的组分，用于抑制 RNase 活性。 |
| 乙酸钠 | Sigma-aldrich, 美国 | V900212 | 用于配制 Northern 印迹的电泳运行缓冲液 |
| 氯化钠 | Sigma-aldrich, 美国 | V900058 | 用于配制 20x SSC |
| SsoFast evaGreen supermixes | Bio-Rad, 美国 | 1725202 | 用于 RT-qPCR |
| T4 RNA 连接酶 1 | New England Biolabs, 英国 | M0437 | 用于 RNA 环化 |
| 焦磷酸四钠 | Sigma-aldrich, 美国 | 221368 | 用于配制提取缓冲液 |
| TIANgel 中量纯化试剂盒 | Tiangen Biotech, 中国 | DP209 | 用于从琼脂糖凝胶中纯化 DNA 片段 |
| Tris | Aladdin, 中国 | T110601 | 用于配制 1x TAE 缓冲液 |
| TRIzol 试剂 | Invitrogen, 美国 | 15596026 | 用于提取线粒体 RNA。 |
| 通用 DNA 纯化试剂盒 | Tiangen Biotech, 中国 | DP214 | 用于从限制性内切酶消化反应中回收线性化质粒 |
| 二甲苯青 FF | Sigma-aldrich, 美国 | X4126 | 用于配制琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液 |
参考文献
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L.
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重印与许可
