用于诱导创伤性脑损伤的可控皮层冲击小鼠模型

摘要

本文介绍了一种通过开放式颅脑控制性皮质冲击诱导小鼠创伤性脑损伤的实验方案。

摘要

美国疾病控制与预防中心估计，每年在美国约有200万人遭受创伤性脑损伤（TBI）。事实上，TBI是导致所有与损伤相关死亡病例中超过三分之一的促成因素。然而，目前对TBI病理生理背后的细胞和分子机制仍知之甚少。因此，能够复制与人类患者TBI相关的损伤机制的临床前TBI模型成为一项关键的研究需求。TBI的可控皮层冲击（CCI）模型利用一种机械装置直接冲击暴露的皮层。尽管没有任何模型能够完全重现人类患者TBI中多种多样的损伤模式及其异质性特征，但CCI能够诱导出多种具有临床适用性的TBI表型。此外，CCI易于标准化，使研究人员能够在不同实验之间以及不同研究团队之间比较结果。以下方案详细描述了在小鼠TBI模型中使用市售冲击装置实施重度CCI的操作步骤。

引言

美国疾病控制与预防中心估计，每年约有200万美国人遭受创伤性脑损伤（TBI）^1,2。事实上，TBI导致了美国所有与损伤相关死亡的30%以上，每年医疗费用接近800亿美元，而每位严重TBI幸存者每年的费用几乎高达400万美元^3,4,5。TBI的影响还体现在其幸存者所经历的显著长期神经认知和神经精神并发症上，其中包括行为、认知和运动功能障碍的隐匿性发生，这种病症被称为慢性创伤性脑病（Chronic Traumatic Encephalopathy, CTE）^6,7,8,9,10。即使是亚临床的脑震荡事件——即未引起临床症状的脑部冲击——也可能导致长期的神经功能障碍^11,12。

自19世纪末以来，人们已开始使用动物模型研究创伤性脑损伤（TBI）¹³。20世纪80年代，为模拟TBI而开发了一种气动冲击装置，该方法现称为控制性皮层冲击（controlled cortical impact, CCI）¹⁴。由于CCI具有良好的可控性和可重复性，研究人员已将其改良并应用于啮齿类动物¹⁵。本实验室采用该模型，通过商用冲击装置和电子驱动设备诱导TBI^16,17。根据所使用的生物力学参数不同，该模型能够产生多种具有临床相关性的TBI状态。本实验室在诱导重度损伤后对TBI脑组织进行组织学评估，结果显示同侧皮层和海马组织显著丢失，同时伴有对侧脑水肿和结构变形。此外，通过行为学检测发现，CCI可导致稳定存在的运动功能和认知功能障碍¹⁸。CCI的局限性包括需要进行开颅手术，以及冲击装置和驱动设备成本较高。

此外，文献中还建立了多种其他TBI模型，包括侧向液体脉冲模型、落重模型和爆炸伤模型^19,20,21。尽管这些模型各自具有独特的优势，但其主要缺点分别为混合性损伤、高死亡率以及缺乏标准化²²。此外，这些模型均无法达到CCI模型在准确性、精确性和可重复性方面的水平。通过调节输入致动装置的生物力学参数，CCI模型可使研究者精确控制损伤的大小、深度以及施加于脑组织的动能。这使得研究者能够在脑部特定区域施加涵盖整个范围的TBI损伤，同时也保证了实验间最大程度的可重复性。

方案

所有实验程序均经西北大学机构动物护理和使用委员会批准。C57BL/6小鼠购自杰克逊实验室，并饲养于西北大学比较医学中心（伊利诺伊州芝加哥）的屏障设施中。所有动物均在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，并可自由获取食物和水。

1. 诱导麻醉

1. 通过腹腔注射氯胺酮（125 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。

2. 每15分钟监测一次生命体征

1. 监测体温、呼吸频率和皮肤颜色。小鼠触摸时应感觉温暖，皮肤应呈粉红色且血流灌注良好。呼吸频率应为每分钟50–70次。

3. 术前操作步骤

1. 在诱导损伤前一天称量所有小鼠的体重。
2. 为每个实验动物通过高压灭菌法消毒一套手术器械。使用前对撞击装置进行灭菌。 
3. 准备一个恢复笼，将干净的笼子放置在设定为“低”档的电热垫上，并确保小鼠在恢复活动能力后可自由远离热源。
4. 在无菌超净工作台内设置手术区域。
   1. 放置立体定位手术架。
   2. 将撞击装置固定在立体定位架上。
   3. 根据所需的生物力学参数设定驱动装置的速度和停留时间。
      注：本方案中描述的重度脑损伤采用直径为 3 mm 的撞击头，通过直径为 5 mm 的颅骨开窗，设定速度为 2.5 m/s，停留时间为 0.1 s。可通过多种不同的生物力学参数组合来诱导全范围的创伤性脑损伤（TBI）。
5. 穿戴新的个人防护装备和无菌手套。
6. 使用电动剪毛器剃除手术部位的毛发。
7. 在小鼠眼部涂抹保护性眼膏，以防止角膜损伤和干燥。
8. 将小鼠放入手术区域。
9. 用含碘外科擦洗剂与酒精交替消毒皮肤三次。

4. 控制性皮质撞击的应用

1. 用手术刀在颅顶正中切开皮肤1 cm，暴露颅骨。
2. 将小鼠置于立体定位仪中，通过将双侧颞骨固定在微型耳杆之间，并将门齿锁入门齿夹，从而在小鼠头部形成稳定的三点固定。
3. 使用止血钳或锁紧式镊子将头皮从手术区域拉开，确保在去骨瓣过程中头皮不会接触钻头。
4. 在暴露的颅骨上辨认矢状缝和冠状缝。
   注意：本方案将去骨瓣中心定位在矢状缝左侧2 mm、冠状缝前方2 mm处。
5. 使用配备环钻钻头的钻机进行去骨瓣操作。
   1. 进行去骨瓣时，首先将钻机调至最高速度，然后将环钻钻头垂直作用于颅骨预定位置。
   2. 钻头接触颅骨后施加轻柔且均匀的压力。当钻头穿透颅骨时会感到轻微的“突破感”。注意不要穿透下方的硬脑膜。
      注意：本方案使用直径为5 mm的环钻钻头进行去骨瓣。
6. 使用镊子和细规格皮下注射针头移除骨瓣，充分暴露下方的硬脑膜。
7. 将撞击头旋转进入手术区域，并缓慢下降直至接触暴露的硬脑膜。一旦接触，仪器的接触传感器会发出可听见的提示音，提示术者已实现接触。此位置即为设定变形深度的零点。
   注意：本方案使用直径为3 mm的撞击头以造成重度损伤。也可使用小至1 mm的撞击头以产生更局限的损伤。
8. 将撞击头抬起，并通过调节立体定位仪上的撞击装置位置，设定所需的撞击深度。
   注意：在本方案中，通过将变形深度设为2 mm来模拟重度损伤。
9. 通过启动驱动装置上的撞击器来实施损伤。
10. 将撞击装置旋离手术区域，并将动物从立体定位仪中取出。

5. 手术部位关闭

1. 使用无菌棉签对颅骨和受损皮质表面施加直接压力，以控制出血。
2. 使用无菌棉签将颅骨擦干。
3. 使用市售外科粘合剂或单丝缝线缝合颅骨切除部位的头皮。
   注意：本方案中使用兽用外科粘合剂闭合头皮。骨瓣不予复位，予以丢弃。

6. 术后护理与监测

1. 给予术后镇痛药物（例如，皮下注射缓释丁丙诺啡 0.1–0.5 mg/kg，可提供长达 72 小时的持续镇痛效果）。
2. 将动物置于清洁且预热的笼子中，采取侧卧位进行恢复。
3. 观察动物直至其清醒并能够自主活动，然后将每只小鼠放回其原有饲养笼中。
4. 确保自由获取食物和水。通常在损伤后一至两小时内恢复正常的食物和水摄入。
5. 在整个实验期间，每三天测量一次体重。

结果

撞击装置可直接安装在立体定位仪框架上，能够以高达 10 µm 的精度控制撞击点位置、深度和穿透程度。所采用的电磁力可实现 1.5–6 m/s 范围内的撞击速度。这使得在整个临床相关的创伤性脑损伤（TBI）范围内均具有无与伦比的精确性和可重复性。研究人员可通过改变损伤参数（如撞击头尺寸、撞击速度和撞击深度）进行预实验，以确定最能产生预期损伤程度的参数组合。本方案描述了对左侧顶颞区实施重度 TBI 的方法：在矢状缝左侧 2 mm、冠状缝前方 2 mm 处进行 5 mm 的颅骨切除术（图 1A）。使用直径为 3 mm 的撞击头，以 2.5 m/s 的速度和 2 mm 的变形深度实施可控性皮层撞击（图 2）。损伤表现为硬膜下、脑实质内及蛛网膜下腔出血（图 3）。伤后一个月的神经认知测试显示工作记忆、技能习得和运动协调能力存在持续性缺陷¹⁸。本实验室诱导重度损伤后对 TBI 脑组织进行的组织学评估显示同侧皮层和海马显著丢失...

讨论

要实施可靠且一致的损伤，有几个步骤至关重要。首先，必须使小鼠达到外科麻醉的深度，以确保在进行开颅手术期间无任何移动。尽管可采用多种麻醉方案来诱导啮齿类动物的全身麻醉，但会引起呼吸抑制的麻醉剂（如吸入性麻醉剂）在与重度创伤性脑损伤（TBI）联用时可能导致呼吸停止。本方案采用腹腔注射氯胺酮（125 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）。该药物组合在给药后5分钟内即可达到外科麻醉水平，并持续约30–45分钟。此外，该药物组合不会引起呼吸抑制。下一步关键步骤是开颅手术的实施。开颅应始终使用新的环钻钻头在高速下进行，以确保传递至小鼠脑组织的热量和振动最小化。热量和振动可能导致CCI损伤区域以外的邻近脑组织受损，从而导致不同个体及实验间损伤大小和机制的不一致。接下来，在实施CCI之前，必须将小鼠头部牢固固定于立体定位仪框架内，以确保每次损伤的深度和位置保持一致。微型耳杆和门齿夹是正确固定小鼠头部于立体定位仪框架中的关键组件。最后，使用带有接触传感器的装置至关重要。该传感器可指示撞击头与暴露的硬脑膜之间接触的精确点位，使研究者能够确定准确的零点，从而通过立体定位仪设定损伤深度，确保损伤程度的精确性和可重复性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AnaSed 注射用赛拉嗪无菌溶液	LLOYD, Inc.	5939911020
Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL	Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA	BSRLAB0.5-182012
高速旋转微型电机套件 KiT0	Foredom Electric Company	K.1070
Imapact one 用于立体定位 CCI	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39463920
Ketathesia 盐酸氯胺酮注射液 USP	Henry Schein, Inc	56344
小鼠专用立体定位底座	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39462980
微型钻头用环钻	Fine Science Tools, Inc	18004-50