单方支气管内酸灌输自我限制急性肺损伤模型

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是急性呼吸衰竭^{的重要原因。}它是一种常见、致命或致残的疾病，在全球10%的重症监护病房收治患者中发生2。根据柏林定义3，ARDS的定义是低氧呼吸衰竭的急性发病（<1周）和双边肺渗透到胸部放射成像仪，不能解释心脏衰竭4。基础病理生物学的特点是过度的炎症反应。肺部可直接受伤，如肺炎或胃酸吸入，或间接，如在败血症或多次输血后4。在最初的侮辱之后，ARDS发病机制分三个阶段进行:渗出、增殖和纤维化阶段1。这些阶段的特点是独特的分子和细胞免疫和修复机制，确定ARDS患者的预后。支持性护理仍然是ARDS患者的支柱;目前，没有有效的药理治疗ARDS，所以迫切需要新的研究这个毁灭性的条件4。

在渗出阶段，先天免疫反应的调节不良导致ARDS的急性发病和相关呼吸衰竭1。有效的亲炎中介信号协调初始免疫反应，导致肺泡毛细血管屏障中断，扩散肺泡水肿，和中性粒细胞渗透到肺组织损伤部位4。在ARDS中，急性炎症的无效制动信号容易导致肺衰竭，并能及时延迟受伤的肺组织5。为此，对ARDS的内源启动和赞成解决机制的临床前调查可能会发现新的治疗策略。这种调查需要自我限制的急性肺损伤的体内实验模型，这种模型与人类ARDS的特征非常相似，允许对组织损伤的启动和解决阶段背后的机制进行询问。

这里介绍的鼠害模型产生直接的急性肺损伤，表明渗出ARDS的主要病理生物学过程，即肺泡-毛细血管屏障中断和中性粒细胞渗透。该方法依赖于通过左主干支气管的罐，局部损伤和左肺的炎症反应，选择性地在支气管内灌输HCl;未受伤的右肺可用作组织损伤和炎症的内部控制。此外，单侧肺损伤是非致命的，并公布了一个解决方案。这为治疗肺部炎症提供了一个独特的窗口，可以利用它识别内源性亲解的中介和细胞机制，并为ARDS开辟新的治疗途径，强调解决生理学和药理 学。

以下所有动物程序都经过布里格姆和妇女医院机构动物护理和使用委员会（#2016N000356议定书）的审查和批准。

注:所有存活程序都遵循无菌技术。使用无菌窗帘毛巾为每项手术建立了无菌场，而外科医生则佩戴无菌手术手套、帽子、口罩和干净的实验室外衣。所有手术器械均使用高压灭菌器进行消毒，使用珠子消毒器维持无菌。

1. 0.1 N HCl 的准备

1. 将 11 mL ddH₂O 添加到琥珀色玻璃瓶中。缓慢添加 1 mL 的 37% HCl （12 N）， 以创建 1 N HCl 工作库存。
   警告:确保将 HCl添加到水中。这是一个安全问题，因为直接在酸中加水会导致酸沸腾，溅出瓶子。处理浓缩 HCl 时，确保将酸保存在通风的化学罩中，并佩戴适当的个人防护设备，包括实验室涂层、手套和安全眼镜。
2. 在 50 mL 锥形管中缓慢地将先前稀释的 HCl 工作库存的 4 mL 添加到 35 mL 的 ddH₂O 中，以创建 0.1 N HCl 实验库存。
3. 使用低pH溶液进行两点校准后，使用电子pH探头测量实验原料的pH值。根据需要使用 NaOH 或 HCl 库存溶液将 PH 1.1 分给pH 1，以便最终体积为 40 mL。
   注:测量低 pH 值可能很困难。为确保测量准确，请确保使用低 pH 标准正确校准 pH 探头，以避免过度推断测量。
4. 在实验前，通过0.22μm无菌过滤器将实验HCl库存的1⁄2 mL过滤成无菌微离心管。

2. HCl 的选择性支气管内灌输

1. 准备手术区域
   1. 通过注射内注射氯胺酮（100毫克/千克）和木兰辛（10毫克/千克）混合物，诱导一般麻醉。通过轻轻挤压尾部或后脚的尖端，确保鼠标完全麻醉。在进行皮肤切口之前，需要缺乏戒断反应。 如果需要，管理额外的麻醉栓塞。
   2. 在颈部的刮伤下，将0.1毫克/千克的丁丙诺啡下皮下。术前镇痛药将加强麻醉的效果，并减轻手术前和术后疼痛。
   3. 使用电动剪子轻轻切刀小鼠腹腔表面的手术区域，在喉咙颈椎区域的下巴下方，使用缓慢的向下笔划。去除松散的毛皮，以完全暴露底层皮肤。
   4. 用10%的波维酮碘溶液擦拭被切的部位，准备手术区域。应用无菌溶液后，使用70%的等丙醇拭子清洁现场。重复此步骤 3 倍。
2. 隔离气管
   1. 将鼠标置于干净的手术板上，将鼠标覆盖在无菌手术窗帘中，同时保持手术区域的暴露。将窗帘固定到位。
   2. 在气管和唾液腺上方的皮肤上进行0.5厘米的纵向切口。使用稍微弯曲的锯齿状钳子小心拉回皮肤，轻轻分离唾液腺，露出气管肌肉。
   3. 使用锯齿状钳子进行钝性解剖，轻轻推开脱脱剂肌肉，并梳理气管周围的筋膜，直到气管的软骨环完全暴露。
   4. 使用完全弯曲的锯齿状钳子解除气管，并分离复古气管和复古筋膜之间的结缔组织。一旦结缔组织分离，钳尖应完全滑向气管后面。
   5. 将弯曲的钳子放在气管后面，用钳子的尖端抓住一块 10⁄15 厘米的 4-0 编织丝线。将缝合线拉到气管后面，使两侧的长度均匀。
   6. 缝合到位后，轻轻地将缝合线两侧拉向鼠标后部，并将两侧保持到位。
3. 选择性地可以吸收左主干支气管和灌输 HCl
   1. 取一个24 G x 3/4"的气管，将针头向上切开，插入第一和第二气管环之间的气管前区域。一旦通过直接可视化气管流明中的针尖来确认正确的插入，释放缝合线，并将管状推进到针上，并进入气管，直到达到阻力，然后拔下针头。向左主干支气管的插入方向倾斜，以便选择性地灌输到左肺中。
   2. 一旦导管到位，牢牢抓住喷射口，防止导管移动。
   3. 使用 P200 移液器和无菌 P200 移液器吸头，将 2.5 mL/kg（20 g 鼠标 50 μL）无菌过滤 0.1 N HCl 注入导管，然后注入相同体积的空气。
   4. 快速拔下导管，将手术板提升到 60° 角，30 s。
4. 关闭手术区
   1. 将手术板平放，从气管后面取出缝合线。
   2. 使用 4-0 蜡涂层编织丝缝，用 2⁄3 针合合皮肤切口。

3. 术后护理

1. 切口关闭后，将鼠标放在左侧的加热垫上，直到鼠标从麻醉中恢复。开始监测鼠标的疼痛和活动水平，然后再将其返回到正常外壳。
   注:在前24小时，应每6-12小时以0.1毫克/千克的皮下施用布丙诺啡。如果存在持续突破性疼痛，则延长镇痛方案，直到疼痛消退。

4. 全肺支气管菌（BAL）和白细胞免疫性免疫性

1. 通过施用步骤2.1.1中使用的氯胺酮/乙酰胺剂量的3倍，使小鼠安乐死。
   1. 为了区分间质和血管内嗜血杆菌，在安乐死前5分钟静脉注射一种带有荧光素标记的Ly6G抗体。此标签应适合通过流动细胞学检测，以区分血管内嗜中性粒细胞与肺间和肺中微粒细胞，在组织制备过程中用不同的荧光素标记（见下文）。
2. 将鼠标放在手术板上，将前切口钩在 2-0 编织丝缝合线环周围。
3. 按照步骤 2.2.2~2.2.6 操作。准备气管进行气管。
   注:确保隔膜未被刺穿，以在肺洗漱过程中最大化透射压力;左肺依从性在受伤后降低，这可能需要更高的肺洗漱压力要求。
4. 按照步骤 2.3.1 对气管进行气管，但不要将导管推进到卡林纳下方;插入与气管平行的导管。
5. 插入导管后，将缝合线系在气管周围，将导管固定到位。
6. 使用 1 cc 注射器，使用 0.6 mM EDTA 连续注入和提取两个连续 1 mL 等分的冰冷的 PBS -/- （不含镁或钙）。对于通过流动细胞测定进行免疫表位，去除每个等分，并返回到冰上的 5 mL 聚苯乙烯 FACS 管。
7. 为确保安乐死，使用手术剪刀进行胸腔切除术，然后进行心脏穿刺。肺可以收获进一步处理。
8. 在4°C下在800克下将BAL离心10分钟，以颗粒细胞。
9. 将上清液放入2 mL微离心管中，并异量成1.5 mL微离心管。储存在-80°C进行后续分析。
10. 用2%FBS在PBS -/-中重新悬浮细胞颗粒，以便通过流式细胞学进行白细胞差分分析。
11. 为了区分血管间和血管内嗜血杆菌，分别切除左肺和右肺，并处理肺流动细胞学，如Abdulnour等人2014^年6。
12. 使用选定的 FACS 抗体染色产生的细胞悬浮液，确保与步骤 4.1.1 中的 Ly6G 抗体不同的荧光团结合的 Ly6G 染色。

5. 使用埃文的蓝色染料（EBD）评估阿尔韦拉尔阻隔性

1. 在安乐死前30分钟静脉注射埃文的蓝色染料（40毫克/千克）。
2. 使用氯胺酮/木氨酸过量对小鼠实施安乐死（步骤4.1）。
3. 要测量基道屏障完整性，请按照 BAL 收集的步骤 4.2_4.9 操作。
4. 将 BALF 的 100 μL 转移到清底 96 孔微孔板，以及 100 μL 的重复 EBD 标准。使用 PBS -/- 作为空白。
5. 使用微孔板读取器测量 BALF 在 620 nm 和 740 nm 处的吸光度。使用 740 nm 处的吸光度来纠正样品⁷中的血吸子污染。
6. 为了测量血管屏障的完整性，通过心脏的右心室缓慢注射5 mL的冰冷的PBS -/- 来渗透肺部。取出左肺。
7. 在58°C下干燥左肺72小时，以去除多余的水。
8. 处理干肺组织如拉杜和切尔诺夫2013 8，并测量620纳米和740纳米的吸光。

6. 肺本体学

1. 按照步骤 4.1_4.5 对气管进行气管的加点。
2. 要将肺部压力固定在 20 厘米 H₂O，请使用环支架和夹子将装有阀控制管并填充了精选固定溶液（例如锌固定剂）的 60 mL 注射器提升，使固定溶液的半月板高于肺。
3. 将管连接到导管并打开该值。慢慢地用固定剂填充肺部，直到它们停止充气。
4. 从气管中取出导管 3⁄4。在完全取出导管之前，用缝合线将气管系上，以尽量减少固定损失。
5. 取出肺和心脏。
   注:确保肺在切除过程中没有被刺穿，以保持注入的压力固定。
6. 在室温下，在25 mL的固定下固定肺部24小时。
7. 在 PBS -/-、30% 乙醇和 50% 乙醇中连续清洗固定肺 20 分钟。
8. 最后一次洗涤后，将肺部储存在70%乙醇中，用于进行成形学处理，如Eickmeier等人2013^年9。

选择性支气管内HCl灌输导致单侧急性肺损伤

图1A说明了HCl选择性支气管内灌输到左主干支气管的方法。随之而来的急性肺损伤涉及整个左肺，在静脉注射EBD和肺灌注后，EBD仅留在左肺（图1B）。EBD对左肺的外溢进行了量化，发现相对于假选择性灌输，其增加幅度明显（图1C;改编自Abdulnour等人，2014年6）。为了应对肺部损伤，将白细胞二叶虫循环到发炎的组织中。在这个模型中，血管中性粒细胞经历转皮迁移到受伤的肺间质。在HCl灌输后24小时左肺中积累插页性嗜中性粒细胞，与右肺相反，在那里很少观察到插页性中性粒细胞（图1D）。这些结果表明，选择性左主干支气管内灌输方法导致鼠急性肺损伤，主要是局部左肺，并产生病理变化，也看到与人类ARDS，包括增加肺结膜-毛细血管屏障突破和中性粒细胞渗透。

单侧急性肺损伤有助于研究解决机制

研究酸引起的急性肺损伤小鼠的解决阶段必须能够生存的初始侮辱。与内切管HCl不同，只向左主干支气管中注入会导致自我限制损伤，否则健康小鼠会均匀存活。肺可以在早期或较晚的时间点从小鼠获得，如图2A所示。肺组织学显示，器官和细胞水平的组织损伤和炎症，在损伤后24小时渗出炎症，其特征是左肺水肿和中性粒细胞渗透明显。请注意，没有重大损伤或白细胞流入未受伤的控制右肺 （图 2A）。受伤后72小时，水肿和细胞渗透大幅度减少，代表一个解决渗出阶段。阿尔韦拉尔嗜中性粒细胞可以通过流式细胞测定（CD45+/CD68-/F4/80-/Ly6G+/CD11b+） 通过全肺洗漱获得监测。初伤后左肺中嗜中性粒细胞增加24小时，在48和72小时显著减少（图2B）。如果研究以后的时间点，中性粒细胞细胞数量将回到基线，并在后期阶段的催化机制，如纤维增殖反应，可以研究。

图1:选择性支气管内HCl灌输产生由肺泡屏障突破和中性粒细胞渗透定义的单侧肺损伤。（A） 表示鼠左主干支气管的可分管，以选择性地将HCl注入左肺。（B） 被切除的右 （RL） 和左 （LL） 肺部暴露于选择性酸注入和注入后静脉注射埃文的蓝色染料。（C） 酸损伤或假控制后，从均质、注入肺的间质 Evan 蓝色染料的定量化 24 h;图改编自阿卜杜勒努尔等人2014年6。值表示平均值 = SEM，其中 n = 5。↑p < 0.05， Mann-Whitney U 测试 （D） 血管内代表性流动细胞测定 （I.V.; 荧光素 1） 和间质 （I.S.; 荧光素 2） 嗜中性粒细胞占 CD45 总百分比–酸损伤后处理肺中 24 h 的细胞。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:单侧急性肺损伤是自我解决的。（A） 代表H&E组织学（10x）左肺从幼鼠（0小时）或小鼠24，48，72小时后获得，以及从同一小鼠（Scale bar = 250 μm）相关的右肺。（B） 肺泡嗜中性粒细胞的代表性流细胞测定 （Ly6G+ CD11b+） 从整个肺洗漱中获得的总 CD45+细胞百分比在幼稚 （0 h） 小鼠或小鼠酸损伤后 24， 48 和 72 h.请点击此处查看此图的较大版本。

作者没有什么可透露的。