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方法文章

iNKT细胞在葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI）诱导的类风湿性关节炎小鼠模型中的过继免疫治疗

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DOI：

10.3791/60048

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2020年1月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Hebei University, 2Key Laboratory of Pathogenesis Mechanism and Control of Inflammatory-Autoimmune Diseases in Hebei Province

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案采用G6PI混合肽构建类风湿关节炎模型，该模型在CD4+ T细胞和细胞因子方面更接近人类类风湿关节炎。通过体内诱导和体外纯化，获得高纯度的不变的自然杀伤T细胞（主要为iNKT2），其具有特定表型和功能，可用于过继性免疫治疗。

摘要

类风湿关节炎（RA）是一种复杂的慢性炎症性自身免疫性疾病。该疾病的发病机制与不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）相关。活动性RA患者表现出iNKT细胞数量减少、细胞功能缺陷以及Th1细胞过度极化。本研究通过使用hGPI325-339和hGPI469-483多肽混合物建立RA动物模型。通过体内诱导和体外纯化获得iNKT细胞，随后将其输注至RA小鼠体内进行过继性免疫治疗。活体成像系统（IVIS）追踪显示，iNKT细胞主要分布于脾脏和肝脏。细胞治疗后第12天，疾病进展显著减缓，临床症状得到缓解，胸腺中iNKT细胞的丰度增加，胸腺中iNKT1细胞的比例下降，血清中TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平降低。iNKT细胞的过继性免疫治疗恢复了免疫细胞的平衡，并纠正了机体过度的炎症反应。

引言

类风湿关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，其特征为慢性、进行性侵袭性病变，发病率为0.5–1%1，2。该病的基本发病机制归因于自身反应性CD4+和CD8+ T细胞的异常增殖，表现为CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17A+ T细胞比例升高，以及CD4+IL-4+和CD4+CD25+FoxP3+ T细胞数量减少。因此，炎性细胞因子分泌增加，过度的炎症反应破坏了机体免疫系统的原有平衡与耐受功能。此外，侵入关节的辅助性T淋巴细胞（Th）1细胞加剧了炎症反应和关节损伤。因此，抑制过度的炎症反应，恢复免疫耐受与免疫平衡，是治疗RA的关键3，4。

iNKT细胞兼具自然杀伤（NK）细胞和T细胞的功能与特征。iNKT细胞携带一种独特的、不变的T细胞受体（TCR）α链，并具有有限的TCR β链库5，能够识别由抗原呈递细胞表面主要组织相容性复合体（MHC）I类分子CD1d呈递的糖脂抗原。Mitsuo等6在包括类风湿关节炎（RA）在内的多种自身免疫性疾病中检测到大量iNKT细胞及其功能缺陷。Aurore等7研究表明，iNKT细胞对维持自身免疫耐受具有积极作用，当iNKT细胞的数量和功能恢复时，疾病症状得以缓解。此外，Miellot-Gafsou等8发现iNKT细胞不仅可消除疾病，也可能促进疾病进展。这些相互矛盾的结果提示iNKT细胞是一类异质性的T细胞，不同亚群的功能可能相反。在一项针对RA的临床研究中，iNKT细胞的频率与疾病活动评分呈相关性9。研究结果还证实，RA患者体内iNKT细胞频率降低，CD4+IFN-γ+ T细胞亚群数量增加，炎症细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌水平升高10,11。此外，Sharif等12研究了1型糖尿病（T1D），发现选择性输注iNKT细胞可上调炎症细胞因子IL-4的表达，维持免疫耐受，从而预防1型糖尿病的发生。因此，通过过继性输注特定iNKT细胞或靶向激活iNKT细胞以提高RA患者体内iNKT细胞水平，可能成为RA治疗的新突破。

细胞免疫治疗目前备受关注，并已广泛应用于癌症治疗。然而，iNKT细胞是一种稀有且具有异质性的免疫调节细胞（仅占外周血单个核细胞总数的0.3%）13，这限制了其潜在的临床应用。这些细胞主要分为三个亚群：1）iNKT1细胞，高表达早幼粒细胞白血病锌指蛋白（PLZF）和T-box转录因子（T-bet）；2）iNKT2细胞，中等表达PLZF和GATA结合蛋白3（GATA3）；3）iNKT17细胞，低表达PLZF和视黄醇相关孤儿核受体（ROR）-γt，可分泌IFN-γ、IL-4和IL-1714。活化的iNKT细胞可分泌类似Th1、Th2和Th17的细胞因子，从而决定iNKT细胞不同的免疫调节作用15。特异性激活不同iNKT细胞亚群所产生的免疫调节和免疫治疗效应各不相同。因此，选择具有抗炎功能的特定表型iNKT细胞（主要是iNKT2细胞）来调节机体的免疫反应，可纠正类风湿关节炎（RA）中的免疫失衡与免疫紊乱。

建立理想的动物模型对于类风湿关节炎（RA）发病机制的研究和治疗具有重要意义。目前最常用且较为成熟的动物模型包括胶原诱导性关节炎、佐剂性关节炎、酵母多糖诱导性关节炎和多糖诱导性关节炎。16–17然而，目前尚无能够完全模拟人类类风湿关节炎（RA）所有特征的动物模型。II型胶原诱导性关节炎（CIA）是一种经典的关节炎模型，通过给小鼠免疫注射针对II型胶原的特异性单克隆抗体来诱导，体现了该疾病模型的抗体依赖性。Benurs等报道了一种针对葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI）产生系统性免疫反应的模型，可在易感小鼠品系中诱导出外周对称性多关节炎。18,19在此模型中，关节炎的发生依赖于T细胞、B细胞和先天免疫。18,19,20. Horikoshi21 发现通过G6PI多肽片段免疫DBA/1小鼠所建立的RA模型在CD4方面与人类RA更为相似+ T细胞及细胞因子（如IL-6和TNF-α）的水平高于CIA模型。为了增强对TCR识别位点的刺激作用，采用G6PI的混合多肽片段（hGPI325-339和hGPI469-483）免疫DBA/1小鼠以构建类风湿关节炎（RA）小鼠模型。该方法的成功率较高，因为hGPI325-339和hGPI469-483是I-Aq限制性T细胞反应的免疫优势表位。因此，该模型可模拟CD4⁺ T细胞的过度增殖+ 类风湿关节炎患者中T细胞和iNKT细胞缺陷22类风湿关节炎免疫病理学的基础研究为我们的进一步深入探索奠定了基础。

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方案

所有实验小鼠（共150只）均为健康雄性DBA/1小鼠，6–8周龄（20.0 ± 1.5 g），在特定病原体-free（SPF）环境中饲养。建模前无特殊处理。实验分为健康对照组（15只小鼠）、模型对照组（15只小鼠）和细胞治疗组（55只小鼠）。本研究已获河北大学动物福利与伦理委员会批准。

1. 构建疾病模型

  1. 复制类风湿关节炎动物模型
    1. 称取1.75 mg的hG6PI 325-339和hG6PI 469-483片段各一份，溶于5.25 mL、4 °C的三蒸水中。
    2. 将完全弗氏佐剂（CFA）置于50 °C水浴中溶解，吸取5.25 mL至另一10 mL离心管中，冷却备用。
    3. 将hG6PI溶液与CFA溶液的混合物放入人工乳化装置中，该装置由两个相连的玻璃注射器组成。
    4. 以每分钟10–20次的恒定速度和频率推动注射器，使混合肽溶液与CFA溶液充分乳化。操作过程中保持在冰浴中进行，乳化完成后，将乳化液滴入水中静置10分钟，应不发生分散。
    5. 将150 µL乳化后的hG6PIs溶液皮下注射至小鼠尾根部。
    6. 在注射hG6PI后0 h和48 h，分别通过腹腔注射向小鼠给予200 mg百日咳毒素。
  2. 类风湿关节炎模型的实验验证
    1. 使用游标卡尺测量小鼠足爪厚度（每天2次）。
    2. 观察并记录足部红肿程度，采用以下评分标准：1）脚趾轻度肿胀；2）足背和足垫明显红肿；3）踝关节红肿。
    3. 建模后14天，在深度麻醉下通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg体重）处死小鼠，并取足爪组织进行HE染色。
    4. 根据试剂盒制造商的操作说明，使用商用细胞因子微球阵列（CBA）检测法测定血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α和IFN-γ的分泌水平。

2. 通过过继性细胞治疗获取iNKT细胞

  1. iNKT细胞的定向诱导
    1. 向正常小鼠腹腔注射 α-GalCer（0.1 mg/kg 体重）
  2. iNKT细胞的分离
    1. 造模后第3天，经腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg体重）对小鼠进行麻醉。充分麻醉的小鼠在脚趾受压时无后肢回缩反应。
    2. 在DBA/1小鼠腹腔注射后，分离其脾脏 α-GalCer。通过在200目筛网中剪切和研磨脾脏制备单细胞悬液。
    3. 用 PBS 洗涤细胞悬液，200 x g 离心 g 5分钟，弃去上清液，重复一次。
    4. 用1 mL全血和组织稀释液重悬细胞。加入3 mL小鼠淋巴细胞分离液，然后以300 x g离心20分钟 g 在室温下。
    5. 收集乳白色淋巴细胞层（即从上往下数第二层），用 PBS 洗涤 2 次，并使用自动细胞计数仪进行计数。
  3. 磁珠激活细胞分选（MACS）阳性 筛选 iNKT细胞纯化的策略
    注意：对于CD1d四聚体的预处理，使用1 mg/mL的 α-Galcer 被稀释至 200 μg/mL，含 0.5% Tween-20 和 0.9% NaCl，以及 5 µL 的所得溶液被加入至 100 µL 的 CD1d 四聚体溶液。将混合物在室温下孵育 12 h，并置于 4 °C 以供使用。TCR β 用去离子水稀释80倍。其余所有抗体均使用原液。
    1. 重悬107 细胞与100 µ4 升 °C PBS，加入10 µL of α-GalCer 负载的 CD1d 四聚体-PE，并在 4 °C 下孵育 °在黑暗中室温孵育15分钟。
    2. 用 PBS 洗涤细胞 2 次，并将细胞重悬于 80 µPBS L
    3. 加入20 µL 的抗 PE 微珠，于 4 ℃ 孵育 °暗处室温孵育20分钟
    4. 用 PBS 洗涤 2 次，并用 500 μL PBS 重悬细胞 µPBS L
    5. 将分选柱置于 MACS 分选仪的磁场中，并用 500 µL 的 PBS。
    6. 将步骤2.3.4中的细胞悬液加入分选柱，收集流穿液，并用PBS缓冲液冲洗3次。
    7. 移除磁场，从分选柱中收集细胞。此时，向分选柱中加入1 mL PBS缓冲液，迅速以恒定压力推动活塞，将标记的细胞驱入收集管中，获得纯化的iNKT细胞。使用自动细胞计数仪进行计数。
  4. iNKT细胞表型的鉴定
    1. 取 1 × 106 分别从步骤 2.2.5 和 2.3.7 中获取细胞，并将其重悬于 50 µPBS L
    2. 抗体孵育：不要向阴性对照管中添加抗体，加入 0.5 µL of α-GalCer-PE-CD1d 四聚体或 10 µL of FITC-TCR β 在单阳性对照管中。加入0.5 µL of α-GalCer-PE-CD1d 四聚体和 10 µL of FITC-TCR β 在样品管中。4 ℃孵育 °暗处室温孵育30分钟。
    3. 用 PBS 洗涤细胞，然后在 200 x g 5 分钟。
    4. 弃去上清液，加入 1 mL Foxp3 固定/破膜工作液，于 4 ℃孵育 45 min °避光。
    5. 加入1 mL 1×破膜缓冲液工作液，室温下以500 × g离心细胞 g 室温下放置 5 分钟。
    6. 弃去上清液。加入 1 μL 的 Alexa Fluor 647 小鼠抗 PLZF 和 1 μPerCP-Cy 5.5 标记的小鼠抗 T-bet（或 1 L） μPerCP-Cy 5.5 标记的小鼠抗 RORΥ室温避光孵育30分钟。
    7. 加入2 mL破膜缓冲液工作液进行清洗。
    8. 弃去上清液，将细胞重悬于 500 µPBS L，通过流式细胞术进行检测。
  5. iNKT细胞的功能鉴定
    1. 取 3 x 106 将2.3.7步骤中的iNKT细胞重悬于12孔板中，每孔加入1.5 mL RPMI-1640不完全培养基（即不含血清）。
    2. 加入佛波酯（PMA，50 ng/mL）和离子霉素钙（IO，1 μg/mL）并置于 CO2 孵育箱中孵育 24 小时。
    3. 收集细胞上清液，检测 IL-2、IL-17A、TNF-α 的分泌水平。α，IL-6，IL-4，IFN-γ，以及使用商用CBA检测试剂盒按照制造商方案检测IL-10。
  6. RA小鼠中iNKT细胞迁移途径的实验研究
    1. 将DiR染料（2.5 mg/mL）溶于DMSO中。
    2. 在6孔板中用RPMI-1640不完全培养基重悬iNKT细胞，密度为1 × 106 细胞/mL
    3. 加入 DiR（5 μg/mL）溶液中，并在 CO₂ 培养箱中孵育2 孵育25分钟。
    4. 用 PBS 洗涤并重悬细胞（3 × 106/300 µL）以获得DiR标记的iNKT细胞（DiR-iNKT）。
    5. 腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg体重）以麻醉小鼠。充分麻醉的小鼠在脚趾受压时无后肢回缩反应。在成像过程中，为防止小鼠眼睛干燥，需涂抹兽医用眼膏。
    6. 注射 DiR-iNKT 细胞 3 x 106 每只小鼠通过尾静脉注射，持续8天。使用小动物活体成像系统（IVIS）在注射后0分钟、10分钟、30分钟、60分钟以及0天（注射后3小时）、1天、3天、6天、12天、26天、34天、38天和42天监测小鼠体内iNKT细胞。激发波长为748 nm，发射波长为780 nm，曝光时间设为自动。
    7. 每次观察后将每只小鼠放入单独的笼子中，并保持胸卧位。观察至从麻醉中恢复。

3. 采用iNKT细胞对类风湿关节炎小鼠进行过继性免疫治疗的评估

  1. iNKT 细胞过继免疫治疗 RA 小鼠
    1. 通过尾静脉每只小鼠注射 3 × 106 个 iNKT 细胞。随机选取8天前建模的15只小鼠，通过尾静脉输注来自步骤 2.3.7 且未用 DiR 标记的 iNKT 细胞。
  2. 评估 iNKT 细胞过继免疫治疗的疗效。
    1. 测量小鼠足掌厚度，量化踝关节肿胀程度，并在输注 iNKT 细胞后按照步骤 1.2.1–1.2.2 所述方法进行系统评分。
    2. 观察小鼠关节的炎性细胞浸润和关节结构变化，方法如步骤 1.2.3 所述。
    3. 检测 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α 和 IFN-γ 的分泌水平，方法如步骤 1.2.4 所述。
  3. 测定 iNKT 细胞及其亚群的频率。
    1. 分离小鼠胸腺，制备单细胞悬液。
    2. 使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
    3. 测定 iNKT 细胞频率及亚群频率，方法如步骤 2.4 所述。
  4. 统计学分析
    注意：所有数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。
    1. 采用单因素方差分析（ANOVA）。若方差齐性成立，则进一步采用 LSD 检验进行比较。
    2. 若方差不齐，则采用非参数检验，进一步比较使用 Kruskal-Wallis H 检验31。

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结果

造模后关节炎指数评分和足趾厚度均增加。与对照组相比，类风湿关节炎（RA）模型组大鼠在造模后第6天开始出现足趾红肿，并逐渐加重；第14天时踝关节红肿达到高峰，随后逐渐缓解。足趾厚度的变化趋势与此相似（P < 0.05）（图1）。

造模后炎性细胞浸润显著增加。病理结果显示，类风湿关节炎（RA）模型小鼠踝关节滑膜组织中炎性细胞的浸润程度在不同阶段存在差异。造模后第14天炎症达到高峰（图2）。

血清中促炎性细胞因子升高，抗炎性细胞因子降低。在类风湿关节炎（RA）模型组中，血清促炎性细胞因子（TNF-α、IFN-γ 和 IL-6）水平显著升高（P < 0.05），而抗炎性细胞因子（IL-4 和 IL-10）水平显著降低（P < 0.05）（图3）。

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讨论

iNKT细胞是一类特殊的T细胞，能够连接先天免疫与适应性免疫，主要由CD4++/CD8+胸腺细胞发育而来。iNKT细胞具有多种免疫调节功能，可通过直接接触以及分泌不同细胞因子的方式与其他免疫细胞相互作用23，影响树突状细胞（DCs）、巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞、T细胞以及NK细胞的分化与发育24。α-GalCer是一种从海绵中提取的经典iNKT细胞特异性激活剂。多项研究表明，单次腹腔注射α-GalCer后第3天，脾脏中iNKT细胞频率达到峰值25。我们的实验结果表明，在腹腔注射α-GalCer后第3天，小鼠脾脏中以iNKT2亚群为主，该亚群主要分泌抗炎性细胞因子IL-4和IL-10。我们还发现，在类风湿关节炎（RA）模型小鼠的炎症期，iNKT2细胞丰度下降，而iNKT1和iNKT17细胞丰度上升。因此，我们通...

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披露

作者声明无资金支持或利益冲突。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（NSFC）（81771755）、河北省高等学校科学技术重点研究项目（ZD2017009）以及河北大学医学实验中心动物实验室的支持。我们对他们的支持深表感谢。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 647 小鼠抗 PLZFBD563490America
抗 PE 微珠Miltenyi130-048-801德国
层析柱MiltenyiMS德国
冷冻离心机BeckmanAllegra® X-15RAmerica
DiRThermo Fisher ScientificD12731America
包埋中心天津航空机电有限公司BMJ-1中国
FITC 仓鼠抗小鼠 TCR β 链BD553170America
流式细胞仪BDAccuri C6America
弗氏完全佐剂SigmaF5881America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)Karebay Biochem18062202中国
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)Karebay Biochem18062203中国
活体成像系统PerkinElmercaliper IVIS lumina IIAmerica
离子霉素钙盐Cayman10004974America
KRN7000AdipoGenAG-CN2-0013America
小鼠 CD1d 四聚体-PEMBLTS-MCD-1日本
小鼠 PercollSolarbioP8620中国
光学显微镜OlympusOlympus-II日本
PerCP-CyTM5.5 小鼠抗 ROR-ϒtBD562683America
PerCP-CyTM5.5 小鼠抗 T-betBD561316America
百日咳毒素SigmaP7208America
佛波酯Cayman10008014America
红细胞裂解缓冲液BD555899America
RPMI-1640Biological Industries01-100-1ACS以色列
Th1/Th2/Th17 细胞因子检测试剂盒BD560485America
超薄切片机LeicaLeica EM UC6德国

参考文献

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