本文介绍了一种基于力学的实验方案，用于破坏缝隙连接蛋白 connexin 43，并通过观测细胞牵引力和细胞间应力，评估其对内皮细胞生物力学特性的影响。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
内皮细胞已被证实能够产生细胞间应力和牵引力，但缝隙连接在内皮细胞间应力和牵引力生成中的作用目前尚不清楚。因此，本文提出了一种基于力学的实验方案，通过将融合的内皮细胞单层暴露于已知的连接蛋白43（Cx43）抑制剂2,5-二羟基查尔酮（查尔酮），并测量该抑制剂对牵引力和细胞间应力的影响，从而探究Cx43对内皮细胞生物力学特性的作用。我们展示了代表性结果，显示在高剂量查尔酮（2 µg/mL）处理下，牵引力和细胞间应力均较对照组有所降低。该方案不仅适用于Cx43，也可用于研究其他缝隙连接，前提是使用相应的特异性抑制剂。我们认为，该方案在心血管和力学生物学研究领域将具有重要应用价值。
引言
研究物理力和力学特性对细胞与组织生理学及病理学影响的领域被称为力学生物学1。在力学生物学中已应用的一些有用技术包括单层应力显微镜和牵引力显微镜。牵引力显微镜可用于计算细胞与基底界面处产生的牵引力，而单层应力显微镜则可用于计算单层细胞内相邻细胞之间产生的细胞间应力2,3,4,5,6。先前方法所得结果表明，细胞产生的机械应力在决定多种细胞过程命运中起着关键作用3,4,5。例如，当一群细胞以集体方式迁移并受到外部机械力作用时，它们可以通过产生牵引力，在一定程度上改变其形态，并使自身极化以沿外加力的方向排列和迁移7,8。牵引力提供了一种可用于评估细胞收缩性的度量指标，其计算依赖于牵引力显微镜技术（TFM）。牵引力显微镜（TFM）首先测定细胞引起的基底形变，然后通过严格基....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 制备聚丙烯酰胺（PA）凝胶
- 培养皿的制备
- 通过将 200 mL 超纯水与 80 µL 乙酸和 50 µL 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯混合，制备结合硅烷溶液。结合硅烷是一种用于对玻璃底培养皿表面进行功能化处理以实现水凝胶附着的溶液。
- 在搅拌器上搅拌结合硅烷溶液至少 1 小时。
- 用结合硅烷溶液处理培养皿的中心孔，持续 45 分钟。
- 移除结合硅烷溶液，并用超纯水冲洗培养皿 2 至 3 次。
- 干燥培养皿表面，并在室温下保存以备后续使用。
- 水凝胶溶液的制备
- 根据表 1，在 15 mL 离心管中混合超纯水、40% 丙烯酰胺和 2% 双丙烯酰胺。
- 向水凝胶溶液中加入 80 µL 荧光微球。
- 轻轻振荡离心管，使微球与凝胶溶液充分混合。
- 将离心管盖轻轻拧紧（不要完全密封），然后放入真空室中。
- 在真空室中对凝胶溶液脱气至少 45 分钟。
- 水凝胶聚合
- 首先向水凝胶溶液中加入 75 µL 10% 过硫酸铵（溶于超纯水中），然后加入 8 µL....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在查尔酮处理前30分钟（图1A-C）和处理后2小时（图1D-F）分别采集了对照组、0.2 µg/mL和2 µg/mL查尔酮处理的单层细胞的相差图像。与对照组HUVEC单层细胞（图2D）相比，在低剂量和高剂量查尔酮处理条件下，细胞引起的微珠位移（µm）均有所减少（图2E,F）。在查尔酮处理前，所有条件下的均方根牵引力均约为51 ± 8 Pa（图3A-C）。查尔酮处理后，低剂量查尔酮处理的单层细胞中均方根牵引力略有增加，达到59 ± 11 Pa（图3
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们课题组及其他研究团队已成功应用薄膜力显微技术（TFM）和显微应力显微技术（MSM），在体外研究细胞间连接对多种病理及生理过程中细胞行为的影响7,15,18,27。例如，Hardin 等人开展了一项极具洞察力的研究，表明细胞间应力的传递可引导内皮细胞中旁细胞间隙的形成15。尽管我们在此报道的与Cx43相关的改变可能与Hardin等人所报道的变化存在关联，但本实验方案并未专门探讨旁细胞间隙的形成。本文中，我们提出了一种基于力学的实验方法，专门针对缝隙连接蛋白Cx43，以研究其对内皮细胞生物力学特性的影响。
为了确保本实验方案的成功，我们克服了一些挑战，其中部分挑战可能在其他研究人员采用本方案进行类似研究时同样出现。主要挑战之一是确定一个最佳的查尔酮剂量范围，既能抑制 Cx43 的表.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了中佛罗里达大学启动资金以及美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所资助项目K25HL132098的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 mm 盖玻片 | ThermoFisher | 18CIR-1 | 用于压平聚丙烯酰胺凝胶 |
| 2% 双丙烯酰胺 | BIO-RAD | 1610143 | 聚丙烯酰胺凝胶的组分 |
| 2′,5′-二羟基查尔酮 | SIGMA | IDF00046 | 用于破坏 Cx43 结构 |
| 3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯 | SIGMA | 2530-85-0 | 用于与乙酸和超纯水配制结合硅烷混合液的储备液 |
| 40% 丙烯酰胺 | BIO-RAD | 1610140 | 聚丙烯酰胺凝胶的组分 |
| 乙酸 | Fisher-Scientific | 64-19-7 | 用于配制结合盐溶液 |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG； | ThermoFisher | 目录号 A-11001 | 二抗 |
| 过硫酸铵 | BIO-RAD | 1610700 | 聚丙烯酰胺凝胶聚合剂 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | 用于配制封闭液 |
| 牛 I 型无端胶原溶液，3 mg/mL，100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | 用作细胞外基质 |
| Corning 细胞培养用磷酸盐缓冲液 (1x) | Fisher-Scientific | 21040CV | 细胞培养所需的缓冲盐液 |
| 二甲基亚砜，Fisher BioReagents | Fisher-Scientific | 67-68-5 | 用于溶解查尔酮并配制储备液 |
| 含 DAPI 的 Fluoromount-G | ThermoFisher | 00-4959-52 | 用于 DAPI 染色的免疫荧光封片介质 |
| 荧光羧基修饰微球珠 | ThermoFisher | F8812 | 0.5 微米羧基修饰珠（红色），2% 固含量 |
| HEPES 缓冲液 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | 必需试剂 |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | HUVEC 细胞培养基 200 的必需补充剂 |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | HUVEC 细胞培养的必需培养基 |
| 小鼠单克隆 Cx43 抗体 (CX-1B1) | ThermoFisher | 目录号 13-8300 | Cx43 的一抗 |
| 培养皿（直径 35 mm） | CellVis | D35-20-1.5H | 直径 35 mm 培养皿，带 20 mm 中心孔 |
| Sulfo-SANPAH 交联剂 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | 用于功能化聚丙烯酰胺凝胶表面的关键试剂 |
| SYLGARD 184 硅弹性体试剂盒 | DOW corning | 2646340 | 含固化剂的硅弹性体，用于制备 PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | 聚丙烯酰胺凝胶聚合剂 |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | 用于细胞通透处理 |
| 胰蛋白酶-EDTA | ThermoFisher | 25300054 | 用于细胞解离 |
参考文献
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrate....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
