本文介绍了一种用于开展Morris水迷宫实验的方案，旨在评估阿尔茨海默病模型小鼠的学习与记忆能力，并评价手法针刺治疗对该疾病模型的干预效果。
本文内容
摘要
摘要
Morris水迷宫（MWM）实验迫使实验动物在水中游泳并学会寻找隐藏于水下的平台，广泛用于科学研究以评估动物的学习与记忆能力。由于MWM测试被广泛使用，可视化实验方案对研究人员至关重要。本文基于最新研究，介绍MWM测试的操作流程。阿尔茨海默病（AD）以进行性记忆和认知功能丧失为特征，而针刺手法（MA）是用于AD的一种替代性和辅助性治疗方法。为评估AD模型小鼠的学习与记忆能力，开展了MWM测试。通过MWM的可见平台试验、隐藏平台试验、探针试验和反转试验，评价其空间学习与记忆能力。在可见平台试验中，各组小鼠的游泳速度和逃避潜伏期无显著差异。在隐藏平台试验和反转试验中，AD组小鼠表现出较长的逃避潜伏期，而经过MA治疗后，逃避潜伏期显著缩短。在探针试验中，MA治疗后小鼠穿越平台位置的次数增加，且在西南象限（SW quadrant）停留时间的比例升高（p < 0.05 或 p < 0.01）。MWM测试结果表明，MA可有效改善AD模型小鼠的空间学习与记忆能力。严谨的实验操作为结果的可靠性提供了保障。
引言
目前，莫里斯水迷宫（MWM）实验已成为评估动物空间学习和记忆能力应用最广泛且标准的行为学实验方法1。该实验最初由英国心理学家 Richard G. Morris 设计，并不断得到改进。MWM 具有训练需求少、适用于多种物种、对体重差异不敏感以及可重复测试等多种优势，使其成为评估认知功能的最佳方法之一2。阿尔茨海默病（AD）是一个重要的医学问题，主要特征是记忆处理能力和认知功能的下降3。MWM 是评估 AD 模型动物学习记忆能力及干预方法效果不可或缺的实验手段。MWM 实验通常耗时较长（6–11 天），且涉及多种可变因素4。尽管已有大量关于水迷宫实验的文章，但在实际操作中，研究人员仍缺乏一套系统完整的实验方案。因此，一部直观而严谨的实验操作视频显得尤为重要。本文以先前的一项实验为例5，详细描述 MWM 的全部操作步骤。利用 MWM，以往的研究表明针灸可缓解 AD 模型小鼠的症状5,6,7。
本文描述了一项近期研究中使用的MWM方案5，旨在为研究人员提供一种简单且直观的方法，用于评估阿尔茨海默病模型动物的空间学习和记忆能力。
方案
本方案已获北京中医药大学动物伦理委员会批准，符合中国《实验动物护理与使用指南》的所有规定。实验过程中未发生意外死亡情况，本研究中无需对动物实施安乐死。
1. 准备
- 购买30只雄性SAMP8小鼠和10只雄性SAMR1小鼠（年龄：8个月）。
- 将小鼠单独饲养在独立通风笼具中，温度控制在24 ±2 °C，光照周期为12小时黑暗/12小时光照。
- 给予小鼠标准颗粒饲料自由摄食，并提供无菌饮用水。
- 实验前将所有小鼠在环境中适应5天。
2. 动物分组
- 将30只SAMP8小鼠随机分为三组（每组n = 10）：AD组、手工针刺（MA）组和药物（M）组。
- 选取10只SAMR1小鼠作为正常对照（N）组6。
3. 盐酸多奈哌齐片的给药
- 将一片盐酸多奈哌齐片（5 mg/片）碾碎，并溶于50 mL蒸馏水中。
- 在整个实验期间（包括进行MA处理和MWM测试的日子），每天一次通过口服灌胃给予小鼠步骤3.1中配制的药物，剂量为1 mg/kg8。
4. 手法针刺的操作
- 将MA组小鼠固定于小鼠固定袋中。
- 使用一次性无菌针灸针（0.25 mm × 13 mm），在百会（GV20）和印堂（GV29）穴位采用平刺法进行针刺5 朝向鼻部持续20分钟。确保针头深度为0.2–0.3 cm。
- 在整个实验过程中，包括进行MA处理和MWM测试的日子，每隔5分钟以约180转/分钟的速度双向旋转操作装置90°，每次持续约15秒。
5. MWM 测试
注意：在连续给药15天后的24小时，对四组小鼠进行MWM测试。依次进行可见平台试验、隐藏平台试验、探针试验和反转试验。
- 准备进行莫里斯水迷宫（MWM）测试。
- 将MWM装置及信号采集与处理系统放置在具有隔音设计的实验室内。
- 在MWM装置中央放置一个圆形白色水箱（直径 = 90 cm，高度 = 50 cm），并在其周围用不透明布料遮挡。
- 将视频摄像机固定在MWM装置的天花板上，并连接至带有自动追踪系统的录像设备以采集数据。
- 使用两条相互垂直的直线将水迷宫水箱均分为四个相等的区域，分别标记为北（N）、南（S）、东（E）和西（W）；将水池区域在概念上划分为四个大小相同的象限（NE、NW、SW 和 SE）。
- 在小鼠可视范围内，在每个象限的墙壁上放置不同形状的视觉线索作为视觉参考（例如正方形、三角形和圆形）。
注意：远端线索是动物用于定位平台的导航参考点，因此在测试过程中不得移动这些线索。研究人员所处的位置可能成为潜在的远端线索，从而影响MWM测试结果，因此研究人员应在小鼠测试期间避开其视线。 - 向圆形水箱中注水至深度30 cm，并使用电加热器维持水温在22 ± 2 °C。
- 加入约150 g奶粉使水呈不透明状。
- 进行可见平台试验。
- 随机选择任一象限，将一个塑料圆形平台（直径 = 9.5 cm；高度 = 28 cm）置于水面以上1 cm处。
- 在平台上放置一面黑色旗帜。
- 从四个起始位置之一，将每只小鼠轻轻放入水中，使其面朝水箱壁，释放至水面水平位置。切勿将小鼠直接丢入水中。
- 小鼠一入水即启动计算机追踪程序。
- 给予每只小鼠60 s时间寻找平台。每次试验结束后，将小鼠放置于平台上，并让其在平台上停留10–30 s。
- 在计算机上观察小鼠的游泳轨迹，记录小鼠找到平台所需的时间作为逃避潜伏期，并分析其游泳速度。
- 用毛巾擦干每只小鼠，并使用电加热器为其保暖。务必使用适当的热源，防止动物过热。
注意：每只小鼠需在四个不同的起始象限各进行一次试验，共进行四次试验，每次试验后将平台移至不同位置。每只小鼠两次试验之间的间隔时间为15–20 min。
- 进行隐藏平台试验/空间导航测试。
- 将同一平台（不带旗帜）放置于SE象限内。
- 随机从四个象限（NE、NW、SW、N）之一将小鼠面朝池壁放入水中，共进行四次试验。每次试验之间的时间间隔为15–20 min。
- 给予每只小鼠60 s时间寻找隐藏平台。
- 小鼠爬上平台后，记录每次试验的逃避潜伏期，用于后续分析。
- 用毛巾擦干每只小鼠，并使用电加热器为其保暖。
注意：隐藏平台试验应在第2–6天进行。若小鼠在60 s内未能找到平台，则引导其爬上平台，并在每次试验结束时让其在平台上停留10–30 s。每只小鼠每天进行四次试验，连续进行5天，平台位置和视觉线索保持不变。
- 进行探测试验。
注意：将每只小鼠从新的起始位置放入水池，以观察其空间探索能力。- 移除平台。
- 将每只小鼠面朝水箱壁放入水池中一次，持续60 s。确保起始位置为NW象限，即距离SE象限最远的象限。
- 记录小鼠在迷宫中的游泳距离、游泳速度以及穿越原平台位置的次数。
- 试验结束后，用毛巾擦干每只小鼠并提供保暖。
- 进行反转试验。
注意：反转试验应在第8–11天进行。- 将平台置于NW象限中央（而非SE象限）。
- 按照隐藏平台试验部分所述的步骤5.3.2–5.3.5进行操作。
6. 统计分析
- 使用统计学软件（例如 SPSS 20.0）进行统计分析。
结果
本方案的时间轴示意图见图1。
图1：研究方案的时间轴示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。
时间轴显示，本实验总共持续了21天。在整个实验期间对小鼠进行了处理，处理15天后开始进行MWM测试。依次进行了可见平台、隐藏平台、探针和反向试验。
丁等人先前发表的结果5作为莫里斯水迷宫实验的典型结果展示，见图2。
图2：Morris水迷宫实验的典型结果（n = 10）。（A）可见平台实验中不同组大鼠的逃避潜伏期和游泳速度的变化。（B）隐藏平台实验和反转实验中不同组大鼠逃避潜伏期的变化。与对照组相比，*p < 0.05，**p < 0.01；与AD组相比，## 表示 p < 0.01。（C）探针实验中不同实验组大鼠平台穿越次数及在西北象限停留时间百分比的变化。图中显示了各组在可见平台、隐藏平台和反转实验中的结果（n = 10，均值 ± 标准差）。该图改编自Ding等5。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2A显示了可见平台试验的结果。在MWM的第一天，各组之间的逃避潜伏期或游泳速度未观察到统计学差异。图2B显示了第2−6天和第8−11天隐藏平台及反转试验的结果。AD组在每次测试中的逃避潜伏期均保持在较高水平，而其他三组的逃避潜伏期则逐渐下降。AD组在第3−6天和第8−11天的逃避潜伏期均长于对照组（p < 0.01）。MA组和药物组小鼠在第2−6天和第8−11天的逃避潜伏期分别短于AD组（p < 0.01）。图2C显示了探测试验的结果。AD组小鼠穿越平台位置的次数显著低于对照组（p < 0.01），MA组的穿越次数高于AD组（p < 0.05）。AD组小鼠在SW象限停留的时间比例显著低于对照组（p < 0.01），而MA组在SW象限停留的时间比例高于AD组（p < 0.01）。
讨论
尽管许多水迷宫（包括Biel水迷宫和Cincinnati水迷宫）已有至少一个世纪的历史，但只有莫里斯水迷宫（MWM）被广泛用于有效且客观地评估空间学习和记忆能力，因为它具有诸多优势9。尽管MWM被广泛使用，但其操作流程并不总是得到最优应用。MWM实验通常耗时较长，并受到多种可变因素的影响。有一些有效且可靠的方面有助于检测空间学习和记忆能力的变化，应予以充分考虑。
共进行了四种不同的莫里斯水迷宫（MWM）实验。莫里斯水迷宫实验的第一天进行可见平台实验。如果动物能够直接游向平台，则表明其游泳能力和视力正常10。Otnass 建议应首先进行可见平台实验11。本研究中可见平台实验的结果表明，四组小鼠在学习能力起始水平上一致，因此可以在此基础上开展后续实验。隐藏平台实验用于评估小鼠获得学习和记忆能力的情况。在隐藏平台实验结束后的第7天，即24小时后，进行探针实验，以评估工作记忆。最后，逆转实验用于进一步评估工作记忆2。莫里斯水迷宫四种不同实验的变化结果共同表明，阿尔茨海默病（AD）模型小鼠的学习和记忆能力较低，而MA对AD具有积极影响5。
对于水迷宫和平台的尺寸没有特定的标准1。大多数莫里斯水迷宫（MWM）研究采用直径为214 cm的水池。Vorhees和Williams证明，在相同实验方案下，大鼠在直径122 cm的水池中的学习速度比在直径210 cm的水池中更快；其陡峭的学习曲线表明，直径122 cm的水池对大鼠而言极易导航12。在本实验方案中，考虑到阿尔茨海默病（AD）小鼠年龄较老且体质较弱，采用了直径90 cm的水池和直径9.5 cm的平台。预实验结果表明，小鼠在更大直径的水池中寻找平台的难度更高。因此，在较大水池中进行的测试并不能真实反映各组之间的差异。实验动物在更大水池且平台更小的情况下，寻找平台的难度进一步增加4。因此，水池和平台的尺寸应根据实验需求及实验动物的具体状况，通过预实验进行优化。
进行MWM测试时，建议使用温度在20–24 °C范围内的水4。老年实验动物在冷水中表现较差13，表明存在明显的与年龄相关的体温调节能力下降14。本研究中，将恒温器置于水池底部，以维持水温在20–24 °C。研究结果显示，四组动物之间的游泳速度无显著差异5。
莫里斯水迷宫（MWM）是一种评估认知功能的强大技术，目前被广泛应用于各类研究中。然而，目前尚无明确定义、统一标准的设备用于开展MWM实验，包括水池和平台的尺寸均缺乏一致性15,16。不同实验室采用的MWM设备规格各不相同，因此研究人员需根据各自的实验需求选择合适的实验装置，这可能给研究者带来困惑。此外，预实验也是必要的。针对MWM等基础实验，仍需开展更多研究。目前，MWM作为实验工具的灵活性仅体现在可根据研究目的选择基本实验方案。因此，该测试可用于更深入地评估认知功能。
披露
作者声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
涂慧玲和丁宁为共同第一作者。李志刚和姜静为共同通讯作者。本研究得到中国国家自然科学基金（项目编号：81804178、81473774 和 81503654）的资助。本文所述方案与结果源自丁宁博士等人的文章《手法针刺调节阿尔茨海默病SAMP8小鼠模型的行为学与脑血流量》。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 针灸针 | 北京中研太和医疗器械有限公司 | 511526 | |
| 台式计算机 | 成都泰盟软件有限责任公司 | Lenovo T4700D | |
| 盐酸多奈哌齐片 | 卫材（中国）药业有限公司 | H20050978 | Aricept |
| 小鼠 | 北京智善医学研究院 | SCXK2014-0003 | |
| 莫里斯水迷宫装置 | 成都泰盟软件有限责任公司 | WMT-100S | |
| 小鼠布袋 | 自制 | ||
| 信号采集与处理系统 | 成都泰盟软件有限责任公司 | BL-420N |
参考文献
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