iNKT细胞在葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI）诱导的类风湿性关节炎小鼠模型中的过继免疫治疗

摘要

本方案采用G6PI混合肽构建类风湿关节炎模型，该模型在CD4⁺ T细胞和细胞因子方面更接近人类类风湿关节炎。通过体内诱导和体外纯化，获得高纯度的不变的自然杀伤T细胞（主要为iNKT2），其具有特定表型和功能，可用于过继性免疫治疗。

摘要

类风湿关节炎（RA）是一种复杂的慢性炎症性自身免疫性疾病。该疾病的发病机制与不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）相关。活动性RA患者表现出iNKT细胞数量减少、细胞功能缺陷以及Th1细胞过度极化。本研究通过使用hGPI325-339和hGPI469-483多肽混合物建立RA动物模型。通过体内诱导和体外纯化获得iNKT细胞，随后将其输注至RA小鼠体内进行过继性免疫治疗。活体成像系统（IVIS）追踪显示，iNKT细胞主要分布于脾脏和肝脏。细胞治疗后第12天，疾病进展显著减缓，临床症状得到缓解，胸腺中iNKT细胞的丰度增加，胸腺中iNKT1细胞的比例下降，血清中TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平降低。iNKT细胞的过继性免疫治疗恢复了免疫细胞的平衡，并纠正了机体过度的炎症反应。

引言

类风湿关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，其特征为慢性、进行性侵袭性病变，发病率为0.5–1%^1，2。该病的基本发病机制归因于自身反应性CD4⁺和CD8⁺ T细胞的异常增殖，表现为CD4⁺IFN-γ⁺和CD4⁺IL-17A⁺ T细胞比例升高，以及CD4⁺IL-4⁺和CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ T细胞数量减少。因此，炎性细胞因子分泌增加，过度的炎症反应破坏了机体免疫系统的原有平衡与耐受功能。此外，侵入关节的辅助性T淋巴细胞（Th）1细胞加剧了炎症反应和关节损伤。因此，抑制过度的炎症反应，恢复免疫耐受与免疫平衡，是治疗RA的关键^3，4。

iNKT细胞兼具自然杀伤（NK）细胞和T细胞的功能与特征。iNKT细胞携带一种独特的、不变的T细胞受体（TCR）α链，并具有有限的TCR β链库⁵，能够识别由抗原呈递细胞表面主要组织相容性复合体（MHC）I类分子CD1d呈递的....

方案

所有实验小鼠（共150只）均为健康雄性DBA/1小鼠，6–8周龄（20.0 ± 1.5 g），在特定病原体-free（SPF）环境中饲养。建模前无特殊处理。实验分为健康对照组（15只小鼠）、模型对照组（15只小鼠）和细胞治疗组（55只小鼠）。本研究已获河北大学动物福利与伦理委员会批准。

1. 构建疾病模型

1. 复制类风湿关节炎动物模型
   1. 称取1.75 mg的hG6PI 325-339和hG6PI 469-483片段各一份，溶于5.25 mL、4 °C的三蒸水中。
   2. 将完全弗氏佐剂（CFA）置于50 °C水浴中溶解，吸取5.25 mL至另一10 mL离心管中，冷却备用。
   3. 将hG6PI溶液与CFA溶液的混合物放入人工乳化装置中，该装置由两个相连的玻璃注射器组成。
   4. 以每分钟10–20次的恒定速度和频率推动注射器，使混合肽溶液与CFA溶液充分乳化。操作过程中保持在冰浴中进行，乳化完成后，将乳化液滴入水中静置10分钟，应不发生分散。
   5. 将150 µL乳化后的hG6PIs溶液皮下注射至小鼠尾根部。
   6. 在注射hG6PI后0 h和48 h，分别通过腹腔注射向小鼠给予200 mg百日咳毒素。
2. 类风湿关节炎模型的实验验证
   1. 使用游标卡尺测量小鼠足爪厚度（每天2次）。
   <....

结果

造模后关节炎指数评分和足趾厚度均增加。与对照组相比，类风湿关节炎（RA）模型组大鼠在造模后第6天开始出现足趾红肿，并逐渐加重；第14天时踝关节红肿达到高峰，随后逐渐缓解。足趾厚度的变化趋势与此相似（P < 0.05）（图1）。

造模后炎性细胞浸润显著增加。病理结果显示，类风湿关节炎（RA）模型小鼠踝关节滑膜组织中炎性细胞的浸润程度在不同阶段存在差异。造模后第14天炎症达到高峰（图2）。

血清中促炎性细胞因子升高，抗炎性细胞因子降低。在类风湿关节炎（RA）模型组中，血清促炎性细胞因子（TNF-α、IFN-γ 和 IL-6）水平显著升高（P < 0.05），而抗炎性细胞因子（IL-4 和 IL-10）水平显著降低（P < 0.05）（图3）。

讨论

iNKT细胞是一类特殊的T细胞，能够连接先天免疫与适应性免疫，主要由CD4⁺⁺/CD8⁺胸腺细胞发育而来。iNKT细胞具有多种免疫调节功能，可通过直接接触以及分泌不同细胞因子的方式与其他免疫细胞相互作用²³，影响树突状细胞（DCs）、巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞、T细胞以及NK细胞的分化与发育²⁴。α-GalCer是一种从海绵中提取的经典iNKT细胞特异性激活剂。多项研究表明，单次腹腔注射α-GalCer后第3天，脾脏中iNKT细胞频率达到峰值²⁵。我们的实验结果表明，在腹腔注射α-GalCer后第3天，小鼠脾脏中以iNKT2亚群为主，该亚群主要分泌抗炎性细胞因子IL-4和IL-10。我们还发现，在类风湿关节炎（RA）模型小鼠的炎症期，iNKT2细胞丰度下降，而iNKT1和iNKT17细胞丰度上升。因此，我们通.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 647 小鼠抗 PLZF	BD	563490	America
抗 PE 微珠	Miltenyi	130-048-801	德国
层析柱	Miltenyi	MS	德国
冷冻离心机	Beckman	Allegra® X-15R	America
DiR	Thermo Fisher Scientific	D12731	America
包埋中心	天津航空机电有限公司	BMJ-1	中国
FITC 仓鼠抗小鼠 TCR β 链	BD	553170	America
流式细胞仪	BD	Accuri C6	America
弗氏完全佐剂	Sigma	F5881	America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)	Karebay Biochem	18062202	中国
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)	Karebay Biochem	18062203	中国
活体成像系统	PerkinElmer	caliper IVIS lumina II	America
离子霉素钙盐	Cayman	10004974	America
KRN7000	AdipoGen	AG-CN2-0013	America
小鼠 CD1d 四聚体-PE	MBL	TS-MCD-1	日本
小鼠 Percoll	Solarbio	P8620	中国
光学显微镜	Olympus	Olympus-II	日本
PerCP-CyTM5.5 小鼠抗 ROR-ϒt	BD	562683	America
PerCP-CyTM5.5 小鼠抗 T-bet	BD	561316	America
百日咳毒素	Sigma	P7208	America
佛波酯	Cayman	10008014	America
红细胞裂解缓冲液	BD	555899	America
RPMI-1640	Biological Industries	01-100-1ACS	以色列
Th1/Th2/Th17 细胞因子检测试剂盒	BD	560485	America
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