Method Article

使用基于循环 RT-PCR 的策略对玉米 Mitochondrion 中初级和已处理转录的区分和映射

DOI:

10.3791/60019

⸱

July 29th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过结合循环RT-PCR、定量RT-PCR、RNA 5'聚磷酸酶处理和北方斑点,提出了基于RT-PCR的循环RT-PCR策略。该协议包括一个标准化步骤,以尽量减少不稳定5'三磷酸酯的影响,它适用于对玉米线粒体中稳定积累的初级和加工转录转录进行鉴别和映射。

Abstract

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在植物线粒体中,一些稳态转录本具有从转录启动(主转录)衍生的5'三磷酸盐,而其他含有5'单磷酸盐产生的转录后(处理转录)。为了区分这两种类型的成绩单,已经制定了几种策略,其中大多数取决于存在/缺少5'三磷酸盐。然而,小学5年级的三磷酸盐是不稳定的,它阻碍了对两种类型的抄本的明显区分。为了系统地区分和绘制玉米线粒体中稳定积累的初级和加工转录本,我们开发了基于CRT-PCR(cRT-PCR)的循环RT-PCR(cRT-PCR)策略,将cRT-PCR、RNA 5'多磷酸酶处理、定量RT-PCR (RT-qPCR) 和北方污点。作为改进,该策略包括RNA正常化步骤,以尽量减少不稳定的5'三磷酸盐的影响。

在此协议中,富集线粒体RNA由RNA 5'聚磷酸酶预处理,将5'三磷酸酯转化为单磷酸盐。经过循环和逆转录后,从5'聚磷酸酶处理和未处理RNA衍生的两种cDNA由玉米26S成熟rRNA归一化,其加工为5'结束,对5'聚磷酸酶不敏感。规范化后,通过比较从处理过的和未经处理的RNA获得的cRT-PCR和RT-qPCR产物,对初级和加工的转录本进行区分。转录端验通过cRT-PCR产物的克隆和测序确定,然后由北方印块验证。

通过采用这一策略,确定了玉米线粒体中大多数稳态记录。由于一些线粒体基因的转录模式复杂,一些稳态转录图没有被区分和/或映射,尽管它们是在北方的污点中检测到的。我们不确定此策略是否适合在其他植物线粒体或石膏中区分和映射稳态记录。

Introduction

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在植物线粒体中,许多成熟和前体RNA作为多种等形体积累,稳定状态转录法可以根据其5'末端1、2、3的差异被分成两组。 4.主转录有5'三磷酸盐末端,从转录启动派生。相比之下,经过处理的转录本具有5'单磷酸盐,通过转录后处理产生。两种类型的转录本的鉴别和映射对于解开转录和转录结束成熟的分子机制非常重要。

为了区分植物线粒体的主要转录和加工记录,已经开发了四个主要策略。第一种策略是用烟草酸焦磷酸酶(TAP)预处理线粒体RNA,将5'三磷酸盐转化为单磷酸盐,并使初级转录本通过RNA连带循环。然后通过快速扩增cDNA端(RACE)或圆形RT-PCR(cRT-PCR)2、3、4,比较TAP处理和未处理RNA样本的转录量。在第二种策略中,处理的转录本首先从线粒体RNA中耗尽,使用终结器5'-磷酸盐依赖外糖酶(TEX),然后通过引世扩展分析5,6映射所剩的主要转录本

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Protocol

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1. 底漆设计

  1. 根据引物设计的一般规则,使用PCR引物设计软件(材料表)设计逆转录(RT)基因专用引物。
    注:RT 引录对目标转录本非常具体,它们通常固定在编码序列的 5' 部分(成熟的 mRNA 和前体 RNA),或预计的 5' 端 (18S 和 26S rRNA)的下游 ±500–600 nt。
  2. 设计发散引基对,通过cRT-PCR放大循环转录。
    注:成对发散引引在循环转录本的5'-3'结侧侧,它们的位置因分析的目标转录本而异(图S1)。有些成绩单有很长的 UtR;例如,nad2-1 5' UTR 和rps4-1 3' UTR 分别为 1,985 和 1,826/1,834 nt,分别为1。如果两个引录都固定在编码区域上,则很难放大目标脚本。相比之下,一些 RR 是短的;例如,nad2 -1 和 nad4-1 的 3' TR 分别为 34/35 和 29–31 nt,分别为1。如果配对引注位于远离编码序列的位置,PCR 将失败。通常,为每个目标转录本设计了两对发散底漆,而可能需要多对来映射成绩单模式复杂和/或 RR 很长的脚本。

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Results

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线粒体RNA循环效率估计

在以前的研究中,总和线粒体RNA都用于cRT-PCR映射线粒体转录在阿拉伯拉多普西斯(阿拉伯拉多普西斯)的线粒体转录终点,两种类型的RNA给出了类似的映射结果12。最初,我们还使用总RNA在玉米中线粒体转录终点的cRT-PCR映射。经过多次试验,我们发现目标记录很难被检测出来。作为改进,我们丰富了玉米开发内核中的线粒体RNA,使循环靶转录本在一轮PCR中得以扩增成为可能。

为了解释富集后目标转录本的易扩增,我们通过在代表性线粒体基因nad5上执行RT-PCRs来估计RNA循环效率(图3和

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Discussion

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在先前的研究中,利用阿拉伯多普西细胞悬浮培养的组蛋白和线粒体RNA,用cRT-PCR绘制线粒体转录终点,结果相似,获得12.然而,在许多其他研究中,只有富集线粒体RNA被用于绘制线粒体转录终点尼的图谱。研究发现,线粒体RNA的富集是玉米中线粒体转录终点的cRT-PCR映射的重要一步。在此扩增后,循环线粒体RNA的比例从0.3%~3.7%大幅提升至+30%(图3和图S2),使得循环靶转录本在一轮PCR中得以扩增成为可能。

通过对玉米nad1和nad5的RT-PCR分析,估计了线粒体RNA的循环效率,这两种核子粒体.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项工作得到了国家自然科学基金(授权号31600250,Y.Z.)、广州市科技项目(批号201804020015,H.N.)和中国农业研究系统(批号No.S.)的支持。CARS-04-PS09,H.N.)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
乙酸阿拉丁，中国A112880制备 1x TAE 缓冲液
Applied Biosystems 2720 热循环仪Thermo Fisher Scientific，美国4359659用于 PCR 扩增的热循环仪
抗坏血酸Sigma-aldrich，美国V900134用于制备提取缓冲液
Biowest 琼脂糖Biowest，西班牙9012-36-6解析 PCR产品和 RNA 牛
血清白蛋白Sigma-aldrich，美国A1933用于制备提取缓冲液
溴酚蓝Sigma-aldrich，美国B8026用于制备琼脂糖凝胶电泳和 Northern 印迹的上样缓冲液
DEPCSigma-aldrich，美国V900882RNase
DIG 的失活 Northern 入门试剂盒Roche，美国12039672910用于 DIG-RNA 标记和 Northern 印迹。该试剂盒包含用于使用 DIG 和 T7 RNA 聚合酶对 RNA 进行转录标记、杂交和化学发光检测的试剂。
EDTASigma-aldrich， 美国V900106用于制备提取缓冲液和 1x TAE 缓冲液
EGTASigma-aldrich， USAE3889用于制备洗涤缓冲液
凝胶记录系统Bio-Rad，美国凝胶文档 XR+琼脂糖凝胶成像
油Sigma-aldrich， USAG5516用于制备琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液
GoldView II （5,000x）Solarbio，.中国G8142DNA 染色
Hybond-N+，尼龙膜Amersham Biosciences，美国RPN119用于 Northern 印迹
图像实验室Bio-Rad，美国图像实验室 3.0图像凝胶，并比较 PCR 产物的丰度。
KH2PO4Sigma-aldrich， 美国V900041用于制备提取缓冲液
KOHAladdin， 中国P112284用于制备提取缓冲液
L-半胱氨酸Sigma-aldrich， 美国V900399用于制备提取缓冲液
MillexMillipore， USASLHP033RB无菌提取和过滤洗涤缓冲液
MiraclothCalbiochem， USA475855-1R过滤磨碎的内核组织
MOPSSigma-aldrich， USAV900306用于制备 Northern 印迹的电泳缓冲液
NanoDropThermo Fisher Scientific， USA2000C用于 RNA 浓度和纯度测定
NaOHSigma-aldrich， USAV900797用于洗涤缓冲液
pEASY-Blunt简单克隆载体TransGen Biotech，中国CB111凝胶回收条带的克隆。它包含一个 T7 启动子，位于插入位点上游几 bps 处。
Phanta max 超保真 DNA 聚合酶Vazyme，中国P505用于 PCR 扩增的 DNA 聚合酶
聚乙烯吡咯烷酮 40Sigma-aldrich，美国V900008用于制备提取缓冲液
引物 Premier 6.24PREMIER Biosoft，美国引物 Premier 6.24设计用于逆转录和 PCR 扩增的引物
PrimeScript II 逆转录酶Takara， Japan2690合成第一链 cDNA
PureLink RNA Mini 试剂盒Thermo Fisher Scientific， USA12183025用于 RNA 纯化
RNA 5' 多磷酸酶Epicenter， USARP8092H将 5' 三磷酸盐转化为单磷酸
盐 RNase 抑制剂New England Biolabs， UKM0314RNA 自连接和 5' 多磷酸酶处理反应的一个组成部分，用于抑制 RNase 的活性。
乙酸钠Sigma-aldrich，美国V900212用于制备 Northern 印迹的电泳缓冲液
氯化钠V90005820x SSC
SsoFas evaGreen 超混液Bio-Rad，美国1725202用于 RT-qPCR
T4 RNA 连接酶 1New England Biolabs，英国M0437用于 RNA 环化
四钠焦磷酸盐Sigma-aldrich，美国221368用于制备提取缓冲液
TIANgel 中型纯化试剂盒Tiangen Biotech，中国DP209从琼脂糖凝胶中纯化 DNA 片段
TrisAladdin，中国T110601 制备1x TAE 缓冲液
TRIzol 试剂Invitrogen，美国15596026线粒体 RNA。
通用 DNA 纯化试剂盒天根生物，中国DP214从限制性内切酶消化反应中回收线性化质粒
二甲苯青 FFSigma-aldrich，美国X4126用于制备琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液
甘的制备 制备 提取

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L.

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