本文介绍了一种通过开放式颅脑控制性皮质冲击诱导小鼠创伤性脑损伤的实验方案。
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摘要
摘要
美国疾病控制与预防中心估计，每年在美国约有200万人遭受创伤性脑损伤（TBI）。事实上，TBI是导致所有与损伤相关死亡病例中超过三分之一的促成因素。然而，目前对TBI病理生理背后的细胞和分子机制仍知之甚少。因此，能够复制与人类患者TBI相关的损伤机制的临床前TBI模型成为一项关键的研究需求。TBI的可控皮层冲击（CCI）模型利用一种机械装置直接冲击暴露的皮层。尽管没有任何模型能够完全重现人类患者TBI中多种多样的损伤模式及其异质性特征，但CCI能够诱导出多种具有临床适用性的TBI表型。此外，CCI易于标准化，使研究人员能够在不同实验之间以及不同研究团队之间比较结果。以下方案详细描述了在小鼠TBI模型中使用市售冲击装置实施重度CCI的操作步骤。
引言
美国疾病控制与预防中心估计，每年约有200万美国人遭受创伤性脑损伤（TBI）1,2。事实上，TBI导致了美国所有与损伤相关死亡的30%以上，每年医疗费用接近800亿美元，而每位严重TBI幸存者每年的费用几乎高达400万美元3,4,5。TBI的影响还体现在其幸存者所经历的显著长期神经认知和神经精神并发症上，其中包括行为、认知和运动功能障碍的隐匿性发生，这种病症被称为慢性创伤性脑病（Chronic Traumatic Encephalopathy, CTE）6,7,8,9,10。即使是亚临床的脑震荡事件——即未引起临床症状的脑部冲击——也可能导致长期的神经功能障碍11,12。
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方案
所有实验程序均经西北大学机构动物护理和使用委员会批准。C57BL/6小鼠购自杰克逊实验室，并饲养于西北大学比较医学中心（伊利诺伊州芝加哥）的屏障设施中。所有动物均在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，并可自由获取食物和水。
1. 诱导麻醉
- 通过腹腔注射氯胺酮（125 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
2. 每15分钟监测一次生命体征
- 监测体温、呼吸频率和皮肤颜色。小鼠触摸时应感觉温暖，皮肤应呈粉红色且血流灌注良好。呼吸频率应为每分钟50–70次。
3. 术前操作步骤
- 在诱导损伤前一天称量所有小鼠的体重。
- 为每个实验动物通过高压灭菌法消毒一套手术器械。使用前对撞击装置进行灭菌。
- 准备一个恢复笼，将干净的笼子放置在设定为“低”档的电热垫上，并确保小鼠在恢复活动能力后可自由远离热源。
- 在无菌超净工作台内设置手术区域。
- 放置立体定位手术架。
- 将撞击装置固定在立体定位架上。
- 根据所需的生物力学参数设定驱动装置的速度和停留时间。
注：本方案中描述的重度脑损伤采用直径为 3 mm 的撞击头，通过直径....
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结果
撞击装置可直接安装在立体定位仪框架上，能够以高达 10 µm 的精度控制撞击点位置、深度和穿透程度。所采用的电磁力可实现 1.5–6 m/s 范围内的撞击速度。这使得在整个临床相关的创伤性脑损伤（TBI）范围内均具有无与伦比的精确性和可重复性。研究人员可通过改变损伤参数（如撞击头尺寸、撞击速度和撞击深度）进行预实验，以确定最能产生预期损伤程度的参数组合。本方案描述了对左侧顶颞区实施重度 TBI 的方法：在矢状缝左侧 2 mm、冠状缝前方 2 mm 处进行 5 mm 的颅骨切除术（图 1A）。使用直径为 3 mm 的撞击头，以 2.5 m/s 的速度和 2 mm 的变形深度实施可控性皮层撞击（图 2）。损伤表现为硬膜下、脑实质内及蛛网膜下腔出血（图 3）。伤后一个月的神经认知测试显示工作记忆、技能习得和运动协调能力存在持续性缺陷18。本实验室诱导重度损伤后对 TBI 脑组织进行的组织学评估显示同侧皮层和海马显著丢失.......
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讨论
要实施可靠且一致的损伤，有几个步骤至关重要。首先，必须使小鼠达到外科麻醉的深度，以确保在进行开颅手术期间无任何移动。尽管可采用多种麻醉方案来诱导啮齿类动物的全身麻醉，但会引起呼吸抑制的麻醉剂（如吸入性麻醉剂）在与重度创伤性脑损伤（TBI）联用时可能导致呼吸停止。本方案采用腹腔注射氯胺酮（125 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）。该药物组合在给药后5分钟内即可达到外科麻醉水平，并持续约30–45分钟。此外，该药物组合不会引起呼吸抑制。下一步关键步骤是开颅手术的实施。开颅应始终使用新的环钻钻头在高速下进行，以确保传递至小鼠脑组织的热量和振动最小化。热量和振动可能导致CCI损伤区域以外的邻近脑组织受损，从而导致不同个体及实验间损伤大小和机制的不一致。接下来，在实施CCI之前，必须将小鼠头部牢固固定于立体定位仪框架内，以确保每次损伤的深度和位置保持一致。微型耳杆和门齿夹是正确固定小鼠头部于立体定位仪框架中的关键组件。最后，使用带有接触传感器的装置至关重要。该传感器可指示撞击头与暴露的硬脑膜之间接触的精确点位，使研究者能够确定准确的零点，从而通过立体定位仪设定损伤深度，确保损伤程度的精确性和可重复性。
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披露
作者无财务利益冲突。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院资助 GM117341 和美国外科医师学会 C. James Carrico 研究奖学金对 S.J.S. 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AnaSed 注射用赛拉嗪无菌溶液 | LLOYD, Inc. | 5939911020 | |
| Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL | Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA | BSRLAB0.5-182012 | |
| 高速旋转微型电机套件 KiT0 | Foredom Electric Company | K.1070 | |
| Imapact one 用于立体定位 CCI | Leica Biosystems Nussloch GmbH | 39463920 | |
| Ketathesia 盐酸氯胺酮注射液 USP | Henry Schein, Inc | 56344 | |
| 小鼠专用立体定位底座 | Leica Biosystems Nussloch GmbH | 39462980 | |
| 微型钻头用环钻 | Fine Science Tools, Inc | 18004-50 |
参考文献
- Faul, M. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths 2002-2006. , Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. Atlanta (GA). (2010).
- Roozenbeek, B., Maas, A. I., Menon, D. K.
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