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通过单侧支气管内注射酸建立自限性急性肺损伤模型

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DOI：

10.3791/60024

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2019年8月30日

 ,  ,  , 
1Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Internal Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

本文内容

摘要

在小鼠左侧肺进行选择性支气管内酸灌注，可导致单侧且自限性的急性肺损伤，该模型模拟了由胃酸误吸引起的人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。

摘要

选择性地将盐酸（HCl）灌注至小鼠左主支气管可导致急性组织损伤，其组织病理学表现与人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）相似。由此引发的肺泡水肿、肺泡-毛细血管屏障损伤以及白细胞浸润主要累及左肺，而右肺则保持未受损状态，作为自身对照，使动物得以存活。该自限性急性肺损伤模型可用于研究组织修复机制，例如巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的胞葬作用以及肺泡-毛细血管屏障完整性的恢复过程。该模型已帮助揭示了多种促修复因子的重要作用，包括特异性促炎消退介质（SPMs），为开发针对ARDS患者的新型治疗策略奠定了基础。

引言

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是急性呼吸衰竭的重要病因1。这是一种常见且可能致死或致残的疾病，在全球所有收住重症监护病房的患者中，约有10%会发生该病2。根据柏林定义3，ARDS的特征为急性起病的低氧性呼吸衰竭（<1周内发病），以及胸片上出现无法用心力衰竭解释的双肺浸润影4。其基本的病理生物学机制表现为过度的炎症反应。肺部损伤可为直接损伤，例如肺炎或胃酸吸入所致，也可为间接损伤，例如脓毒症或多次输血后发生4。在初始损伤之后，ARDS的发病过程可分为三个阶段：渗出期、增殖期和纤维化期1。这些阶段具有不同的分子和细胞免疫反应及修复机制，决定了ARDS患者的预后。目前对ARDS患者仍以支持治疗为主；尚无有效的药物治疗方法，因此迫切需要针对这一严重疾病开展新的研究4。

在渗出期，先天免疫反应的失调导致急性呼吸窘迫综合征（ARDS）及其相关呼吸衰竭的急性发作1。强烈的促炎介质信号通路协调初始免疫反应，导致肺泡-毛细血管屏障破坏、弥漫性肺泡水肿以及中性粒细胞浸润至肺组织损伤部位4。在ARDS中，急性炎症的无效制动信号易导致肺功能衰竭，并可能延迟受损肺组织的及时恢复5。因此，对ARDS内源性启动和促消退机制的临床前研究可能揭示新的治疗策略。此类研究需要采用具有自限性的体内急性肺损伤实验模型，这些模型应高度模拟人类ARDS的特征，以便探究组织损伤启动期与消退期的潜在机制。

本文介绍的小鼠模型可直接引起急性肺损伤，表现出渗出性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的核心病理生物学过程，即肺泡-毛细血管屏障破坏和中性粒细胞浸润。该方法通过插管左主支气管，选择性地向支气管内滴注盐酸（HCl），使损伤和炎症反应局限于左肺；未受损的右肺可作为内部对照，用于部分组织损伤和炎症指标的检测。此外，单侧肺损伤不致死，并可揭示损伤消退过程。这为研究肺部炎症的消退机制提供了独特窗口，可用于鉴定内源性促消退介质和细胞机制，并为强调消退生理学与药理学的ARDS新疗法开辟途径。

方案

以下所有动物实验程序均已通过布莱根妇女医院机构动物护理和使用委员会（编号 #2016N000356）的审查和批准。

注意：所有可存活手术均遵循无菌操作技术。每次手术均使用无菌铺巾建立无菌区域，外科医生佩戴无菌手套、帽子、口罩和洁净的实验服。所有手术器械均通过高压灭菌器进行灭菌，并使用干热灭菌器维持无菌状态。

1. 0.1 N 盐酸的制备

  1. 加入 11 mL ddH₂O2O至琥珀色玻璃瓶中。缓慢加入1 mL 37% HCl（12 N），配制1 N HCl工作液。
    警告： 确保加入 HCl 进入 水。这是一个安全隐患，因为将水直接加入酸中可能导致酸液沸腾并从瓶中溅出。操作浓盐酸时，应确保酸液置于通风的化学通风橱中，并穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套和护目镜。
  2. 缓慢将4 mL已稀释的HCl工作液加入35 mL的ddH₂O中2在50 mL锥形管中配制0.1 N HCl实验储备液。
  3. 使用低pH溶液进行两点校准后，用电子pH探针测量实验储备液的pH值。滴定至 pH 1.1 根据需要使用 NaOH 或 HCl 储备溶液，使最终体积为 40 mL。
    注意： 测量低pH值可能较为困难。为确保测量准确，务必使用低pH标准液对pH探针进行正确校准，以避免测量值过度外推。
  4. 实验开始前，立即通过0.22 μm滤膜过滤1–2 mL实验用盐酸储备液。 µm 无菌滤器转入无菌微量离心管中。

2. 盐酸的选择性支气管内灌注

  1. 准备手术区域
    1. 通过腹腔注射给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物以诱导全身麻醉。通过轻轻挤压小鼠尾尖或后肢足部来确认小鼠是否完全麻醉。 在进行皮肤切口前必须确认无回缩反应。 必要时可追加麻醉剂剂量。
    2. 在颈部皮褶处皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡。术前镇痛可增强麻醉效果，并减轻手术引起的术前和术后疼痛。
    3. 使用电推剪，在小鼠颏部下方颈部咽喉区域的腹侧表面，以缓慢向下的动作轻柔剃毛。清除松散毛发，充分暴露皮下皮肤。
    4. 用10%聚维酮碘溶液擦拭已剃毛的部位进行手术区准备。涂抹无菌溶液后，再用70%异丙醇棉片清洁该区域。重复此步骤3次。
  2. 分离气管
    1. 将小鼠仰卧位固定于洁净的手术板上，并用无菌手术巾覆盖小鼠，仅暴露手术区域。固定手术巾位置。
    2. 在气管和唾液腺上方的皮肤做一条0.5 cm的纵向切口。使用略带弧度的有齿镊小心牵拉皮肤，并轻柔分离唾液腺，以暴露气管肌层。
    3. 使用有齿镊进行钝性分离，轻柔撑开气管旁肌肉，并剥离环绕气管的筋膜，直至完全暴露气管软骨环。
    4. 使用全弧形有齿镊抬起气管，并分离气管后方与后筋膜之间的结缔组织。当结缔组织被完全分离后，镊尖应能完全滑入气管后方。
    5. 保持弧形镊位于气管后方，用镊尖夹住一段10–15 cm长的4-0编织丝线缝合线。将缝线从气管后方拉出，使两侧长度相等。
    6. 缝线就位后，轻柔地将缝线两端向小鼠背部方向牵拉，并固定住两端。
  3. 选择性插管左主支气管并灌注盐酸
    1. 取一支24 G × ¾”套管针，将针头斜面向上，插入气管前壁第一与第二气管环之间区域。通过直接观察确认针尖进入气管腔后，松开缝线，将导管沿针芯推进气管，直至遇到阻力，随后撤出针芯。为实现向左肺的选择性灌注，插入方向应朝向左主支气管。
    2. 导管就位后，牢固握住注射接口，防止导管移位。
    3. 使用P200移液器及无菌P200吸头，向导管内灌注0.1 N无菌过滤盐酸，剂量为2.5 mL/kg（20 g小鼠为50 µL），随后注入等体积空气。
    4. 迅速拔出导管，并将手术板抬高至60°角，维持30秒。
  4. 关闭手术区域
    1. 将手术板放平，并从气管后方移除缝线。
    2. 使用4-0蜡涂层编织丝线缝合皮肤切口，缝合2–3针。

3. 术后护理

  1. 缝合切口后，将小鼠置于温暖的加热垫上，左侧卧位，直至其从麻醉中恢复。在将其送回正常饲养环境前，开始监测小鼠的疼痛程度和活动水平。
    注意：应在术后24小时内每6-12小时皮下注射一次0.1 mg/kg的丁丙诺啡。若持续出现突破性疼痛，应延长镇痛给药方案，直至疼痛消失。

4. 全肺支气管肺泡灌洗（BAL）及白细胞免疫表型分析

  1. 通过给予步骤 2.1.1 中所用氯胺酮/甲苯噻嗪剂量的 3 倍剂量来处死小鼠。
    1. 为了区分间质性和血管内中性粒细胞，在处死前 5 分钟 静脉注射标记有荧光染料的抗 Ly6G 抗体。该标记物应适用于流式细胞术检测，以区分血管内中性粒细胞与肺间质及肺泡中性粒细胞，后者将在组织制备过程中使用不同荧光染料进行标记（见下文）。
  2. 将小鼠置于手术板上，并将其前门齿钩挂在一段 2-0 编织丝线的环上。
  3. 按照步骤 2.2.2–2.2.6 准备气管以便插管。
    注意：确保不穿刺膈肌，以在肺灌洗期间获得最大的跨肺泡膨胀压；损伤后左肺顺应性下降，可能需要更高的跨肺泡压力以完成肺灌洗。
  4. 按照步骤 2.3.1 进行气管插管，但不要将导管推进至隆突以下；应将导管平行于气管插入。
  5. 插入导管后，将丝线在气管周围打结，以固定导管位置。
  6. 使用 1 mL 注射器，先后灌注并回收两份 1 mL 冰冷的无镁钙 PBS -/- 缓冲液（含 0.6 mM EDTA）。若需进行流式细胞术免疫表型分析，应将每次回收的灌洗液转移至冰上的 5 mL 聚苯乙烯 FACS 管中。
  7. 为确保动物处死，使用手术剪进行开胸，随后行心脏穿刺。此后可取出肺组织用于进一步处理。
  8. 将支气管肺泡灌洗液（BAL）在 4 °C 条件下以 800 g 离心 10 分钟，以沉淀细胞。
  9. 将上清液倾入 2 mL 微量离心管中，并分装至 1.5 mL 微量离心管。储存于 -80 °C 以备后续分析。
  10. 用含 2% FBS 的 PBS -/- 重悬细胞沉淀，用于通过流式细胞术进行白细胞分类分析。
  11. 为区分间质性和血管内中性粒细胞，分别取出左肺和右肺，并按照 Abdulnour 等人 20146 的方法进行流式细胞术处理。
  12. 使用选定的 FACS 抗体对所得细胞悬液进行染色，注意所用 Ly6G 抗体的荧光染料必须与步骤 4.1.1 中使用的 Ly6G 抗体不同。

5. 使用伊文思蓝染料（EBD）评估肺泡屏障通透性

  1. 在处死前30分钟，通过静脉注射伊文思蓝染料（40 mg/kg）。
  2. 使用过量的氯胺酮/赛拉嗪处死小鼠（步骤4.1）。
  3. 为评估肺泡屏障完整性，请按照步骤4.2–4.9进行支气管肺泡灌洗液（BAL）的收集。
  4. 将100 µL支气管肺泡灌洗液（BALF）转移至透明底96孔微孔板中，同时加入100 µL的伊文思蓝标准品（双复孔）。以PBS -/-作为空白对照。
  5. 使用微孔板读板仪在620 nm和740 nm波长下测定BALF的吸光度。使用740 nm处的吸光度校正样品中血红素的干扰7。
  6. 为评估血管屏障完整性，通过右心室缓慢灌注5 mL冰冻PBS -/-以灌洗肺组织，随后取出左肺。
  7. 将左肺置于58 °C条件下干燥72小时，以去除多余水分。
  8. 按照Radu和Chernoff 20138所述方法处理干燥的肺组织，并在620 nm和740 nm波长下测定吸光度。

6. 肺组织学

  1. 按照步骤 4.1–4.5 进行气管插管。
  2. 在 20 cm H₂O 压力下固定肺组织2将装有阀门控制管路并盛满特定固定液（如锌固定液）的60 mL注射器固定于铁架台和夹具上，调节高度使固定液的液面高于肺部20 cm。
  3. 将导管连接至管路并打开阀门。缓慢注入固定液灌注肺部，直至肺部停止膨胀。
  4. 移除导管 ¾ 气管出口处。在完全取出导管前，用缝线结扎气管，以尽量减少固定液的流失。
  5. 完整切除肺和心脏。
    注意： 在取出过程中需确保肺部未被刺破，以保持灌注固定剂的压力。
  6. 在室温下用 25 mL 固定液固定肺组织 24 小时。
  7. 用 PBS -/-、30% 乙醇和 50% 乙醇依次清洗固定后的肺组织，每次 20 分钟。
  8. 最后一次灌洗后，将肺组织置于70%乙醇中保存，用于后续组织学处理，具体步骤参照Eickmeier等2013年的方法。9.

结果

选择性支气管内盐酸滴注导致单侧急性肺损伤

选择性将盐酸（HCl）滴注至左侧主支气管的方法如图1A所示。由此引发的急性肺损伤累及整个左肺，静脉注射伊文思蓝染料（EBD）并进行肺灌注后，EBD仅滞留在左肺中（图1B）。左肺内EBD的外渗量被定量检测，结果显示其显著高于假手术组的选择性滴注（图1C；改编自Abdulnour等，20146）。在肺损伤发生后，循环中的白细胞会迁移至炎症组织。在此模型中，血管内的中性粒细胞穿过内皮迁移至受损肺的间质。在HCl滴注后24小时，中性粒细胞在左肺间质中积聚，而右肺中仅观察到极少量的间质中性粒细胞（图1D）。这些结果表明，选择性左侧主支气管内滴注方法可诱导小鼠产生主要局限于左肺的急性肺损伤，并引发与人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）相似的病理改变，包括肺泡-毛细血管屏障通透性增加和中性粒细胞浸润。

单侧急性肺损伤可实现对消退机制的研究

为了研究酸诱导的急性肺损伤小鼠模型的恢复阶段，必须确保小鼠能够存活于初始损伤之后。与经气管注入盐酸（HCl）不同，仅将盐酸注入左侧主支气管可导致一种自限性损伤，在原本健康的小鼠中具有稳定的存活率。可在早期或较晚时间点获取小鼠肺组织，如图2A所示。肺组织病理学显示，在器官和细胞水平上存在组织损伤和炎症反应；损伤后24小时表现为渗出性炎症，其特征为左肺明显的肺泡水肿和中性粒细胞浸润。请注意，未受损伤的对照右肺无明显损伤或白细胞浸润（图2A）。损伤后72小时，水肿和细胞浸润显著减少，代表渗出性炎症进入消退阶段。可通过全肺灌洗获取细胞，并采用流式细胞术（CD45+/CD68-/F4/80-/Ly6G+/CD11b+）监测肺泡中性粒细胞的变化。初始损伤后24小时，左肺中性粒细胞数量增加，在48小时和72小时时显著减少（图2B）。若进一步研究更晚的时间点，中性粒细胞数量将恢复至基线水平，从而可进一步探讨恢复后期的代谢消退机制，例如纤维增生性反应。

肺损伤实验：示意图、组织图像、柱状图和肺部炎症分析的流式细胞术。
图1：选择性支气管内盐酸灌注导致单侧肺损伤，表现为肺泡屏障破坏和中性粒细胞浸润。（A）小鼠左侧主支气管插管示意图，用于向左肺选择性灌注盐酸。（B）经选择性酸灌注并静脉注射伊文思蓝染料后灌流的右侧（RL）和左侧（LL）肺组织。（C）酸损伤或假手术对照24小时后，匀浆并灌流的肺组织中肺间质伊文思蓝染料的定量分析；该图改编自Abdulnour等，20146。数据以均值±标准误表示，n ≥ 5。*p < 0.05，Mann-Whitney U检验。（D）酸损伤后24小时，经处理肺组织中血管内（I.V.；荧光染料1）和间质（I.S.；荧光染料2）中性粒细胞占总CD45+细胞的百分比，代表性流式细胞术图。 请点击此处查看此图的放大版本。

肺组织病理学与流式细胞术分析；72小时内炎症评估
图2：单侧急性肺损伤具有自限性。（A）来自未处理小鼠（0 h）或酸损伤后24、48、72 h小鼠的左肺代表性H&E染色组织切片（10倍放大），以及同一只小鼠的右肺组织（比例尺 = 250 µm）。（B）通过全肺灌洗获得的肺泡中性粒细胞（Ly6G+ CD11b+）代表性流式细胞术分析结果，以未处理（0 h）小鼠或酸损伤后24、48和72 h小鼠中CD45+细胞总数的百分比表示。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

本文所述的支气管内灌注方法通过选择性插管左侧主支气管，将盐酸（HCl）灌注至左肺，从而诱导单侧且自限性的小鼠急性肺损伤。该小鼠酸性肺损伤模型能很好地模拟人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中的炎症反应、组织病理学改变及生理功能障碍，而胃酸误吸是人类ARDS常见的诱发或促进因素4。小鼠气道暴露于低pH值的HCl后，肺泡-毛细血管屏障通透性增加，出现肺泡水肿，并在损伤部位发生显著的中性粒细胞浸润。这些变化在未受损的右肺中不出现。此外，该模型可引发快速的炎症反应，在酸灌注后24小时内达到高峰，并且在基因表达变化方面与人类ARDS具有相似性，例如磷脂酶D同工型的差异表达10。

尽管该小鼠临床前模型在分子、细胞和组织水平上再现了急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的许多特征，但它并不能完全模拟人类 ARDS。ARDS 的定义包括双侧肺部受累3，而本文所述的滴注方法在设计上导致单侧肺部疾病。此外，这些动物不需要持续的机械通气、固定不动或肠外镇静。本文（如上所述）及其他研究6,9,11,12,13的结果表明，单侧酸诱导的肺损伤可再现 ARDS 的大多数病理特征，同时提供了利用对侧肺作为内部对照的独特机会，并可用于研究该疾病恢复阶段的机制。因此，本文讨论的模型虽可模拟 ARDS 的病理生物学过程，但也能够对肺组织对损伤的基本反应及其修复机制进行机制性研究，这些研究可能对防治这一重要疾病具有重要意义。

盐酸（HCl）灌注可导致直接的急性肺损伤，因此该模型可模拟与吸入性肺炎相关的部分病理生理过程。此外，该模型中最初的左肺损伤是通过无菌HCl诱导的，而不是某些人类误吸事件中常见的含细菌胃内容物，后者还可能引发肺炎14。在人类中，致病菌的误吸可导致继发性细菌性肺炎，从而加重急性炎症反应，延长初始肺损伤病程，并增加患者发生急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的易感性14。为弥补这一潜在局限，研究人员已尝试在无菌HCl灌注后，进一步灌注致病菌大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）15。此外，该方法也可用于研究病原体介导的炎症反应；通过选择性地向左肺灌注细菌（如E. coli16,17、Pseudomonas aeruginosa16和Streptococcus pneumoniae18），可诱导单侧细菌性肺炎。本文所述的自限性急性肺损伤模型还可用于研究呼吸机相关性肺损伤（VILI），后者是人类ARDS患者死亡率升高的重要原因之一19。VILI的实验动物模型通常采用对健康小鼠进行机械通气，并使用远高于临床常规的潮气量（>15 mL/kg）以诱发肺损伤（参见前期研究20,21）。为了建立更具临床相关性的VILI模型，可首先采用本文所述的支气管内酸灌注方法诱导非致死性肺损伤，随后在临床常用潮气量范围（6–12 mL/kg）内进行机械通气。这一假设性的动物模型在建立并验证后，可使研究人员以更贴近临床的方式研究VILI。综上所述，这些小鼠模型突显了选择性支气管内灌注方法的灵活性，可用于构建单侧肺损伤，从而高度模拟人类肺部疾病的病理特征。

除了能够向左肺选择性灌注多种有害物质外，气管切开后经支气管内灌注技术无需长时间培训、操作时间短且不需要复杂设备，在操作熟练者手中可使实验动物遭受最小痛苦。尽管如此，在选择性盐酸灌注过程中仍可能出现若干问题，影响实验结果。若左主支气管插管不当，可能导致双侧肺损伤，降低实验小鼠的存活率，并干扰将右肺作为未损伤的内部对照。可通过在插管时将导管充分向左肺方向倾斜，直至遇到阻力，以避免此问题。注入盐酸后，应立即注入一股空气，迅速拔出导管，并将手术板迅速竖起至60°角。这些步骤对于确保酸液到达左肺远端气道，并防止酸液反流至右肺和气管（可能引起近端损伤）至关重要。灌注后24小时内，左肺损伤呈弥漫性，伴有显著肺水肿，累及左肺的近端和远端区域。

在成年8至12周龄小鼠的方法学建立过程中，支气管内给予2.5 mL/kg的盐酸可导致显著但非致死性的急性肺损伤；较低剂量的盐酸则无法产生可重复且均一的肺损伤。尽管我们尚未在更年轻（例如3至6周龄）或更年老（例如10至14月龄）的小鼠中实施该模型，但我们预计基于体重的盐酸给药剂量将产生与8至12周龄小鼠相似的肺损伤表型。我们建议研究者在对体重极端（过轻或过重）的小鼠开展正式实验前，先通过滴定盐酸剂量以达到所需的肺损伤程度。

这种选择性酸灌注方法提供了一种非致死性的无菌性组织炎症小鼠模型，可减少对机械通气等支持性治疗的需求。由于受伤小鼠的存活时间延长，酸诱导的炎症有足够时间实现自我消退。该模型的消退阶段已被用于鉴定在时间上受调控的内源性生物活性脂质介质，即特殊促消退介质（specialized pro-resolving mediators, SPMs），例如脂氧素A4（LXA4）、maresin 1（MaR1）和消退素6,11,12,16。向受伤小鼠给予外源性SPMs可通过抑制炎症机制并促进受损肺组织的消退过程，从而加快酸诱导肺损伤的恢复。这些SPMs可促进肺泡水肿的清除12，增强募集的巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的胞葬作用16，并加速气道和肺泡的再上皮化12，以减少血管渗漏和组织缺氧。在病原体诱导的肺损伤模型中，15-epi-消退素D1还通过增强巨噬细胞对细菌的吞噬作用以及促进感染肺组织中细菌的清除而表现出抗菌活性16。研究这些内源性消退机制有助于深入了解针对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者的潜在新型治疗策略5。

为了深入研究消退机制的时空调控，需要体内实验模型。急性肺损伤模型必须包含相关的急性炎症反应和器官功能障碍，同时激活宿主促进消退的分子与细胞过程。这些机制可通过已建立的消退指数进行量化22。选择性支气管内灌注法可诱导单侧急性肺损伤，在研究内源性消退介质及通路方面已被证明具有重要价值。未来进一步加深对这些主动消退过程理解的研究，有望开发出模拟内源性脂质介质生物学作用的治疗性激动剂，从而促进炎症消退，降低急性呼吸窘迫综合征（ARDS）及其他重要肺部疾病的发病率与死亡率。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨感谢 Joseph Mizgerd 博士对支气管内选择性方法的建立所做出的贡献，以及他对本文手稿提出的有益评论和审阅意见。本研究得到了美国国立卫生研究院基金 P01GM095467（B.D.L.）和 K08HL130540（R.E.A.）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10倍锌固定液BD Biosciences552658
2-0 编织丝线缝合线Surgical SpecialtiesSP118
24 G × 3/4" 一次性安全型静脉导管Excel26751
33 mm，0.22 µm 注射器滤器单元Millipore-SigmaSLGP033RS
4" 长柄锯齿状微弯格拉费镊RobozRS-5135
4" 长尖锯齿状全弯格拉费镊RobozRS-5137
4.5 " 微型解剖剪RobozRS-5912
6" 克里尔-伍德缝合针持RobozRS-7860
60 mL 注射器BD Biosciences309653
抗小鼠 FITC-Ly6G 抗体Thermo Fisher Scientific11-9668-82可使用首选荧光染料标记抗体
抗小鼠 PE-Ly6G 抗体Thermo Fisher Scientific12-9668-82可使用首选荧光染料标记抗体
接种环灭菌器
聚维酮碘溶液棉签棒Betadine67618-153-01
BuprenexReckitt BenckiserNDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5
透明平底96孔微孔板Thermo Fisher Scientific12565501
不含 Ca2+ 和 Mg+ 的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS）life technologies14190-144
电动剪毛器
乙二胺四乙酸（EDTA）Millipore-SigmaE6758
伊文思蓝染料Millipore-SigmaE-2129
加热垫
盐酸，37%Millipore-Sigma258148
氯胺酮Henry-Schein56344
微孔板读数仪（640 nm，720 nm）
P200 移液器
P200 移液器吸头
pH 探针
带延伸夹的铁架台
无菌酒精消毒棉片Thermo Fisher Scientific22-363-750
无菌小鼠手术巾（8" × 8"，带椭圆形粘性开窗）Steris88VCSTF
无菌丁腈手套Kimberly-Clark56890
无菌毛巾式手术巾Dynarex4410
蜡涂层 4-0 编织丝线缝合线CovidienSS733
赛拉嗪AKORNNDC: 59399-111-50

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