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单分子Förster共振能量转移方法实时研究GEN1对Holliday连接体的解析

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DOI：

10.3791/60045

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2019年9月18日

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1Laboratory of DNA Replication and Recombination, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用单分子荧光共振能量转移（smFRET）研究Holliday连接体（HJ）解离的实验方案。通过双色交替激发法测定解离常数，随后在实时切割实验中应用单色时间序列smFRET，以获得HJ解离前的停留时间分布。

摘要

整体方法用于测量分子集合的行为，其中底层反应步骤的单个反应速率在整个群体中被平均化。单分子荧光共振能量转移（smFRET）能够实时记录单个分子发生的构象变化。因此，smFRET在测量酶或底物在结合与催化过程中发生的结构变化方面具有强大能力。本文提供了一种单分子成像实验方案，用于研究四向Holliday连接体（HJ）与缺口内切酶I（GEN1）——一种细胞质同源重组酶——之间的相互作用。同时提供了单色和双色交替激发（ALEX）smFRET实验方案，用于实时追踪GEN1对HJ的解析过程。本研究在HJ位点上确定了GEN1二聚化的动力学特征，该过程被认为在HJ的解析中起关键作用，但此前一直难以阐明。此处描述的技术可广泛应用于多种酶-DNA体系，以获得重要的机制性见解。

引言

基于荧光检测的单分子方法具有高信噪比1。FRET 是一种光谱学技术，可测量 1–10 nm 范围内的距离，因此该技术可作为分子尺用于测定纳米尺度的距离2,3。受体的吸收光谱与供体在短波长端的发射光谱存在部分光谱重叠。FRET 通过供体与受体之间的无辐射能量转移实现，其能量转移效率取决于受体与供体之间的距离和相对取向4。

已采用多种方法来降低背景信号并提高荧光信号的检测效率5,6。其中一种方法是共聚焦显微镜技术，该技术通过小孔将激发光斑限制在低于衍射极限的尺寸7。另一种方法是全内反射荧光（TIRF）技术，这是一种宽场照明技术，其将光线以超过临界角的角度偏轴入射8。光线随后在玻璃与水溶液界面处发生全内反射，产生倏逝波，仅激发附着在玻璃表面的荧光分子，从而避免溶液中其他位置荧光分子产生的背景信号。

在共聚焦显微镜中，分子可以是自由扩散的，也可以是固定在表面的。其达到的时间分辨率可在微秒至数毫秒范围内9。对单个分子的共聚焦检测是通过单光子雪崩二极管（SPAD）对感兴趣区域进行逐点扫描来实现的10。在全内反射荧光显微镜（TIRF）中，通过位置敏感的二维电荷耦合探测器（CCD）记录固定在表面上的数百个分子的时间序列图像。CCD通过增强型磷光屏与微通道板，或通过片上光电子倍增（EMCCD）来放大荧光信号。其时间分辨率取决于CCD的读出速度和量子效率，通常在几十毫秒量级6。

HJ 是 DNA 修复和重组过程中的一个中心中间体11,12,13,14。HJ 包含两条连续链和两条交叉链，交叉链在连续链之间连接，但彼此不相交。在溶液中，HJ 以 X 型堆叠构象存在，其连续链与交叉链在不同构象之间持续发生异构化转换15。HJ 的异构体偏好取决于核心序列和离子环境，已有大量研究通过 FRET 技术对此进行了深入探讨16,17,18,19。

GEN120 在溶液中是一种单体蛋白21，需要形成二聚体才能切割HJ，从而实现重组链的正确分离22,23。HJ的堆积构象偏好通过决定HJ解离酶切割的方向性，影响遗传重组的结果24。关于GEN1如何结合HJ、协调两次切割以及确保其完全解析的机制，目前均已受到广泛深入的研究21,22,23,25,26,27,28,29,30。

本研究采用基于物镜的全内反射荧光（TIRF）装置，方法如前所述31。通过双色交替激发（ALEX）技术，检测GEN1与荧光标记的HJ相互作用时发生的构象变化。ALEX可根据两个比率参数生成二维直方图：一个是依赖于供体-受体距离的FRET效率E，另一个是反映供体-受体化学计量关系的化学计量参数S32。ALEX能够根据荧光染料的化学计量比对荧光物种进行分类，包括仅含供体、仅含受体以及混合亚群。ALEX可将FRET的应用扩展至全范围，能够检测荧光染料亮度差异和寡聚化状态，并可用于监测大分子与配体之间的相互作用33。

研究发现，GEN1 能够在其与 HJ 复合物的寿命内持续成功解析 HJ。时间依赖性的构象变化源自单个分子的时间轨迹，而直方图则反映了底层群体的分布情况。通过时间延隔单色 FRET 实验，证实了 GEN1 二聚体具有较快的结合速率和较慢的解离速率，这增强了组装后的 GEN1 二聚体在首次切割产物处的亲和力。

方案

1. 表面功能化盖玻片的制备

  1. 清洗
    1. 将五片盖玻片（24 mm × 60 mm）放入盛有乙醇的考林瓶（Coplin jar）中，先在乙醇中超声处理，然后在1 M氢氧化钾溶液中超声处理30分钟，重复3次。用丙酮洗涤3次后倾去溶剂。
  2. 硅烷化
    1. 配制2.8%的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）丙酮溶液。用石蜡膜密封APTES瓶口，并于4 °C保存。
      注意：操作时需佩戴护目镜，并在通风橱中进行。在将硅烷溶液倒入考林瓶前后，盛装硅烷溶液的容器必须完全干燥，并立即用丙酮冲洗干净。
    2. 将70 mL的2.8% APTES溶液倒入装有盖玻片的考林瓶中，在轨道摇床中振荡4分钟。
    3. 将考林瓶静置于实验台上5分钟，超声处理1分钟，最后再静置10分钟，使硅烷与玻璃表面的羟基充分反应。
    4. 通过直接向考林瓶中加入1 L去离子水终止反应，实现快速溶剂置换。将考林瓶在平面上横向振荡，用水冲洗盖玻片3次。
    5. 将盖玻片从瓶中取出，放置于铝箔托盘上。在110 °C烘箱中烘烤30分钟，以干燥盖玻片并固化硅烷层。将托盘置于实验台上，使盖玻片冷却至室温。
  3. 聚乙二醇化（PEGylation）
    1. 将储存于-20 °C的生物素化PEG和普通PEG恢复至室温（RT），以防止打开容器时因温差导致水分冷凝。
    2. 将五片硅烷化表面朝上的盖玻片放置于一个盒子上。沿硅烷化盖玻片边缘放置两片22 mm × 22 mm的普通盖玻片作为间隔物。
    3. 待溶液升温后，在1 mL新鲜的0.1 M碳酸氢钠溶液中，按约1:100的比例配制生物素化PEG与普通PEG的混合溶液，即向1.5 mL离心管中加入1.5 mg生物素化PEG和150 mg普通PEG。
    4. 涡旋振荡离心管以溶解PEG，并短暂离心以去除气泡。
      注意：从本步骤开始操作需迅速，因为PEG在溶液中数分钟内即发生水解。
    5. 迅速将100 µL PEG溶液滴加至每片盖玻片表面。取另一片已烘烤过的盖玻片，将其硅烷化面朝下覆盖在含有PEG溶液的盖玻片上，形成“玻璃-溶液-玻璃”三明治结构，其中22 mm × 22 mm的非硅烷化盖玻片作为间隔物，便于后续分离两片功能化盖玻片。
    6. 将盖玻片在避光、室温条件下孵育过夜（16小时）。孵育结束后，小心分离盖玻片，然后用去离子水侧向冲洗10次（使用洗瓶冲洗）。
    7. 在干燥氮气流下吹干盖玻片，并将干燥后的盖玻片置于真空环境中保存。
      注意：制备好的盖玻片在一个月内使用不会出现性能下降。

2. 流通池的制备

  1. 单通道流动池
    1. 使用直径为1.22 mm的钻头在石英载片（50 mm × 20 mm）的中部钻两个孔，孔中心相距37 mm，距载片边缘6.5 mm（图1A）。
    2. 使用电子切割机在一块50 mm × 20 mm的双面胶膜上切割出一条41 mm × 2.25 mm的通道。
    3. 撕去胶膜保护层的塑料面，将胶膜边缘与石英载片边缘对齐。用聚四氟乙烯镊子轻轻按压，去除夹入的气泡。
    4. 撕去胶膜保护层的纸面，将胶膜贴附到盖玻片的功能化表面。
    5. 将聚乙烯管（内径1.22 mm）剪成11 cm长的进样管和25 cm长的出样管，分别插入先前钻好的孔中，作为流动池的进样口和出样口。
    6. 使用5分钟环氧树脂胶在石英片与盖玻片的接口边缘以及进样和出样管周围进行密封。
    7. 流动池干燥后立即使用，或在干燥真空条件下保存以备后续使用。
    8. 将亲和素溶于PBS中，配制成浓度为0.03 mg/mL的溶液，经0.2 µm注射器滤器过滤。
    9. 使用1 mL注射器将亲和素溶液注入流动池。再用另一支装有缓冲液的注射器冲洗以去除未结合的亲和素。更换注射器时注意避免引入气泡。
  2. 多通道流动池
    1. 在石英载片（76 mm × 25 mm）的两侧长边上各钻六个直径为1.22 mm的孔，孔距边缘4.5 mm，孔间距为9.3 mm。确保每对相对孔的中心间距为15 mm（图1B）。
    2. 使用电子切割机在一块76 mm × 25 mm的双面胶带上切割出六条通道（每条20 mm × 2.25 mm）。
    3. 撕去胶带保护层的塑料面，将胶带边缘与石英载片边缘对齐。用聚四氟乙烯镊子轻轻按压，去除夹入的气泡。
    4. 撕去胶带保护层的纸面，将其贴附到盖玻片的功能化表面。
      注：在多通道流动池中，有时先撕去纸面再将胶带贴附到石英载片上效果更佳。
    5. 为六条通道分别准备进样管（11 cm）和出样管（25 cm），并按照步骤2.1.6–2.1.9的方法组装流动池。
    6. 将第一条通道的出样口连接至泵，将进样口插入装有0.5 mL OSS的离心管中。
      注：选择该长度的进样管是为了在连续流动条件下进行切割实验时，使酶进入流动池的时间与成像开始时间同步，从而最大化切割事件数量，并减少荧光染料的过早漂白。
    7. 通过断开已使用通道的出样口切换至新通道。使用一段用胶密封在塑料部分的注射针头制成的塞子封闭已使用通道的出样口，并封闭其进样口。

3. 氧清除系统（OSS）的制备

  1. 将0.2 g的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（三重态猝灭剂，可最小化荧光染料的闪烁现象）溶解于800 µL甲醇中。
  2. 加入6 mL去离子水2O，并逐滴加入1 N NaOH直至溶解。通过注射器滤器过滤，分装为1 mL等份，于-80 °C保存。储存液浓度约为100 µM。
  3. 将61 mg原儿茶酸（PCA）粉末溶于4 mL ddH₂O中，配制新鲜的原儿茶酸溶液。2O。储备液浓度约为100 nM。
  4. 逐滴加入58 µL的10 N NaOH，每加一滴后充分涡旋，直至苯甲酸完全溶解（pH = 9）。
  5. 将 5.3 mg 原儿茶酸 3,4-双加氧酶（3,4-PCD）溶解于 7 mL PCD 储存缓冲液（表 1）中。3,4-PCD 通过催化原儿茶酸的氧化反应，去除结合/裂解缓冲液中的氧气34.
  6. 将PCD溶液分装成每份1 mL。储备液浓度约为1 µM。用液氮速冻分装液，长期储存置于-80 °C，短期储存置于-20 °C。
  7. 配制新鲜的结合缓冲液（表1）。用 2 mM CaCl 替代2 含 2 mM MgCl2 用于单分子FRET切割实验。
  8. 配制1 mL成像缓冲液（表1将成像缓冲液置于冰上，直至将其加入流动池，以维持氧清除系统的活性。

4. 荧光标记HJ的制备

  1. 将冻干的寡核苷酸重新溶解表 2) 在 Tris-EDTA 缓冲液中表1) 至 100 µM 的浓度。
  2. 通过混合等摩尔量的每种X，各约3 µL，制备合成连接片段0 引物序列见于 表1.
  3. 95 °C 加热 5 分钟后，以 1 °C/分钟的速率缓慢冷却至室温进行退火。可使用加热块或 PCR 热循环仪实现所需的冷却速率。
  4. 将混合物上样至8 cm × 8 cm的10% Tris-硼酸-EDTA聚丙烯酰胺凝胶。施加100 V电压，电泳运行约2小时。条带可肉眼清晰观察，呈紫色。
  5. 用洁净的刀片切下退火底物的条带，将凝胶片段转移至已灭菌的1.5 mL离心管中。
  6. 用干净的推杆在管内将凝胶块碾碎，然后加入100 µL TE100缓冲液（表1).
  7. 在20 °C下以1,500 rpm转速于恒温混匀仪中振荡提取HJ，时间约为2小时，或在4 °C下过夜孵育。
  8. 对含有底物的溶液进行乙醇沉淀35.
  9. 将底物重悬于 20 µL TE100 缓冲液中（表1）。最终浓度为1–3 µM。每管分装 2 µL，于 -20 °C 保存。

5. GEN1 蛋白的表达与纯化

  1. 构建用于表达截短型人源GEN1的质粒1,2,3,4,5 C末端带有六组氨酸标签20 通过入口载体的PCR。
    注意：N端加标签会导致GEN1失活。未结构化的C端尾部使全长GEN1的纯化难度显著增加。此外，已有报道指出，全长GEN1的活性低于截短版本。23.
  2. 将表达载体转化至 E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL 菌株
  3. 将转化后的细胞接种至两个6 L锥形瓶中，每瓶含有2 L LB液体培养基，在37 °C、180 rpm振荡培养，直至OD600 达到0.8时。
  4. 将培养物冷却至 16 °C，并加入 0.1 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导 GEN1 表达，持续 48 小时。
  5. 在 4 °C 下以 1000 × g 离心收集细胞 x g 在离心机中。每升培养物可产生5–6 g 的沉淀物。
  6. 弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于裂解缓冲液中（表1使用每克细胞4 mL的溶液。
  7. 使用细胞破碎仪在30 kPsi条件下进行细胞裂解，然后在10,000 ×g下离心 x g 4 °C下孵育1小时。收集上清液，并在冰上用0.45 µm滤器过滤。
  8. 使用缓冲液A，以2.5 ml/min的流速将滤液通过5 mL Ni-NTA柱，利用FPLC进行蛋白纯化表1).
  9. 用15个柱体积（CV）缓冲液洗涤。使用Buffer A与500 mM咪唑在20个柱体积内进行线性梯度洗脱，收集5 mL馏分。GEN1在约100 mM咪唑时从柱中洗脱出来。
  10. 用移液器从收集的组分中吸取10 µL等分试样，向每份试样中加入等体积的2x SDS上样缓冲液。在90 °C加热5分钟以变性样品，冷却后离心。
  11. 将样品上样至10% Bis-Tris凝胶中，电泳运行30分钟–200 V 条件下电泳 45 分钟。使用考马斯亮蓝染色，然后脱色。收集含有纯化 GEN1 的组分。
  12. 通过使用缓冲液 C 稀释，将合并组分的盐浓度降低至 100 mM（表1).
  13. 将低盐蛋白质以3 mL/min的流速通过5 mL肝素柱，使用缓冲液B表1).
  14. 用10个柱体积的缓冲液洗涤。使用Buffer B和1 M NaCl进行20个柱体积的梯度洗脱。收集5 mL的组分，GEN1在约360 mM NaCl时洗脱。
  15. 按照步骤 5.8 中所述检测洗脱组分中纯化的 GEN1 组分。合并这些组分，并用缓冲液 C 稀释至 100 mM NaCl。
  16. 以1 mL/min的流速，使用缓冲液B将低盐蛋白上样至阳离子交换柱。
  17. 使用缓冲液B和1 M NaCl进行40个柱体积的梯度洗脱。收集1.7 mL的洗脱组分，GEN1在约300 mM NaCl处洗脱。
  18. 按照第5.8步所述，检测洗脱组分中GEN1的纯度。
  19. 合并最纯的组分，并在4 °C下用储存缓冲液透析（表1）。透析过程中至少更换一次缓冲液。
  20. 测定蛋白质浓度约为0.5–1 mg/mL。将透析后的蛋白质以10–15 µL 体积分装于小管中，液氮速冻后于 -80 °C 保存。

6. 单分子FRET实验

注意：单分子FRET实验在之前描述过的自制基于物镜的全内反射荧光（TIRF）装置上进行（图1C）31。

  1. 单色FRET实验
    1. 在100倍TIRF物镜上滴加一滴浸油。将EMCCD设置为合适的增益，以优化信噪比并防止信号饱和。
      注意：在调整激光时，切勿直视激光束，并佩戴防护眼镜。
    2. 小心地将流动池放置在样品架上。使用粗调装置逐渐升高物镜，直至浸油接触盖玻片。
    3. 打开绿色激光（532 nm）。切换至物镜的微调模式。将发射光引导至相机端口，以便在显示器上观察图像。
    4. 调节物镜高度，直至盖玻片的功能化表面在显示器上清晰聚焦并可见。
      注意：EMCCD的图像采集通过声光可调滤波器（AOTF）触发激光激发，以在未采集图像时防止样品发生光漂白。
    5. 在加入荧光标记的HJ之前，检查盖玻片功能化表面的背景信号，确保其不超过少数几个点。
    6. 用TE100缓冲液（表1）将底物储备液稀释约1000倍，终浓度为1–5 nM。将0.2–0.5 µL稀释后的底物加入含OSS的120 µL成像缓冲液中，置于0.5 mL离心管内。
    7. 将流动池的出口连接至注射泵。将流动池的入口管插入1.5 mL离心管中，并以30–50 µL/min的流速运行注射泵，从管中抽出溶液。
    8. 频繁使用绿色激光短暂成像，检查表面是否具有良好的覆盖率（100–300个均匀分布、间距良好的底物分子）。
    9. 若表面覆盖率仍不足，可等待数分钟，使溶液中荧光标记的HJ沉降至表面，或重复流动步骤。
    10. 以30–50 µL/min的流速再注入120 µL成像缓冲液（表1），以洗去未结合的荧光标记HJ。随后让流动池静置5分钟，使OSS耗尽溶解氧。成像开始时，荧光团的光漂白应尽可能最小化。
    11. 设置曝光时间（约60 ms），循环时间将由软件根据数据传输速度自动设定（约104 ms），并指定所需的循环次数或帧数（约400）。供体（Cy3）和受体（Alexa Fluor 647）的发射光通过图像分光装置分为两个颜色通道。
    12. 在表面选择合适区域，通过调节物镜高度对焦图像，并以16位TIFF格式记录并保存视频。
    13. 移动至新区域。
      注意：始终沿单一方向移动（即从出口向入口），以避免重复成像同一区域。
    14. 依次在120 µL成像缓冲液中配制1、2、5、10、25、50、75和100 nM的GEN1溶液。以30–50 µL/min的流速注入溶液。
      注意：若所需测量在稳态条件下进行（如GEN1与HJ的结合或游离HJ的异构化），则在停止流动后等待3–5分钟再开始录制视频。对每个GEN1浓度，在新区域采集三到四个视频。
    15. 若测量在连续流动条件下进行（如GEN1对HJ的切割），则在GEN1进入流动池前5–10秒开始录制。通过在六通道流动池中切换至新通道重复测量。
    16. 实验结束时，使用固定的荧光微珠载玻片，校准图像分光装置中供体与受体信号的位置对应关系。
    17. 将0.2 µL直径为1 µm的荧光微珠加入500 µL的1 M Tris（pH = 8.0）中，使微珠粘附于表面。
    18. 在22 mm × 22 mm双面胶密封垫中央裁剪出一个18 mm × 18 mm的方孔。撕下并将其粘贴至76 mm × 25 mm石英载玻片中央。
    19. 加入50 µL稀释后的微珠溶液，静置5–10分钟使其沉降。在方孔上方覆盖22 mm × 22 mm盖玻片。用纸巾吸干多余溶液，再用环氧树脂密封腔室。
    20. 以60 ms曝光时间采集微珠载玻片的100帧图像。
      警告：将激光功率和EMCCD增益调至最低，以避免探测器饱和。
    21. 安装软件包（如TwoTones），并按照用户手册指示打开视频36。在供体和受体通道中选择单个微珠的位置。按照手册描述生成变换矩阵。
      注意：该软件使用变换矩阵匹配供体和受体通道中粒子的位置，并校正图像分光装置中任何轻微的错位。
    22. 进入文件菜单，点击加载视频，选择视频文件后点击打开。在文件菜单中点击加载TFORM，选择由微珠载玻片生成的变换矩阵。调节供体和受体通道的阈值，直至无假阳性信号出现。
    23. 在通道筛选菜单中，选择D&&A选项，以筛选同时标记供体和受体的粒子。勾选最近邻距离限制，排除彼此过于接近的分子；勾选最大椭圆度，排除高度偏心的分子；勾选宽度限制，排除过宽或过窄的分子。
    24. 按照Twotones手册指示输入plotHistCW命令，以构建直方图。
      注意：“表观”FRET效率由程序计算，即受体发射强度除以供体与受体总发射强度。Twotones使用100个区间对分子状态在FRET效率上的分布进行分箱。
    25. 按照Twotones手册指示输入plotTimetraceCW命令，为每个分子生成时间轨迹。
      注意：时间轨迹可进一步使用vbFRET37分析，以识别不同的FRET状态、各自的停留时间以及不同状态间的转换速率。
  2. 双色交替激发FRET（ALEX）实验
    1. 分别使用绿色和红色激光直接激发，记录由连续帧组成的视频，每帧持续时间约为80 ms，分别对应供体和受体的发射。
    2. 在Twotones中打开采集的ALEX视频。为三个通道设置合适的检测阈值，约为300：供体激发下的供体发射（DexDem）；供体激发下的受体发射（DexAem）；以及直接激发下的受体发射（AexAem）。
    3. 应用通道筛选DexDem&&DexAem&&AexAem，选择同时含有供体和受体的粒子。在三个通道中连接约200–300个粒子。
    4. 使用plotHistALEX MATLAB代码生成ALEX直方图。使用Origin软件38将直方图中的不同峰拟合为高斯函数，并通过曲线下面积确定各群体的百分比。
      注意：结合实验中的峰对应于结合的GEN1-HJ复合物，而在游离HJ中，峰代表相互转换的异构体。
    5. 使用plotTimetraceALEX MATLAB代码为每个分子生成时间轨迹，显示供体直接激发的发射，以及受体因FRET和直接激发产生的发射。
      注意：ALEX时间轨迹可独立显示供体和受体的发射，但时间分辨率低于单色FRET。与单色FRET类似，ALEX时间轨迹可进一步通过vbFRET分析，以识别不同的FRET状态及其各自的停留时间。
    6. 通过将结合群体的百分比随GEN1浓度的变化拟合为双曲线函数，确定解离常数。
  3. 时间延时单色FRET
    1. 将绿色激光的曝光时间设为60 ms，循环时间设为624 ms或更低，具体取决于所观察动力学的速度。
    2. 在六通道流动池的一个通道中设置流速为110 µL/min。在GEN1进入流动池前短暂开始录制。
      注意：连续流动会导致荧光团快速光漂白，因此同步成像起始与蛋白进入可最大化捕获事件数量。最佳注射泵读数取决于死体积和组装流动池所用管道的具体情况；本实验中约为25 µL。
    3. 采集约125帧的视频，总采集时间为78秒。记录结束后，用红色激光照射样品，每帧曝光25 ms，共采集50帧，以探测受体信号。
      注意：该方法通过减少激发循环次数延长了切割实验的观察窗口。二聚化的动力学参数如kon和koff可通过将分布拟合为双指数模型获得30,38。

7. 电泳迁移率变动分析（EMSA）

  1. 在50 µL总体积中，将所需浓度的GEN1与50 pM Cy5标记的HJ在RT下于EMSA结合缓冲液（表1）中孵育30分钟。
  2. 将样品上样至8 cm × 8 cm的6% Tris-硼酸-EDTA凝胶。在RT下，使用1×TBE缓冲液以100 V电泳1小时20分钟。
  3. 根据GEN1浓度下其对相应泳道总荧光强度的相对贡献，确定结合底物的百分比。
    注意：GEN1单体-HJ（条带I）通过其大小与GEN1单体在皮摩尔浓度下与切口HJ结合的结果一致而被确认21,30。GEN1二聚体-HJ被指定为条带II，因其为GEN1单体逐步结合HJ的过程21,23。
  4. 使用以下公式计算表观结合常数Kd-monomer-app-EMSA和Kd-dimer-app-EMSA：
    生化分析中结合亲和力的公式，Y=Max*[GEN1]^n/(Kd-app-EMSA^n+[GEN1]^n)。
    其中：Max为相应物种达到最大结合（单体或二聚体）时的浓度；n为Hill系数；Kd-app-EMSA为相应物种的表观结合常数，表示单体或二聚体达到半最大量时GEN1的浓度。

结果

十字形连接体的构象偏倚与异构化

通过在HJ连接点的两个相邻臂上进行荧光共振能量转移（FRET）标记，已对HJ的异构化进行了广泛研究17,18,39。供体（Cy3）和受体（Alexa Fluor 647）分别位于相邻的两个臂R（链2）和X（链3）上（图2A）。堆叠-X异构体由其两条连续链定义，即Iso(1,3)或Iso(2,4)。相邻标记X0的ALEX FRET直方图显示出两个峰，分别对应于更丰富的Iso(1,3)（E ~0.75）和较少的Iso(2,4)（E ~0.40）之间的转换（图2B）。

单色FRET用于通过减小EMCCD2相机的使用区域，以约10 ms的高时间分辨率获取游离HJ快速构象变化的时间轨迹。X0连接体的一个代表性单色FRET时间轨迹显示了高FRET与低FRET异构体之间的转换（图2B）。由Iso(1,3)和Iso(2,4)的停留时间直方图获得的异构化速率kIso(1,3)-Iso(2,4)和kIso(2,4)-Iso(1,3)（图2C）与先前报道的结果一致17。

SMFRET 显示 GEN1 对 HJ 具有主动的扭曲作用

HJ 在与 GEN1 结合时会发生结构重排22。因此，在 Iso(1,3) 和 Iso(2,4) 两种构象中，供体与受体之间的距离相似（图 3A）。单分子 FRET 结合实验在 Ca2+ 存在条件下进行，以防止 HJ 被切割。通过 ALEX 方法获得了不同 GEN1 浓度下相邻标记 X0 交界处的 FRET 直方图（图 3B）。直方图拟合为两个高斯函数：其中一个对应游离状态的高 FRET Iso(1,3)，另一个对应结合态的 GEN1-HJ 群体，后者通过从低 FRET 峰中扣除 Iso(2,4) 的贡献得到。

在GEN1浓度饱和时，X0的FRET直方图仅显示一个低FRET峰，对应于GEN1结合到HJ任一异构体上的状态，这与模型预测结果一致22。表观摩尔解离常数（Kd-monomer-app）通过将GEN1结合群体百分比随GEN1浓度变化的数据进行双曲线拟合而确定（图3C）。相邻标记的nk-X0代表一种单链切口版本的HJ，模拟了首次切割反应后的产物。由于模拟切口缓解了堆积应变，nk-X0为非异构化结构40，这一点从其在E ~0.40处出现单一底物峰即可明显看出，不同于X0（图3D 与 图3B对比）。GEN1-nk-X0复合物的结构与GEN1-X0复合物相似，这由两者FRET效率的相近性所表明（nk-X0的E值约为0.25，X0为0.32）（图3D 与 图3B对比）。GEN1单体对nk-X0的强结合表现为Kd-monomer-app值比X0低40倍（图3E 与 图3C对比）。这种紧密的结合可能作为一种保护机制，以防GEN1二聚体或其任一单体意外解离时导致HJ未能完全解析。

GEN1 单体逐步结合到 HJ 上

与原核HJ解离酶（在溶液中以二聚体形式存在）不同，真核HJ解离酶GEN1的一个独特特征是其单体首先结合HJ，随后形成二聚体21,23,41。在50 pM X0条件下进行的GEN1的EMSA实验显示，GEN1逐步缔合成更高级别的复合物，如上图中的罗马数字所示（图4A）。通过EMSA测定的GEN1单体解离常数（Kd-monomer-EMSA）与单分子FRET结合实验获得的表观单体解离常数（Kd-monomer-app）一致（分别为图4A和图3C）。通过量化条带II可计算GEN1二聚体的平衡解离常数（Kd-dimer-EMSA）。在50 pM nk-X0条件下进行的GEN1 EMSA实验表明，单体结合显著增强，其表观单体解离常数（Kd-monomer-app-EMSA）极低，比X0条件下的值低30倍，而其二聚体解离常数（Kd-dimer-EMSA）则与X0条件下的值相近（图4B）。

GEN1单体结合并扭曲HJ的进一步证据来自在Mg2+存在且GEN1浓度较低时，观察到大量未切割颗粒呈现出稳定的低FRET状态（图4C）。随着GEN1浓度的增加，此类轨迹的数量减少。HJ的解析由GEN1单体的紧密结合驱动，该结合有助于二聚体的形成。在Mg2+条件下，未切割的nk-X0的时间轨迹中可观察到单体结合现象，该现象可持续至数纳摩尔浓度（图4D）。GEN1单体通过紧密结合作用于保护nk-X0，最终通过二聚体的形成实现完全解析。

HJ 的 SMFRET 分辨率检测

在单分子FRET实验中，“切割”这一术语与HJ的“解析”可互换使用，因为该实验仅能检测到第二次切割事件后产物的释放。这些事件通过延时单色激发进行记录，以尽量减少在约1.3分钟的采集时间内对光敏受体的光漂白。

图 5A 的示意图展示了 GEN1 与固定在功能化玻璃上的 X0 结合并使其发生形变后，对 X0 Iso(1,3) 的第 1 和第 3 条链进行切割的过程。HJ 解离后，供体和受体均进入溶液，导致其信号丢失。在 nk-X0 中，第一次和第二次切割是解耦的，这代表了一类部分解离 HJ 的原型。GEN1 结合后，nk-X0 会形成与 X0 相似的结构。如图 5B 所示，解离过程通过在第 1 条链上发生单次切割进行。

在分辨后的 X0 荧光轨迹中，供体和受体在稳定的低 FRET 状态之后同时解离，且未出现中间 FRET 状态（E = ~0.40），表明完全的分辨过程发生在 GEN1-HJ 复合物的寿命之内（图 5C）。因此，这些结果提示，HJ 的分辨是在 GEN1-HJ 复合物寿命内完成的。nk-X0 的分辨同样在发生结构重排后进行，并以携带两个荧光基团的双链解离而告终（图 5D），与 X0 类似。

GEN1单体结合HJ上GEN1二聚化的动力学

时间延时单分子FRET测量了τbefore-cleavage，该时间主要包括GEN1单体引起HJ结构畸变后，二聚体形成及HJ解离所需的时间。通过应用该技术，提供了直接证据支持以下观点：二聚体的形成是X0和nk-X0解离所必需的，因为τbefore-cleavage 的分布依赖于GEN1的浓度。

HJ 解离的表观速率（kapp）定义为在特定 GEN1 浓度下 τ切割前 均值的倒数。使用“表观”一词来描述 HJ 解离速率，是因为不能排除 GEN1 在 HJ 解离后仍与产物结合的可能性。

X0 的 τ切割前 分布的概率密度函数（PDF）（图6A）反映了二聚体形成的所需时间，在低 GEN1 浓度下该时间较长，而在高 GEN1 浓度下则较短。二聚体的结合与解离速率，即 kon-dimer 和 koff-dimer，由双指数模型确定30。此外，nk-X0 的 PDF（图6B）显示出与 X0 相似的分布，表明其同样需要二聚体的形成。

kapp 随 GEN1 浓度变化的曲线拟合为双曲线函数。X0 和 nk-X0 的表观催化速率常数（kMax-app）分别为 0.107 ± 0.011 s-1 和 0.231 ± 0.036 s-1（图 6C）。由于切口型连接（nicked junction）相较于完整连接（intact junction）具有更快的 kMax-app 和更慢的 kon-dimer，X0 和 nk-X0 连接的 kapp 曲线在 GEN1 浓度约为 5.6 nM 时相交。

综上所述，相对较快的二聚体结合速率（kon-dimer）和较慢的二聚体解离速率（koff-dimer）使得一旦二聚体形成，反应即趋向于向前进行，完成HJ的切割解析。GEN1单体对nk-X0交界处的强结合构成了一种备用机制，可防止任何可能发生的异常中止的第二次切割，或有助于捕获细胞内主要解析通路未能完全处理的残留HJ结构。

全内反射荧光显微镜示意图；流动池装置；双激光激发；二向色镜对准。
图1：单通道与多通道流动池及光学装置布局。
(A) 单通道流动池示意图。(B) 六通道流动池示意图。(C) 光学装置布局，显示激发光源、全内反射荧光物镜、安装在滤光立方体内的二向色镜，以及图像分光装置中使用的发射滤光片。请点击此处查看此图的放大版本。

FRET 分析示意图，包含效率直方图、时间轨迹以及异构体状态的动力学速率常数。
图 2：通过 FRET 观察到的 HJ 构象偏好性及其异构化。
(A) 相邻标记的 X 堆叠 HJ 构象体的异构化，以其两条连续链命名。链已编号，臂则用字母表示。切割位点以箭头标示。供体（绿色）和受体（红色）的位置以及异构化过程中 FRET 的变化均已标明。(B) 右图：在 50 mM Mg2+ 条件下 X0 的 FRET 时间轨迹（黑色）和理想化 FRET 轨迹（红色）。左图：在 50 mM Mg2+ 条件下 X0 的 FRET 直方图。下方显示了供体（绿色）和受体（红色）的荧光强度。(C) 相邻标记 X0 的 Iso(1,3) 和 Iso(2,4) 滞留时间直方图拟合为单指数函数，以确定异构化速率。不确定度表示拟合的 95% 置信区间。该图改编自先前发表的文献30。

邻位标记FRET分析、示意图、图表；GEN1结合效应，Ca²⁺对DNA结构的影响。
图3：GEN1对HJ的主动扭曲作用。
(A) 基于所提出模型的邻位标记HJ的结构修饰22。(B) 邻位标记X0的ALEX FRET直方图显示一个主要的高FRET峰（E = ~0.6），对应于Iso(1,3)，以及一个较低的FRET峰（E = ~0.4），对应于Iso(2,4)。整个直方图拟合为两个高斯函数：一个对应于游离的高FRET状态Iso(1,3)，另一个对应于结合态群体减去Iso(2,4)对总群体的初始贡献。(C) 表观单体解离常数（Kd-monomer-app）通过GEN1结合群体百分比随GEN1浓度变化的双曲线拟合确定。(D) 不同GEN1浓度下邻位标记nk-X0的FRET直方图。低FRET（E = ~0.25）高斯曲线下的面积对应于结合态群体的百分比。(E) nk-X0的Kd-monomer-app通过GEN1结合群体的双曲线拟合确定。误差棒表示两次或更多次实验的标准偏差。本图改编自先前发表的文献30。请点击此处查看此图的放大版本。

电泳结合分析和轨迹图；GEN1蛋白与DNA相互作用，KD值。
图4：GEN1与HJ的逐步结合。
(A) 在50 pM X0条件下GEN1的电泳迁移率变动分析（EMSA）。上图：罗马数字表示复合物中GEN1单体的数量。下图：GEN1单体与X0的结合。表观解离常数通过相应物种的S型拟合获得，并代表两次实验的平均值。(B) 在50 pM nk-X0条件下GEN1的EMSA，显示显著的单体结合，如极低的Kd-monomer-app-EMSA所示。(C) 在Mg2+存在下，结合但未切割的邻近标记X0的FRET时间轨迹。先对供体激发约1.3分钟，随后进行受体直接激发（粉红色阴影区域）。(D) 在Mg2+存在下，结合但未切割的邻近标记nk-X0的FRET时间轨迹。本图改编自先前发表的文献30。请点击此处查看此图的放大版本。

显示荧光数据图的DNA切割过程示意图；展示分子变化和激发分析。
图5：HJ的SMFRET解析实验。
(A) GEN1引起畸变后相邻标记X0 Iso(1,3)的示意图。底物通过生物素-亲和素连接固定在功能化表面。GEN1在两次切割后解离，导致供体和受体均进入溶液而丢失。(B) 切割链1后相邻标记nk-X0被解析的示意图。(C) 在2 mM Mg2+条件下Iso(1,3)切割过程的时间轨迹（黑色）。GEN1结合后形成稳定的低FRET状态，直至切割导致FRET信号突然消失。相应地，GEN1结合时供体荧光强度增加、受体荧光强度降低，随后切割时两种染料的荧光同时消失。(D) 类似地，nk-X0的时间轨迹显示GEN1结合后形成稳定的低FRET状态，并以FRET信号的突然消失结束。该图改编自先前发表的文献30。请点击此处查看此图的放大版本。

τ_before-cleavage 的 PDF 拟合；X₀、nk-X₀ 的速率图；动力学分析图表。
图 6：GEN1 在结合了 HJ 的 GEN1 单体上的二聚化动力学。
(A) X0 的 τbefore-cleavage 分布的概率密度函数（PDF）图显示了其对 GEN1 浓度的依赖性。在相应 GEN1 浓度下，低 FRET 状态的停留时间（τbefore-cleavage）来自两次或更多次实验，并用于获得平均速率（kapp）。所列的 kapp 速率由相应 GEN1 浓度下 τbefore-cleavage 平均值的倒数确定。二聚体形成的结合（kon-dimer）和解离（koff-dimer）速率通过双指数模型计算得出38。误差表示 kapp 的标准误（SEM）。(B) nk-X0 的 τbefore-cleavage 分布的 PDF 图及其相应的 kapp 速率。(C) kapp 与 GEN1 浓度的关系图，拟合为双曲线函数以确定表观催化速率（kMax-app）。X0 和 nk-X0 的 kapp 关系图显示，X0 的初始 kapp 更快，但在 [GEN1] ~5.6 nM 以上时被 nk-X0 超过。本图改编自先前发表的文献30。请点击此处查看此图的放大版本。

缓冲液成分
结合缓冲液40 mM Tris-HCl pH 7.5, 40 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM DTT, 0.1% BSA 和 5% (v/v) 甘油
缓冲液 A20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM DTT 和 300 mM NaCl
缓冲液 B20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM DTT 和 100 mM NaCl
缓冲液 C20 mM Tris-HCl pH 8.0 和 1 mM DTT
切割缓冲液40 mM Tris-HCl pH 7.5, 40 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1% BSA 和 5% (v/v) 甘油
EMSA 结合缓冲液40 mM Tris-HCl pH 7.5, 40 mM NaCl, 1 mM DTT, 2 mM CaCl2, 0.1 mg/ml BSA, 5% (v/v) 甘油 和 5 ng/µl Poly-dI-dC
成像缓冲液（结合）40 µL (±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸 (4 µM), 60 µL PCA (6 nM), 60 µL PCD (60 nM) 和 840 µL 结合缓冲液
成像缓冲液（切割）40 µL (±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸 (4 µM), 60 µL PCA (6 nM), 60 µL PCD (60 nM) 和 840 µL 切割缓冲液
裂解缓冲液20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM β-巯基乙醇, 300 mM NaCl 和 2 mM PMSF
PCD 储存缓冲液100 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 50 mM KCl 和 50% 甘油
储存缓冲液20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM NaCl 和 10% 甘油
TBE 缓冲液89 mM Tris-HCl, 89 mM 硼酸 和 2 mM EDTA
TE100 缓冲液10 mM Tris.HCl pH 8.0 和 100 mM NaCl
Tris-EDTA 缓冲液50 mM Tris-HCl pH 8.0 和 1 mM EDTA pH 8.0

表1：本研究中使用的缓冲液及其成分列表。

引物序列
X0-st1ACGCTGCCGAATTCTACCAGTGCCTTGCTAGGACATCTTTGCCCACCTGCAGGTTCACCC
X0-st2GGGTGAACCTGCAGGTGGG/iCy3/AAAGATGTCCATCTGTTGTAATCGTCAAGCTTTATGCCGT
X0-st3ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATCATGGAGCTGTCTAGAGGATCCGACTATCG
X0-st45’BiotinCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCACTGGTAGAATTCGGCAGCGT
X0-AdjX0-st1, X0-st2, X0-st3 & X0-st4
X0In_st2GGGTGAACCTGCAGGTGGGCAAAGATGTCCATCTGTTGTAATCGTCAAGCTTTATGCCGT
X0In_st45’BiotinCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCA/iCy3/TGGTAGAATTCGGCAGCGT
Nk-X0X0-st1, X0-st2, X0-nk3a, X0-nk3b & X0-st4
X0-nk3aACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATC
X0-nk3bATGGAGCTGTCTAGAGGATCCGACTATCG

表2：SMFRET和EMSA实验中使用的HJ底物。 用于制备荧光标记HJ以进行单分子FRET（smFRET）和凝胶迁移实验（EMSA）的寡核苷酸列表。所有寡核苷酸均购自商业供应商。荧光标记的寡核苷酸经HPLC纯化，若条件允许，长度≥60 bp的寡核苷酸 additionally 经PAGE纯化。

讨论

在本研究中， 采用了不同的单分子FRET技术 确定 GEN1 解离 HJ 的动力学30类似的单分子FRET方法被用于研究DNA复制和修复中的瓣状结构内切酶1对双瓣状DNA构象的需求及其切割过程42,43,44在此讨论本方案中的关键步骤。硅烷化反应必须完全避免任何微量湿气。一旦PEG溶解，应迅速将PEG化溶液施加到硅烷化玻璃表面，以防止水解。在多通道流动池中，应去除粘合层中任何滞留的气泡，以避免相邻通道之间发生泄漏。PCA溶液应新鲜配制，因其会随时间发生氧化。加入10 N NaOH时应逐滴进行，并在每滴加入后进行涡旋振荡。在引入荧光标记的HJ前，盖玻片的荧光背景应尽可能低。流动池中的成像应沿单一方向进行，以避免对已漂白区域重复成像。在ALEX实验中，应降低红色激光的功率，以避免受体的快速漂白。在时间序列实验中，循环时间必须短于最快事件的发生时间。

单分子FRET（smFRET）是一种灵敏的技术，可为生物分子反应提供有价值的实时信息。然而，该方法存在若干技术挑战，其中之一是在生化反应过程中实现可测量的FRET变化。这是获得直方图中明显分离的特征以及时间轨迹中可区分状态的必要条件。在许多情况下，由于底物结构变化较小，smFRET需要精心设计底物、选择合适的荧光团对及其标记位置，并在DNA底物中放大FRET信号的变化45。另一种实现FRET的方法是使用标记的蛋白质46。FRET的观测时间窗口受限于受体（如Cy5或Alexa Fluor 647）的稳定性，这些受体通常比供体（本例中为Cy3）更容易发生光漂白。因此，FRET研究需要持续寻找更稳定的荧光团以延长实验时间，同时需要开发氧清除系统以延长荧光信号并最大化信噪比47,48。

在单分子FRET实验的故障排除建议中，需要平衡成像过程中的多个参数，例如激光功率、曝光时间、循环时间以及循环次数，以最大化荧光发射、延长实验持续时间，并为酶动力学提供适当的采样间隔。更长的观测时间以及尽可能降低光漂白的影响，对于获得能够准确反映酶动力学的高保真停留时间分布至关重要。由于ALEX方法受光漂白颗粒的干扰较小，相比单色FRET可生成更优的直方图；然而，其时间分辨率低于单色FRET。

最后，单分子FRET技术通过实时检测单个分子的构象/结构变化，在高分辨率结构技术（如X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜）与整体测量方法之间架起了桥梁。前者可在静态条件下提供原子级分辨率的结构细节，而后者则给出可测性质的系综平均值。在许多方面，单分子FRET已被证明是一种研究生物体系实时动态的强有力技术。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

这项工作由阿卜杜拉国王科技大学通过核心资金以及授予 S. M. H. 的竞争性研究奖（CRG3）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（Trolox）Sigma-Aldrich238813
0.1 M 碳酸氢钠缓冲液Fisher144-55-8
10 % Novex Tris-硼酸-EDTA 凝胶Thermo Fisher ScientificEC6275BOX
100 X TIRF 物镜OlympusNAPO 1.49
3,4-二羟基苯甲酸（PCA）Sigma-AldrichP5630
3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）Sigma-Aldrich741442
6% Novex Tris-硼酸-EDTA 凝胶Thermo Fisher ScientificEC6265BOX
粘性片材Grace bio-labsSA-S-1L
台式制冷离心机EppendorfZ605212
生物素-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA 5000
牛血清白蛋白（BSA）New England BiolabsB9001S
氯化钙二水合物Sigma-Aldrich31307
阳离子交换柱GE healthcareMonoS (4.6/100)
细胞破碎仪Constant Cell Disruption SystemTS5/40/CE/GA
考马斯亮蓝MP Biomedicals808274
Cy3 发射滤光片ChromaHQ600/40M-25
Cy5/Alexa Fluor 647 发射滤光片ChromaHQ700/40M-25
DV2 滤光立方体的二向色镜Photometrics630dcxr-18x26
二硫苏糖醇（DTT）Thermo ScientificR0861
电钻Dremel200-1/21
电子切割机CopamCP-2500
EMCCD 相机HamamatsuC9100-13
环氧胶Devcon14250
FPLC Aktapurifier UPC 10GE Healthcare28406268
GelQuant.NET 软件biochemlabsolutions.comVersion 1.8.2
GEN1 入门载体Harvard 质粒库HSCD00399935
甘油Sigma Life ScienceG5516
绿色激光器（发射波长 532 nm）CoherentCompass 315M-100
肝素柱GE healthcareHiTrap Heparin column
HEPESBDHBDH4162
图像分光器PhotometricsDualview (DV2)
咪唑Sigma-AldrichI2399
倒置显微镜OlympusIX81
异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷（IPTG）Goldbio.12481C100
激光扫描仪GE healthcareTyphoon Trio
LB 肉汤Fisher ScientificBP1426-500
长通 532nm 滤光片SemrockLPD02-532RU-25
氯化镁Sigma Life ScienceM8266
mPEGLaysan BiomPEG-SVA 5000
中性亲和素（Neutravidin）Pierce31000
Ni-NTA 柱GE healthcareHisTrap FF
NuPAGE 10% Bis-Tris 凝胶Novex Life technologiesNP0301BOX
NuPAGE 10% Bis-Tris 蛋白凝胶Thermo Fisher ScientificNP0302PK2
Origin 软件OriginLab CorporationVersion 8.5
苯甲基磺酰氟（PMSF）Alexis Biochemicals270-184-G025
磷酸盐缓冲液（PBS）GIBCO14190
聚乙烯管（内径 0.76 mm，外径 1.22 mm）Fisher (Becton Dickinson)427416
原儿茶酸 3,4-双加氧酶（3,4-PCD）Sigma-AldrichP8279-25UN
四通道二向色镜Chroma IncZ405/488/532/640rpc
红色激光器（发射波长 640 nm）CoherentCube 640 100C
氯化钠Fisher ChemicalS271
Sorvall RC-6 plus 离心机Thermo Fisher Scientific46910
分光光度计Thermo Fisher ScientificNanodrop 2000
注射泵Harvard Apparatus70-3007
特氟龙镊子RubisK35A
Tris 碱PromegaH5135
超速离心机Beckman CoulterOptima L-90K
超滤膜MilliporeUFC90300

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