我们提出了一种基于环状RT-PCR的策略，结合了环状RT-PCR、定量RT-PCR、RNA 5'多磷酸酶处理以及Northern印迹技术。该方案包含一个标准化步骤，以最大限度减少不稳定的5'三磷酸末端的影响，适用于区分并定位在玉米线粒体中稳定积累的初级转录本和加工后转录本。
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摘要
摘要
在植物线粒体中，一些稳态转录本的5'端带有来自转录起始的三磷酸基团（初级转录本），而另一些则含有转录后生成的5'单磷酸基团（加工型转录本）。为了区分这两类转录本，已发展出多种策略，其中大多数依赖于5'三磷酸的存在与否。然而，初级5'末端的三磷酸基团不稳定，这会阻碍对两类转录本的清晰区分。为了系统性地区分并绘制在玉米线粒体中稳定积累的初级转录本和加工型转录本，我们开发了一种基于环形反转录PCR（cRT-PCR）的策略，结合了cRT-PCR、RNA 5'多磷酸酶处理、定量反转录PCR（RT-qPCR）以及Northern印迹技术。作为改进，该策略引入了RNA标准化步骤，以最大限度减少不稳定5'三磷酸的影响。
在本实验方案中，富集的线粒体 RNA 首先经 RNA 5' 多磷酸酶预处理，将 5' 三磷酸转化为单磷酸。经过环化和反转录后，分别来自经 5' 多磷酸酶处理和未处理 RNA 的两种 cDNA 通过玉米 26S 成熟 rRNA 进行归一化，该 rRNA 具有已加工的 5' 末端，对 5' 多磷酸酶不敏感。归一化后，通过比较处理与未处理 RNA 获得的 cRT-PCR 和 RT-qPCR 产物，区分初级转录本与加工后的转录本。转录本末端通过克隆和测序 cRT-PCR 产物确定，并进一步通过 Northern 印迹验证。
通过使用该策略，已确定了玉米线粒体中的大多数稳态转录本。由于某些线粒体基因的转录模式较为复杂，尽管在Northern印迹中检测到了一些稳态转录本，但这些转录本尚未被区分和/或定位。目前尚不确定该策略是否适用于区分和定位其他植物线粒体或质体中的稳态转录本。
引言
在植物线粒体中，许多成熟和前体RNA以多种异构体形式积累，根据其5'端的差异，稳态转录本可分为两类1,2,3,4。初级转录本具有5'三磷酸末端，来源于转录起始；而加工后的转录本则具有由转录后加工产生的5'单磷酸末端。区分并定位这两类转录本对于揭示转录及转录本末端成熟过程的分子机制至关重要。
为了区分植物线粒体中的初级转录本和加工后转录本，已发展出四种主要策略。第一种策略是用烟草酸焦磷酸酶（tobacco acid pyrophosphatase, TAP）预处理线粒体RNA，该酶可将5'三磷酸转化为单磷酸，从而使初级转录本能够被RNA连接酶环化。随后通过cDNA末端快速扩增（RACE）或环状RT-PCR（cRT-PCR）比较TAP处理与未处理RNA样品的转录本丰度2,3,4。第二种策略是利用依赖于5'磷酸的外切核酸酶（terminator 5'-phosphate-dependant exonuclease, TEX）从线粒体RNA中去除加工后的转录本，然后通过引物延伸分析对剩余的初级转录本进行定位5,6。第三种策略是使用鸟苷酰转移酶对初级转录本进行预加帽，然后结合核糖核酸酶或S1核酸酶保护分析，通过引物延伸确定带有三磷酸的5'末端位置7,8,9。不同于依赖5'三磷酸存在与否的方法，第四种策略结合体外转录、定点突变和引物延伸分析，用于鉴定假定的启动子并确定转录起始位点8,10,11。通过这些策略，已在植物线粒体中鉴定出大量初级转录本和加工后转录本。
然而，已有若干研究报道，初级转录本的5'三磷酸基团不稳定，会因未知原因迅速转化为单磷酸形式2,4,12,13。这一问题阻碍了利用依赖5'三磷酸存在与否的技术对这两类转录本进行明确区分，此前在植物线粒体中系统性区分初级转录本与加工后转录本的尝试均未成功2,12。
在本实验方案中，我们结合使用cRT-PCR、RNA 5'多磷酸酶处理、RT-qPCR和Northern印迹法，系统区分在玉米（Zea mays）线粒体中稳定积累的初级转录本和加工后转录本（图1）。cRT-PCR可同时定位RNA分子的5'和3'末端，通常用于植物中转录本末端的定位2,12,14,15。RNA 5'多磷酸酶能够从三磷酸化的5'末端去除两个磷酸基团，从而使初级转录本可被RNA连接酶介导进行自连。先前研究表明，玉米成熟26S rRNA具有经过加工的5'末端，且对RNA 5'多磷酸酶不敏感1,16。为最大限度减少初级5'末端不稳定三磷酸结构的影响，使用成熟26S rRNA对经5'多磷酸酶处理与未处理的RNA样本进行归一化，随后通过比较两种RNA样本获得的cRT-PCR产物，区分初级转录本与加工后转录本。cRT-PCR的定位与区分结果分别通过Northern印迹法和RT-qPCR进行验证。最后，针对Northern印迹法检测到但cRT-PCR未能扩增出的转录本，使用替代引物进行扩增。通过该基于cRT-PCR的策略，已实现对玉米线粒体中大多数稳态转录本的区分与定位1。
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方案
1. 引物设计
- 根据引物设计的一般规则，使用PCR引物设计软件（材料表）设计用于逆转录（RT）的基因特异性引物17。
注意：逆转录引物对目标转录本具有高度特异性，通常锚定在编码序列的5’端（成熟mRNA和前体RNA），或位于预期5’端下游约500–600 nt处（如18S和26S rRNA）。 - 设计成对的反向引物，用于通过cRT-PCR扩增环化转录本。
注意：成对的反向引物应位于环化转录本的5’-3’连接区域两侧，其具体位置因分析的目标转录本而异（图S1）。某些转录本具有较长的非翻译区（UTR）；例如，nad2-1的5’ UTR以及rps4-1的3’ UTR分别为1,985 nt和1,826/1,834 nt1。若两个引物均锚定在编码区，则难以有效扩增目标转录本。相反，某些UTR较短；例如，nad2-1和nad4-1的3’ UTR分别为34/35 nt和29–31 nt1。若成对引物距离编码序列过远，则PCR扩增将失败。通常为每个目标转录本设计两对反向引物，而对于转录模式复杂和/或UTR非常长的转录本，可能需要设计多对引物以完成定位。 - 设计成对的同向引物，用于制备Northern blot所需的RNA探针。
注意：成对引物应位于目标基因的编码区内，PCR产物大小应在100至1,000 bp范围内。每条正向引物应包含一个限制性酶切位点，以尽量减少最终探针中的载体序列。
2. 玉米发育籽粒中粗线粒体的制备 from Maize Developing Kernels
- 将研钵、研杵、玻璃漏斗、试管和枪头通过高压灭菌器灭菌，并在烘箱中干燥。
- 所有操作均在 4 °C 或冰上进行，并预先冷却所有溶液。
- 配制 100 mL 提取缓冲液（EB），包含 0.3 M 蔗糖、5 mM 四钠焦磷酸盐、10 mM KH2PO4、2 mM EDTA、1% [w/v] 聚乙烯吡咯烷酮 40、1% [w/v] 牛血清白蛋白、5 mM L-半胱氨酸和 20 mM 抗坏血酸。用 KOH 调节 pH 至 7.3，并通过过滤灭菌。
- 配制 100 mL 洗涤缓冲液（WB），包含 0.3 M 蔗糖、1 mM EGTA 和 10 mM MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）。用 NaOH 调节 pH 至 7.2，并通过过滤灭菌。
注意：建议使用经 DEPC 处理的去离子 H2O 配制 EB 和 WB。 - 在授粉后 11–20 天（DAP）采集 20 g 发育中的籽粒，放入置于冰上的 50 mL 离心管中，然后将籽粒转移至预冷的研钵中。
注意：EB 与玉米籽粒的质量体积比应为每 20 g 玉米籽粒使用 100 mL EB。 - 向每个研钵中加入 10–20 mL 冰冷的 EB，彻底研磨籽粒。
- 加入更多 EB，将研磨后的组织通过两层滤布过滤（材料表）。
- 将滤液在 8,000 x g 离心 10 分钟，弃去沉淀。
- 将上清液转移至新离心管中，在 20,000 x g 离心 10 分钟。
- 倒出上清液，将沉淀重悬于 6 mL WB 中。
- 将悬液分装至五个无 RNase 的 1.5 mL 离心管中，在 14,000 x g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，将线粒体沉淀在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存。
3. 线粒体RNA的提取
- 按照说明书使用商业试剂（材料表）提取线粒体RNA。
注意：该试剂含有苯酚和异硫氰酸胍。操作时应在通风橱中进行，并穿戴实验服和手套。 - 将分离得到的线粒体RNA溶解于经DEPC处理的去离子H2O中，并使用分光光度计（材料表）测定RNA浓度和纯度。
注意：通常情况下，从20 g 15天授粉后（15-DAP）的玉米籽粒中可获得约250 μg线粒体RNA。 - 制备一块琼脂糖凝胶，包含1×TAE缓冲液（40 mM Tris，20 mM乙酸，1 mM EDTA）、1.5%琼脂糖（材料表）以及1×核酸染色染料（材料表）。
- 加入适量10×上样缓冲液（0.5%溴酚蓝、0.5%二甲苯蓝FF和50%甘油），将线粒体RNA与上样缓冲液的混合物上样至1.5%琼脂糖凝胶中。
- 在1×TAE缓冲液中以5–6 V/cm的电压电泳20–25分钟，并使用凝胶成像系统（材料表）观察凝胶以评估线粒体RNA的完整性。
注意：出现两条清晰条带（分别为玉米线粒体26S和18S rRNA，大小分别约为3,510和1,970 nt）可作为完整线粒体RNA的可接受标准。为排除可能的降解，在环状RNA制备的多个步骤中均应检测RNA完整性（图2）。
4. RNA 5’ 多磷酸酶处理
- 设置RNA 5’多磷酸酶（表格和材料）处理（表1），在37 °C孵育30–60分钟。
- 根据生产商说明书，使用RNA纯化试剂盒（材料表）回收经5’多磷酸酶处理的RNA。
- 重复步骤3.3至3.5。
5. RNA 环化
- 使用相同量的经5’多磷酸酶处理和未处理的线粒体RNA进行两组环化反应，并将两组反应均在16 °C下孵育12–16小时（表2）。
- 使用与步骤4.2相同的试剂盒回收两组自连接的RNA。
注意：应注意的是，仅有一部分线粒体RNA会发生自连接，所回收的RNA将是线性与环化转录本的混合物。 - 重复步骤3.3至3.5。
6. 逆转录
- 从相同量的环化5’多磷酸酶处理与未处理的RNA（200 ng）中合成两组cDNA。
- 通过等比例混合26S-CRT引物和最多7种其他反转录引物，制备引物混合物。
注意：引物混合物的终浓度应为1 μM。 - 按照表3所列试剂配制两种预混液，于65 °C孵育5分钟，然后在冰上冷却2分钟。
- 建立两种反转录反应体系（表4），于42 °C孵育50分钟。
- 将两种反转录反应在70 °C加热5分钟，然后置于冰上冷却。
7. 归一化
- 通过添加等体积的模板 cDNA 进行两个 PCR 反应，这些 cDNA 分别来源于经 5’ 多磷酸酶处理或未处理的 RNA，并使用跨越环化 26S rRNA 5’-3’ 连接处的反向引物（即 26S-CF1 和 -CR1）等（表 5）。
- 在热循环仪（材料表）中按照 表 6 所述条件运行这两个反应。
- 制备一块琼脂糖凝胶，包含 1x TAE 缓冲液、1.0% 琼脂糖和 1x 核染料。
- 向两个 PCR 产物中各加入 2 μL 10x 上样缓冲液（含 0.5% 溴酚蓝、0.5% 茜素蓝 FF 和 50% 甘油），然后将它们上样至凝胶中。
- 在 1x TAE 缓冲液中以 5–6 V/cm 的电压电泳 30–40 分钟，并使用与步骤 3.5 相同的凝胶成像系统进行成像。
- 使用计算机软件（材料表，图 4A）比较两个 PCR 产物的丰度，并根据需要调整模板 cDNA 的用量以优化归一化效果。
8. PCR 扩增
- 通过加入适量的标准化cDNA和一对位于目标转录本5’-3’连接区两侧的反向引物，制备PCR反应体系（表7）。
注意：用于目标转录本PCR扩增的模板cDNA用量，应根据26S rRNA标准化结果确定。 - 按照表8中描述的程序进行PCR反应。
- 重复步骤7.3至7.5。
- 更换为巢式反向引物，并通过重复步骤8.1和8.2验证第一轮PCR结果。
- 重复步骤7.3至7.5。
- 使用凝胶DNA回收试剂盒（材料表）回收在两轮PCR扩增中均能稳定出现的明显条带。
9. 转录本末端的确定
- 使用标准技术将凝胶纯化的 PCR 产物克隆至平末端载体（材料表）中。
- 进行菌落 PCR 以筛选含有目标插入片段的阳性克隆，并进行商业测序。
注意：通常从单一条带回收的克隆中可检测到含有不同大小插入片段的阳性克隆，这是因为植物线粒体中的许多稳态转录本具有异质性的 5’ 和/或 3’ 末端1,12。 - 利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的局部比对基本搜索工具（BLAST），将测序数据与玉米线粒体基因组进行比对。选择物种“玉米 (taxid:4577)”，并搜索数据库“核苷酸集合 (nr/nt)”。
- 确定环状转录本的 5’-3’ 连接位点，并鉴定转录本 5’ 和 3’ 末端的位置。
- 计算目标转录本的大小。
10. 通过RNA凝胶印迹杂交验证cRT-PCR定位结果
注意： RNA 凝胶印迹杂交使用商业试剂盒（材料表）进行，该试剂盒包含用地高辛（DIG）和 T7 RNA 聚合酶对 RNA 进行转录标记、杂交以及免疫学检测所需的试剂。更多细节请参考试剂盒中提供的实验方案。确保整个实验过程仅使用无 RNase 的器材。
- 扩增用于制备RNA探针的DNA片段，并将其克隆至与步骤9.1相同的载体中，该载体在插入位点上游17 bp处含有T7启动子。
- 使用适当的限制性内切酶线性化该构建体，通过DNA纯化试剂盒（材料表）回收线性化质粒，并将其溶解于经DEPC处理的去离子H2O中。
- 根据生产商说明书，使用商品化试剂盒（材料表）以DIG-11-UTP标记RNA探针。
- 使用经DEPC处理的去离子H2O配制500 mL 10× MOPS缓冲液（0.2 M MOPS、50 mM醋酸钠和10 mM EDTA），用NaOH调节pH至7.0，并通过过滤除菌。
- 向步骤3.1–3.3中制备的线粒体RNA中加入2–3倍体积的上样缓冲液（50%甲酰胺、6.2%甲醛、1× MOPS、10%甘油和0.1%溴酚蓝）。
- 将RNA样品与上样缓冲液的混合物在65 °C变性10分钟，然后冰浴冷却1分钟。
- 制备变性琼脂糖凝胶（2%甲醛、1.2%琼脂糖和1× MOPS），并将RNA样品与上样缓冲液的混合物上样至凝胶中（每孔1–2 μg线粒体RNA）。
- 在1× MOPS缓冲液中以3–4 V/cm的电压电泳约4小时。
- 配制2 L 20× SSC缓冲液（3 M NaCl、0.3 M柠檬酸钠，pH 7.0），加入0.1% DEPC处理过夜，并通过高压灭菌除菌。
- 用20× SSC缓冲液漂洗凝胶两次（每次15分钟），并通过毛细管转移法使用20× SSC将凝胶中的RNA转移至尼龙膜（材料表）上，转移时间为10–16小时。
- 在120 °C烘烤30分钟，将RNA固定于膜上。
- 根据生产商说明书，使用商品化试剂盒（材料表）进行RNA杂交及免疫学检测。
11. 初级和加工后5’末端的区分
- 通过比较经或未经5'多磷酸酶处理的标准化RNA所获得的cRT-PCR产物，区分初级转录本和加工后的5'末端。
注意： 对于初级转录本，来自5'多磷酸酶处理RNA的PCR产物丰度显著高于未经处理的RNA（图1，“Gene A”和图4A）；而对于加工后的转录本，两组线粒体RNA扩增出的PCR产物水平相近（图1，“Gene B”）。 - 根据cRT-PCR定位结果设计RT-qPCR引物。
- 利用RT-qPCR验证cRT-PCR的区分结果。
注意： 来自5'多磷酸酶处理和未处理RNA的两个cDNA样品，均以26S成熟rRNA的RT-qPCR产物进行标准化。
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结果
线粒体RNA环化效率的估算
在之前的一项研究中，总RNA和线粒体RNA均被用于通过cRT-PCR方法绘制线粒体转录本末端图谱 拟南芥 (拟南芥），两种RNA的比对结果相似12最初，我们也曾使用总RNA进行玉米线粒体转录本末端的cRT-PCR定位。经过多次尝试后，我们发现目标转录本难以检测。作为改进，我们从玉米发育中的籽粒中富集了线粒体RNA，从而使目标转录本在环化后仅需一轮PCR即可实现扩增。
为了阐明富集后目标转录本易于扩增的原因，我们通过针对代表性线粒体基因nad5进行逆转录PCR（RT-PCR），估算了RNA环化效率（图3和
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讨论
在之前的一项研究中，来自细胞悬浮培养的总RNA和线粒体RNA 拟南芥 采用cRT-PCR方法对线粒体转录本末端进行定位，获得了相似的结果12然而，在许多其他研究中，仅使用富集的线粒体RNA来绘制线粒体转录本的末端1,2,3,9我们发现，线粒体RNA的富集是玉米线粒体转录本末端cRT-PCR定位中的关键步骤。经过该富集处理后，环化线粒体RNA的比例从0.3%–3.7%显著提高至约30%（图3 和 图S2），从而使得在一轮PCR中扩增环化的目标转录本成为可能。
通过玉米nad1和nad5的RT-PCR分析估算了线粒...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（项目编号：31600250，Y.Z.）、广州市科技计划项目（项目编号：201804020015，H.N.）和中国农业研究体系（项目编号：CARS-04-PS09，H.N.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | Aladdin, 中国 | A112880 | 用于配制 1x TAE 缓冲液 |
| Applied Biosystems 2720 热循环仪 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 4359659 | 用于 PCR 扩增的热循环仪 |
| 抗坏血酸 | Sigma-aldrich, 美国 | V900134 | 用于配制提取缓冲液 |
| Biowest 琼脂糖 | Biowest, 西班牙 | 9012-36-6 | 用于分离 PCR 产物和 RNA |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-aldrich, 美国 | A1933 | 用于配制提取缓冲液 |
| 溴酚蓝 | Sigma-aldrich, 美国 | B8026 | 用于配制琼脂糖凝胶电泳和 Northern 印迹的上样缓冲液 |
| DEPC | Sigma-aldrich, 美国 | V900882 | 灭活 RNase |
| DIG Northern 起始试剂盒 | Roche, 美国 | 12039672910 | 用于 DIG-RNA 标记和 Northern 印迹。该试剂盒包含使用 DIG 和 T7 RNA 聚合酶进行 RNA 转录标记、杂交及化学发光检测所需的试剂。 |
| EDTA | Sigma-aldrich, 美国 | V900106 | 用于配制提取缓冲液和 1x TAE 缓冲液 |
| EGTA | Sigma-aldrich, 美国 | E3889 | 用于配制洗涤缓冲液 |
| 凝胶成像系统 | Bio-Rad, 美国 | Gel Doc XR+ | 用于成像琼脂糖凝胶 |
| 甘油 | Sigma-aldrich, 美国 | G5516 | 用于配制琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液 |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio, 中国 | G8142 | 用于 DNA 染色 |
| Hybond-N+ 尼龙膜 | Amersham Biosciences, 美国 | RPN119 | 用于 Northern 印迹 |
| Image Lab | Bio-Rad, 美国 | Image Lab 3.0 | 用于凝胶成像及比较 PCR 产物的丰度 |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, 美国 | V900041 | 用于配制提取缓冲液 |
| KOH | Aladdin, 中国 | P112284 | 用于配制提取缓冲液 |
| L-半胱氨酸 | Sigma-aldrich, 美国 | V900399 | 用于配制提取缓冲液 |
| Millex | Millipore, 美国 | SLHP033RB | 通过过滤对提取缓冲液和洗涤缓冲液进行无菌处理 |
| Miracloth | Calbiochem, 美国 | 475855-1R | 用于过滤研磨后的胚乳组织 |
| MOPS | Sigma-aldrich, 美国 | V900306 | 用于配制 Northern 印迹的电泳运行缓冲液 |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 2000C | 用于 RNA 浓度和纯度测定 |
| NaOH | Sigma-aldrich, 美国 | V900797 | 用于配制洗涤缓冲液 |
| pEASY-Blunt 简单克隆载体 | TransGen Biotech, 中国 | CB111 | 用于凝胶回收条带的克隆。该载体在插入位点上游数个碱基处含有 T7 启动子。 |
| Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶 | Vazyme, 中国 | P505 | 用于 PCR 扩增的 DNA 聚合酶 |
| 聚乙烯吡咯烷酮 40 | Sigma-aldrich, 美国 | V900008 | 用于配制提取缓冲液 |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, 美国 | Primer Premier 6.24 | 用于设计逆转录和 PCR 扩增引物 |
| PrimeScript II 逆转录酶 | Takara, 日本 | 2690 | 用于合成第一条 cDNA 链 |
| PureLink RNA Mini 试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 12183025 | 用于 RNA 纯化 |
| RNA 5' 多磷酸酶 | Epicentre, 美国 | RP8092H | 将 5' 三磷酸转化为单磷酸 |
| RNase 抑制剂 | New England Biolabs, 英国 | M0314 | RNA 自连接反应和 5' 多磷酸酶处理反应的组分，用于抑制 RNase 活性。 |
| 乙酸钠 | Sigma-aldrich, 美国 | V900212 | 用于配制 Northern 印迹的电泳运行缓冲液 |
| 氯化钠 | Sigma-aldrich, 美国 | V900058 | 用于配制 20x SSC |
| SsoFast evaGreen supermixes | Bio-Rad, 美国 | 1725202 | 用于 RT-qPCR |
| T4 RNA 连接酶 1 | New England Biolabs, 英国 | M0437 | 用于 RNA 环化 |
| 焦磷酸四钠 | Sigma-aldrich, 美国 | 221368 | 用于配制提取缓冲液 |
| TIANgel 中量纯化试剂盒 | Tiangen Biotech, 中国 | DP209 | 用于从琼脂糖凝胶中纯化 DNA 片段 |
| Tris | Aladdin, 中国 | T110601 | 用于配制 1x TAE 缓冲液 |
| TRIzol 试剂 | Invitrogen, 美国 | 15596026 | 用于提取线粒体 RNA。 |
| 通用 DNA 纯化试剂盒 | Tiangen Biotech, 中国 | DP214 | 用于从限制性内切酶消化反应中回收线性化质粒 |
| 二甲苯青 FF | Sigma-aldrich, 美国 | X4126 | 用于配制琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液 |
参考文献
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