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方法文章

通过连接蛋白43结构破坏干扰内皮细胞生物力学

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DOI：

10.3791/60034

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2019年10月4日

 , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of Central Florida, 2Burnett School of Biomedical Sciences, College of Medicine, University of Central Florida

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于力学的实验方案，用于破坏缝隙连接蛋白 connexin 43，并通过观测细胞牵引力和细胞间应力，评估其对内皮细胞生物力学特性的影响。

摘要

内皮细胞已被证实能够产生细胞间应力和牵引力，但缝隙连接在内皮细胞间应力和牵引力生成中的作用目前尚不清楚。因此，本文提出了一种基于力学的实验方案，通过将融合的内皮细胞单层暴露于已知的连接蛋白43（Cx43）抑制剂2,5-二羟基查尔酮（查尔酮），并测量该抑制剂对牵引力和细胞间应力的影响，从而探究Cx43对内皮细胞生物力学特性的作用。我们展示了代表性结果，显示在高剂量查尔酮（2 µg/mL）处理下，牵引力和细胞间应力均较对照组有所降低。该方案不仅适用于Cx43，也可用于研究其他缝隙连接，前提是使用相应的特异性抑制剂。我们认为，该方案在心血管和力学生物学研究领域将具有重要应用价值。

引言

研究物理力和力学特性对细胞与组织生理学及病理学影响的领域被称为力学生物学1。在力学生物学中已应用的一些有用技术包括单层应力显微镜和牵引力显微镜。牵引力显微镜可用于计算细胞与基底界面处产生的牵引力，而单层应力显微镜则可用于计算单层细胞内相邻细胞之间产生的细胞间应力2,3,4,5,6。先前方法所得结果表明，细胞产生的机械应力在决定多种细胞过程命运中起着关键作用3,4,5。例如，当一群细胞以集体方式迁移并受到外部机械力作用时，它们可以通过产生牵引力，在一定程度上改变其形态，并使自身极化以沿外加力的方向排列和迁移7,8。牵引力提供了一种可用于评估细胞收缩性的度量指标，其计算依赖于牵引力显微镜技术（TFM）。牵引力显微镜（TFM）首先测定细胞引起的基底形变，然后通过严格基于力学原理的数学计算方法推导出牵引力场。由于计算牵引力的能力已存在较长时间，研究人员已利用TFM揭示了牵引力对多种过程的影响，包括癌症9、伤口愈合10以及工程化心肌组织的评估11。

联合实施TFM和MSM可分为三个必须按以下顺序执行的基本步骤：首先，确定细胞产生的水凝胶形变；其次，从水凝胶形变中反演出牵引力；第三，采用有限元方法计算整个单层细胞内的正应力和剪切应力。为计算凝胶位移，使用自行编写的粒子图像测速（PIV）程序，将含细胞的荧光微球图像与无细胞的参考微球图像进行比较。PIV分析的互相关窗口大小和重叠率分别设定为32 × 32像素和0.5。此时，通过乘以像素-微米转换因子（对于本研究使用的显微镜，该因子为0.65）将像素位移转换为微米，从而获得面内位移。忽略面外位移所引入的误差可忽略不计12,13。在计算出凝胶位移后，可采用两种类型的牵引力测量方式：约束牵引力和非约束牵引力8,14。非约束牵引力提供整个视野范围内的牵引力场（包括有细胞和无细胞区域），而约束牵引力仅提供包含细胞区域的牵引力场14。随后，利用单层细胞应力显微镜（MSM）计算细胞间应力，MSM是牵引力显微镜技术的延伸。MSM的实施基于以下假设：根据牛顿定律，单层细胞在细胞-基底界面施加的局部牵引力必须由细胞-细胞界面间传递的机械力来平衡7,12,13。此处的一个关键假设是，由于单层细胞内的牵引力分布已知，且力平衡不依赖于细胞材料特性，因此可将细胞单层视为一个薄的弹性片层。另一个关键假设是，牵引力由单层内部光学视野范围内的局部细胞间应力平衡，而在远端区域（单层之外）这种力平衡的影响极小13。因此，由细胞间应力、位移或二者组合在单层边界上定义的边界条件对于执行MSM至关重要13。综合上述信息，我们利用MSM进行有限元分析（FEM），通过在单层内每个点旋转应力平面，反演出最大主应力（σmax）和最小主应力（σmin）。随后利用这些主应力计算整个单层内的二维平均正细胞间应力[(σmax + σmin) /2]和二维最大剪切细胞间应力[(σmax - σmin) /2]12,13。该过程在Tambe等人的研究中有更详细的描述12,13

单层应力显微技术（MSM）可用于计算单层细胞内细胞间相互作用产生的细胞间应力6,7,8,12,13这些细胞间应力被认为在组织生长与修复、伤口愈合以及癌症转移过程中具有重要作用12,15,16,17此外，细胞间应力也被认为在内皮细胞迁移和内皮屏障功能中具有重要作用。17,18尽管紧密连接和黏附连接均被认为在内皮细胞间应力的产生与传递中发挥关键作用，但缝隙连接的作用仍不明确。缝隙连接在物理上连接相邻细胞，并为电流和分子提供通路<1 千道尔顿（kDa）的分子量）在相邻细胞间通过19,20,21尽管内皮细胞表达 Cx37、Cx40 和 Cx43 缝隙连接19,22，Cx43 在疾病进展方面 arguably 是最重要的23Cx43重要性的证据在于，小鼠中Cx43基因敲除会导致低血压24 并对血管生成产生不利影响25此外，Cx43 已被证实对细胞迁移和增殖以及动脉粥样硬化的进展具有重要作用18,22,23,24,25.

在本实验方案中，我们采用牵引力显微镜（TFM）和细胞间应力显微镜（MSM）来研究内皮单层细胞在汇合状态下，其内部产生的牵引力和细胞间应力是否会因破坏内皮细胞间隙连接蛋白Cx43而受到影响。我们使用2,5-二羟基查耳酮（chalcone）来破坏Cx43，这是一种已被证实可抑制Cx43表达的分子26。之所以选用chalcone而非siRNA来破坏Cx43，是因为Lee等人此前已有报道表明chalcone能够抑制Cx43的表达26。此外，我们特别关注chalcone对内皮层的影响，因为它还被报道具有抗炎和抗血小板特性，可能用于多种血管病理疾病的预防与治疗26。实验开始一小时后进行chalcone处理，对经chalcone处理的单层细胞连续成像六小时，并使用自行编写的MATLAB程序进行图像处理，以确定牵引力及随后的细胞间应力。实验结果表明，牵引力和细胞间应力总体下降，提示Cx43在内皮细胞生物力学中发挥关键作用。

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方案

1. 制备聚丙烯酰胺（PA）凝胶

  1. 培养皿的制备
    1. 通过将 200 mL 超纯水与 80 µL 乙酸和 50 µL 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯混合，制备结合硅烷溶液。结合硅烷是一种用于对玻璃底培养皿表面进行功能化处理以实现水凝胶附着的溶液。
    2. 在搅拌器上搅拌结合硅烷溶液至少 1 小时。
    3. 用结合硅烷溶液处理培养皿的中心孔，持续 45 分钟。
    4. 移除结合硅烷溶液，并用超纯水冲洗培养皿 2 至 3 次。
    5. 干燥培养皿表面，并在室温下保存以备后续使用。
  2. 水凝胶溶液的制备
    1. 根据表 1，在 15 mL 离心管中混合超纯水、40% 丙烯酰胺和 2% 双丙烯酰胺。
    2. 向水凝胶溶液中加入 80 µL 荧光微球。
    3. 轻轻振荡离心管，使微球与凝胶溶液充分混合。
    4. 将离心管盖轻轻拧紧（不要完全密封），然后放入真空室中。
    5. 在真空室中对凝胶溶液脱气至少 45 分钟。
  3. 水凝胶聚合
    1. 首先向水凝胶溶液中加入 75 µL 10% 过硫酸铵（溶于超纯水中），然后加入 8 µL TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）。
    2. 取 24 µL 水凝胶溶液置于培养皿中央（见表 2）。
    3. 使用 18 mm 盖玻片压平水凝胶，使其厚度约为 100 µm。
    4. 静置至少 30 至 40 分钟，使凝胶完成聚合。
    5. 将聚合完成的水凝胶浸入超纯水中，防止其脱水。
    6. 用铝箔包裹培养皿，防止荧光微球发生光漂白，并将培养皿储存在 4 °C 环境中。
      注意：水凝胶最多可储存 3 个月，但建议在制备后 1 周内使用，以获得最佳实验结果。

2. 细胞培养

  1. 在37 °C、5% CO2条件下，将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养于添加了1%青霉素-链霉素的200号细胞培养基（见材料表）中，培养瓶预先用0.1%明胶包被。

3. 微型图案掩模制备

  1. 在100 mm培养皿中浇注一层薄的聚二甲基硅氧烷（PDMS），将硅胶基质与固化剂按20:1（基质:固化剂）的比例混合。
    注意：也可使用其他基质与固化剂比例（例如10:1或30:1）。然而，较低的基质/固化剂比例将得到更硬的材料，而较高的比例则会产生更柔软的材料。
  2. 在50 mL离心管中配制20:1（基质:固化剂）的PDMS溶液，并小心混合。将离心管倒置并剧烈振荡多次，以确保PDMS溶液充分混合，混合不均匀会导致聚合不完全。
  3. 通过在190 × g 条件下离心1分钟，去除上一步引入的气泡。
  4. 将5–6 mL PDMS溶液倒入100 mm培养皿中央，并轻轻晃动培养皿，直至PDMS溶液均匀覆盖整个培养皿表面。
  5. 在50–60 °C条件下过夜固化PDMS。PDMS也可在室温下固化。
  6. 使用打孔器从PDMS膜上切下直径为16 mm的圆形模板。
  7. 使用活检打孔器在PDMS模板上打小孔。本方案使用直径为1.25 mm的活检打孔器。
  8. 将PDMS模板先浸入70%乙醇中2–3分钟进行消毒，吸去多余乙醇后，再置于紫外灯下照射5分钟。

4. 胶原蛋白-I 水凝胶包被

  1. 从水凝胶上移除盖玻片，并吸除多余液体。
  2. 将PDMS模板放置在水凝胶表面。
    注意：可使用镊子对PDMS模板施加轻微压力，以确保PDMS模板与水凝胶表面之间形成防水密封。我们的PDMS模板具有防水性，因此可防止水进入凝胶上表面与PDMS模板下表面之间。此外，无需根据PDMS的刚度调整水凝胶的刚度。
  3. 用浓度为1:1000的磺基琥珀酰亚胺基-6-(4-叠氮-2-硝基苯氨基)己酸酯（sulfo-SANPAH）溶于0.1 M HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）缓冲液中，覆盖水凝胶表面，并置于紫外灯（功率36 W）下照射8分钟。
  4. 吸除多余的sulfo-SANPAH和HEPES溶液，用0.1 M HEPES缓冲液冲洗水凝胶两次，再用超纯水额外冲洗两次。
  5. 吸除多余超纯水，并在4 °C条件下，将水凝胶与0.1 mg/mL I型胶原蛋白共同孵育过夜。
  6. 盖上培养皿，并避免荧光微珠发生光漂白。
    注意：PDMS模板用于构建微图案化单层细胞。由于微图案化单层可使每次实验中同时观察多个具有相同几何形状和尺寸的单层结构，因此被广泛采用。然而，若无需微图案，可省略步骤4.2，其余步骤照常进行。

5. 在水凝胶上构建 HUVEC 单层

  1. 在培养箱中使用 1x 胰蛋白酶消化细胞 3–5 分钟，使细胞从组织培养瓶上脱落。
  2. 消化完成后，向胰蛋白酶溶液中加入细胞培养基，并转移至 15 mL 离心管中。
  3. 将细胞悬液在 1710 × g 条件下离心 3 分钟。离心管底部应可见少量白色细胞沉淀。
  4. 吸除上清液，用培养基重悬细胞，调整细胞浓度至 50 × 104 个细胞/mL。
  5. 从水凝胶中去除 I 型胶原蛋白，并用 PBS 洗涤 1 次。
  6. 将 75 × 103 个细胞加至 PDMS 模板表面，在 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育至少 1 小时，使细胞贴附于水凝胶表面。
  7. 移除 PDMS 模板，并向培养皿中加入至少 2 mL 培养基。将 PDMS 模板浸入 10x 胰蛋白酶中以去除残留贴壁细胞，并用 70% 乙醇喷洒消毒，随后置于紫外灯下照射 5 分钟进行灭菌。
  8. 将培养皿放入培养箱中，继续培养至少 36 小时，或直至观察到融合的单层细胞。

6. 2,5-二羟基查尔酮处理以破坏 Cx43

  1. 将2,5-二羟基查尔酮（查尔酮）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成0.1875 mg/mL的储备液。
  2. 用细胞培养基稀释储备液，分别配制低浓度查尔酮溶液（0.2 µg/mL）和高浓度查尔酮溶液（2 µg/mL）的分装液。

7. 数据采集

  1. 使用显微镜定位细胞岛。
  2. 采集相位差图像和微珠图像，分别用于观察细胞形态和水凝胶位移。
    注意：本方案使用10倍物镜进行数据采集。
  3. 实验结束时，用10倍胰蛋白酶消化使细胞脱离，并采集无细胞的凝胶表面图像（参考图像）。

8. 免疫染色

  1. 用4%多聚甲醛固定单层细胞，并在37 °C下孵育15分钟。
  2. 去除4%多聚甲醛，加入0.2% Triton X-100，在37 °C下作用5分钟以通透细胞。
  3. 去除0.2% Triton X-100，用PBS清洗单层细胞2至3次。
  4. 用2%牛血清白蛋白（BSA）溶液覆盖单层细胞，在37 °C下孵育45分钟。
  5. 去除2% BSA溶液，用PBS清洗单层细胞2至3次。
  6. 加入Cx43一抗，稀释比例为1:400，于4 °C孵育过夜。
  7. 去除一抗，用PBS清洗样品2至3次。
  8. 加入二抗，稀释比例为3:200，在37 °C下孵育2小时。
    注意：样品应避光，以防荧光淬灭。
  9. 去除二抗，用PBS清洗2至3次。
  10. 用封片剂（Fluromount-G DAPI）覆盖样品，并用18 mm盖玻片封片。

9. 牵引力显微镜（TFM）与单层应力显微镜（MSM）的实施

  1. 水凝胶形变计算
    注：以下提供了使用 MATLAB 进行位移计算的逐步操作流程。
    1. 在 MATLAB 中打开主文件 traction.m（所有 MATLAB 程序详见补充材料）。
      注：请按照代码中提供的说明设置 MATLAB 目录。
    2. 定义以下变量：图像格式、像素到微米的转换系数、杨氏模量、泊松比和显微镜物镜。
    3. 使用 OpenFiles 子程序定位珠粒图像、胰蛋白酶处理图像和相差图像。
      注：对于大型数据集，最好将文件按顺序命名。例如，文件应命名为 "filename1.tif"、"filename2.tif" 等。
    4. 在细胞单层周围定义一个方形感兴趣区域（ROI），并执行 cell_cropper 子程序以裁剪原始图像。
    5. 执行 displacement_finder 子程序以计算位移。
    6. 执行 Dedrift 子程序以消除可能由显微镜载物台漂移引起的非细胞来源的额外位移。
  2. 牵引力计算
    注：此处使用我们自编的 MATLAB 程序计算无约束牵引力。以下为使用前述 MATLAB 程序进行牵引力计算的逐步说明。
    1. 在 traction.m 程序中定义以下变量：边界条件、凝胶厚度、凝胶高度和去漂移选项。
    2. 执行 traction_finder 子程序以计算牵引力，并执行 plot_traction 子程序以绘制牵引力图。所有 x 方向（Tx）和 y 方向（Ty）的牵引力及其对应的像素位置将被保存在一个由程序生成的 traction.dat 文件中。
  3. 细胞间应力计算
    注：以下为使用前述 MATLAB 程序进行细胞间应力计算的逐步说明。
    1. 执行 mark_circular_domain 子程序以标定单层边界。该程序将依次提示用户对所有已裁剪的相差图像手动绘制单层周围的边界。请记录命令窗口中生成的 nXPts 数值，并在后续有限元分析中将其作为 X 轴和 Y 轴的网格参数使用（见步骤 9.3.2）。
    2. 执行 Run_StressCode 以计算细胞间应力。该子程序将直接从 "model.in" 文件读取参数，并运行 "island.exe" 执行有限元分析（FEM）。在运行此程序前，请确保 model.in 文件中的所有参数均已正确设置，包括 X 和 Y 方向的网格参数、像素到微米的转换系数、凝胶的杨氏模量、泊松比、单层高度以及单层模式（条带或孔状）。
    3. 使用 plot_FEM_results 子程序绘制所有有限元分析结果。
      注：所有生成的结果将自动保存在 MATLAB 目录下的 Results 文件夹中。

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结果

在查尔酮处理前30分钟（图1A-C）和处理后2小时（图1D-F）分别采集了对照组、0.2 µg/mL和2 µg/mL查尔酮处理的单层细胞的相差图像。与对照组HUVEC单层细胞（图2D）相比，在低剂量和高剂量查尔酮处理条件下，细胞引起的微珠位移（µm）均有所减少（图2E,F）。在查尔酮处理前，所有条件下的均方根牵引力均约为51 ± 8 Pa（图3A-C）。查尔酮处理后，低剂量查尔酮处理的单层细胞中均方根牵引力略有增加，达到59 ± 11 Pa（图3

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讨论

我们课题组及其他研究团队已成功应用薄膜力显微技术（TFM）和显微应力显微技术（MSM），在体外研究细胞间连接对多种病理及生理过程中细胞行为的影响7,15,18,27。例如，Hardin 等人开展了一项极具洞察力的研究，表明细胞间应力的传递可引导内皮细胞中旁细胞间隙的形成15。尽管我们在此报道的与Cx43相关的改变可能与Hardin等人所报道的变化存在关联，但本实验方案并未专门探讨旁细胞间隙的形成。本文中，我们提出了一种基于力学的实验方法，专门针对缝隙连接蛋白Cx43，以研究其对内皮细胞生物力学特性的影响。

为了确保本实验方案的成功，我们克服了一些挑战，其中部分挑战可能在其他研究人员采用本方案进行类似研究时同样出现。主要挑战之一是确定一个最佳的查尔酮剂量范围，既能抑制 Cx43 的表...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了中佛罗里达大学启动资金以及美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所资助项目K25HL132098的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
18 mm 盖玻片ThermoFisher18CIR-1用于压平聚丙烯酰胺凝胶
2% 双丙烯酰胺BIO-RAD1610143聚丙烯酰胺凝胶的组分
2′,5′-二羟基查尔酮SIGMAIDF00046用于破坏 Cx43 结构
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯SIGMA2530-85-0用于与乙酸和超纯水配制结合硅烷混合液的储备液
40% 丙烯酰胺BIO-RAD1610140聚丙烯酰胺凝胶的组分
乙酸Fisher-Scientific64-19-7用于配制结合盐溶液
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG；ThermoFisher目录号 A-11001二抗
过硫酸铵BIO-RAD1610700聚丙烯酰胺凝胶聚合剂
牛血清白蛋白 (BSA)SIGMA9048-46-8用于配制封闭液
牛 I 型无端胶原溶液，3 mg/mL，100 mLAdvance Biomatrix5005-100ML用作细胞外基质
Corning 细胞培养用磷酸盐缓冲液 (1x)Fisher-Scientific21040CV细胞培养所需的缓冲盐液
二甲基亚砜，Fisher BioReagentsFisher-Scientific67-68-5用于溶解查尔酮并配制储备液
含 DAPI 的 Fluoromount-GThermoFisher00-4959-52用于 DAPI 染色的免疫荧光封片介质
荧光羧基修饰微球珠ThermoFisherF88120.5 微米羧基修饰珠（红色），2% 固含量
HEPES 缓冲液 1 MSIGMA7365-45-9必需试剂
LVESThermoFisherA1460801HUVEC 细胞培养基 200 的必需补充剂
Medium 200ThermoFisherM200500HUVEC 细胞培养的必需培养基
小鼠单克隆 Cx43 抗体 (CX-1B1)ThermoFisher目录号 13-8300Cx43 的一抗
培养皿（直径 35 mm）CellVisD35-20-1.5H直径 35 mm 培养皿，带 20 mm 中心孔
Sulfo-SANPAH 交联剂 100 mgProteochem102568-43-4用于功能化聚丙烯酰胺凝胶表面的关键试剂
SYLGARD 184 硅弹性体试剂盒DOW corning2646340含固化剂的硅弹性体，用于制备 PDMS
TEMEDBIO-RAD1610801聚丙烯酰胺凝胶聚合剂
Triton-X 100SIGMA9002-93-1用于细胞通透处理
胰蛋白酶-EDTAThermoFisher25300054用于细胞解离

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