干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

摘要

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。

摘要

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个全球性的健康问题。全球有超过3.5亿人受其影响，HBV感染仍是肝癌的首要病因，这在发展中国家尤为令人关注。免疫系统未能对HBV产生有效的免疫应答，会导致慢性感染。尽管已有HBV疫苗并正在开发新型抗病毒药物，清除病毒储存细胞仍是当前重要的健康课题。本文介绍一种由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的病毒抗原（Ag）特异性CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）（即iPSC-CTLs）的生成方法，这类细胞具有抑制HBV复制的能力。通过将HBV表达质粒pAAV/HBV1.2经水动力注射导入小鼠肝脏，可有效诱导HBV复制。随后过继转移HBV表面抗原特异性的鼠源iPSC-CTLs，可显著抑制肝脏和血液中的HBV复制，并阻止肝细胞中HBV表面抗原的表达。该方法展示了经水动力注射后小鼠体内HBV的复制情况，以及干细胞来源的病毒抗原特异性CTLs对HBV复制的抑制作用。本实验方案为HBV免疫治疗提供了一种有效的研究方法。

引言

急性感染后，适应性免疫系统（即体液免疫和细胞免疫）可控制大部分与乙型肝炎病毒（HBV）相关的急性肝炎。然而，在HBV流行地区，仍有部分人群无法清除病毒，进而转变为慢性感染者。全球超过25%的慢性患者（>2.5亿人）会发展为进行性肝病，最终导致肝硬化和/或肝细胞癌（HCC）¹。因此，彻底清除持续感染的细胞仍然是一个重大的公共卫生问题，尽管目前已存在有效的疫苗²，且多种抗病毒药物正在研发中。HBV感染的标准治疗包括干扰素-α（IFN-α）、核苷类似物和核苷酸类似物。这些药物具有直接抗病毒活性以及免疫调节能力。然而，在接受治疗的患者中，仅有约20%出现HBe抗原（Ag）⁺向抗-HBe抗体（Ab）的血清学转换，并伴随血清HBV脱氧核糖核酸 （DNA）的消失；而通过HBsAg清除所证实的完全免疫学控制率则不超过5%³。此外，治疗应答通常难以持久。使用重组HBsAg进行的预防性疫苗接种在防止感染方面高度有效，但以HBsAg为基础的治疗性疫苗却未能奏效。显然，T细胞介导的免疫应答在控制HBV感染及肝脏损伤中起着关键作用；但在慢性肝炎患者中，HBV特异性T细胞常被清除、功能失调或进入耗竭状态^4,5,

方案

所有动物实验均经德克萨斯农工大学机构动物护理和使用委员会批准&M大学动物护理委员会（IACUC；#2018-0006）批准，并遵循实验室动物护理评估与认证协会的指南进行。实验使用6至9周龄的小鼠。

1. 由iPSCs生成病毒抗原特异性CD8⁺ T细胞（iPSC-CD8⁺ T细胞）

1. 逆转录病毒载体的构建
   注意：TCR α 和 β 基因通过 2A 自剪切序列连接。逆转录病毒载体 MSCV-IRES-DsRed（MiDR）为 DsRed⁺²³。
   1. 将针对 HBs_183-191（FLLTRILTI）表位、由 HLA-A2 限制性人-鼠嵌合 TCR（s183 TCR）基因（Vα34 和 Vβ28）亚克隆至 MiDR 载体中，构建 s183 MiDR 载体（图 1A）²⁵。
2. 逆转录病毒转导
   注意：Platinum-E（Plat-E）细胞用于包装携带 s183 TCR 基因的逆转录病毒，该病毒将用于后续的逆转录病毒转导。....

结果

如图所示，HBV 病毒抗原特异性的 iPSC-CD8⁺ T细胞通过体外培养系统生成。在将这些病毒抗原特异性的iPSC-CD8进行过继性细胞转移（ACT）后⁺ T细胞在小鼠模型中显著抑制HBV复制补充文件 1）。小鼠iPSC通过MIDR逆转录病毒载体转导，该载体编码人-鼠嵌合HBV TCR基因（HBs_183-191特异性，s183），然后在存在重组Flt3L（rFlt3L）和重组IL-7（rIL-7）的条件下，将基因转导的iPSCs与表达Notch配体（DL1和DL4）分子的OP9-DL1/DL4细胞共培养。体外共培养第28天时，iPSC来源的细胞显著表达CD3和抗原特异性TCR（T细胞标志物）。通过流式细胞术分析CD3⁺CD8⁺ 群体结果显示，HBV TCR 转导显著增加了病毒s183特异性CD8⁺ T细胞（图1).

在体外共培养的第28天，分离CD4

讨论

本方案介绍了一种生成病毒抗原特异性诱导多能干细胞来源的细胞毒性T淋巴细胞（iPSC-CTL）的方法，用于在小鼠模型中通过过继性细胞治疗（ACT）抑制乙型肝炎病毒（HBV）的复制。在慢性HBV感染过程中，病毒基因组会形成一种稳定的迷你染色体，即共价闭合环状DNA（cccDNA），可在肝细胞的整个生命周期中持续存在。靶向清除这种病毒迷你染色体可能实现慢性HBV感染的治愈。目前的抗病毒治疗主要靶向病毒逆转录酶，但极少能够有效建立针对cccDNA驱动的HBV复制的免疫控制。HBV特异性的CD8⁺ CTL能够介导感染肝细胞的杀伤，并加速cccDNA的清除。然而，在慢性HBV感染患者中，HBV特异性CTL常被清除、功能失调或陷入耗竭状态。使用HBV特异性CTL进行过继性细胞治疗是治疗慢性HBV感染的一种理想策略^28,29。初始T细胞或中央记忆T细胞来源的T淋巴细胞（即具有高度反应性的免疫细胞）是ACT疗法的理想效应细胞，因其具有强大的增殖能力、相较于终末分化细胞更低的凋亡倾向，以及对稳态细胞因子优异的响应能力。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HHD 小鼠	法国巴黎巴斯德研究所		H-2 I 类基因敲除、HLA-A2.1 转基因（HHD）小鼠
iPS-MEF-Ng-20D-17	理化学研究所细胞库	APS0001
SNL76/7	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	SCRC-1049
OP9	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	CRL-2749
pAAV/HBV1.2 质粒	陈培哲博士（中国台湾大学医院，中国台湾）		HBV DNA 构建体
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI) 特异性 TCR 基因	Adam J Gehring 博士（加拿大多伦多综合医院研究所，多伦多）		FLLTRILTI 特异性、A2 限制性人-鼠嵌合 TCR 基因（Vα34 和 Vβ28）
OVA257–264 特异性 TCR 基因	Dario A. Vignali 博士（美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学）		SIINFEKL 特异性、H-2Kb 限制性 TCR 基因
抗 CD3（17A2）抗体	Biolegend	100236
抗 CD44（IM7）抗体	BD Pharmingen	103012
抗 CD4（GK1.5）抗体	Biolegend	100408
抗 CD8（53-6.7）抗体	Biolegend	100732
抗 IFN-γ（XMG1.2）抗体	Biolegend	505810
抗 TNF-α（MP6-XT22）抗体	Biolegend	506306
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
抗 HBs 抗体	Thermo Fisher	MA5-13059
ACK 裂解缓冲液	Lonza	10-548E
布雷菲德菌素 A	Sigma	B7651
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
FBS	Hyclone	SH3007.01
FACSAria Fusion 细胞分选仪	BD	656700
明胶	MilliporeSigma	G9391
GeneJammer	Agilent	204130
HLA-A201-HBs183-91-PE 五聚体	Proimmune	F027-4A - 27
HRP 标记抗小鼠二抗	Invitrogen	A27025
mFlt-3L	Peprotech	250-31L
mIL-7	Peprotech	217-17
核酸酶 S7	Roche	10107921001
多聚甲醛	MilliporeSigma	P6148-500G	注意：致敏性、致癌性、有毒
破膜缓冲液	Biolegend	421002
聚凝胺	MilliporeSigma	107689
含 DAPI 的 ProLong™ Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36931
QIAamp MinElute 病毒旋转柱试剂盒	Qiagen	57704