改进小RNA测序：减少偏差并更好检测2'-O-甲基化RNA

摘要

我们提供了一种偏倚低于标准方法且对2'-O-甲基化RNA具有更高灵敏度的详细小RNA文库构建方案。该方案可使用自制试剂以降低成本，也可使用现成试剂盒以提高操作便利性。

摘要

利用下一代测序技术（NGS）研究小RNA（sRNA）时，文库构建过程中的偏倚问题是一大挑战。多种类型的小RNA，例如植物微小RNA（miRNA），在其3'末端核苷酸上带有2'-O-甲基（2'-OMe）修饰。这种修饰会抑制3'接头连接反应，从而带来额外困难。我们先前已证明，对“TruSeq（TS）”方案进行修饰后的版本可减少偏倚，并更有效地检测2'-OMe修饰的RNA。本文详细描述了整体表现最优的TS5方案。TS5方案既可使用自制试剂，也可使用TS试剂盒中的试剂，两者性能相当。

引言

小分子RNA（sRNA）参与调控多种生物学过程¹。真核生物中具有调控功能的sRNA通常长度在20至30个核苷酸之间；主要包括三类：微小RNA（miRNA）、PIWI相互作用RNA（piRNA）和小干扰RNA（siRNA）。异常的miRNA表达水平已被证实与多种疾病相关²。这凸显了miRNA在健康与疾病中的重要作用，以及开发准确、定量的研究工具以检测sRNA的必要性。

下一代测序（NGS）是一种广泛用于研究小RNA（sRNA）的方法。与定量PCR或微阵列技术（qPCR）等其他方法相比，NGS的主要优势在于无需预先了解sRNA序列，因此可用于发现新的RNA分子；此外，其背景信号和饱和效应更少。同时，NGS能够检测单核苷酸差异，通量也高于微阵列。然而，NGS也存在一些缺点：测序运行成本仍然相对较高，且将样本转化为测序文库所需的多步骤流程可能引入偏差。在典型的sRNA文库构建过程中，首先使用RNA连接酶2（RNL2）的截短形式和预先腺苷酸化的3'接头，在无ATP条件下将3'接头连接至sRNA（通常从总RNA中经凝胶纯化获得）（图1）。该步骤可提高sRNA与接头连接的效率，并减少sRNA环化或串联等副反应的发生。随后，通过RNA连接酶1（RNL1）连接5'接头，再进行逆转录（RT）和PCR扩增。这些步骤均可能引入偏差

方案

1. 小RNA的分离

1. 使用基于苯酚的试剂或其他方法提取总RNA，并验证RNA质量是否良好。
2. 以200 V电压预电泳15% TBE-尿素凝胶（见材料表）15分钟。
3. 在凝胶预电泳的同时，取5–20 µg总RNA（体积为5–15 µL），加入等体积的甲酰胺上样染料（见材料表；含95%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、5 mM EDTA pH 8），于200 µL PCR管中混匀。同样，取10 µL（200 ng）小RNA分子量标记物（见材料表）与等体积甲酰胺上样染料混合。在带加热盖的PCR仪中65 °C孵育5分钟，随后立即将PCR管置于冰上。
4. 将分子量标记物和样品加样至同一块凝胶中，两者之间至少间隔一个泳道，以200 V电压电泳，直至溴酚蓝（深蓝色）迁移至凝胶长度约三分之二处（约40分钟）。
5. 按如下方式准备从凝胶中洗脱RNA的系统：用21号针头在无核酸酶的0.5 mL微量离心管底部打孔，将打孔后的0.5 mL管放入一个无核酸酶的圆底2 mL微量离心管中。
6. 取出凝胶，加入30 mL 水和3 μL核酸凝胶染料（10,000倍浓缩液；见材料表），室温孵育10–15分钟。
7. 在“Dark Reader”透射成像仪上观察凝胶（强烈建议避免使用....

结果

关键步骤包括从起始的总RNA材料中分离小RNA组分（图3）以及获得目标的最终文库产物（图4）。这两个步骤均涉及聚丙烯酰胺凝胶纯化；小RNA从15% TBE尿素凝胶中分离，而最终文库则从6%非变性TBE凝胶中分离。从凝胶中分离的小RNA可在小RNA毛细管电泳芯片上进行分析（材料表；图3B）。这将使用户能够估算回收的小RNA量以及样品中miRNA所占的比例。

对最终文库产物进行凝胶纯化是一个精细的步骤，因为在电泳过程中会形成多种迁移位置接近目标文库的副产物。切勿过量上样，否则会增加文库被其他产物（如接头二聚体）污染的风险。例如（图4），将不同量的PCR扩增文库（来自 B. napus RNA）上样至凝胶，切取对应于预期大小（150 bp）的条带（

讨论

由于偏倚问题，小RNA文库构建仍然具有挑战性，其中主要偏倚来源于接头连接步骤。3'端带有2'-OMe修饰的RNA（例如植物miRNA、昆虫、线虫和哺乳动物中的piRNA，以及昆虫和植物中的小干扰RNA（siRNA））尤其难以研究，因为2'-OMe修饰会抑制3'接头的连接。文献中已提出多种改进小RNA文库构建方案的方法，但目前大多数商业试剂盒仍基于存在严重偏倚的经典TS方法。少数“低偏倚”试剂盒已经出现，例如采用随机化接头并加入PEG进行连接反应的Nf试剂盒，以及最近出现的完全避免接头连接的若干试剂盒¹²。我们此前曾报道，与标准TS方法相比，Nf方法可检测到更多的不同miRNA，而方法“S”（无接头连接）则因副产物显著形成而表现相对较差¹²。令人意外的是，经改进的TS方法对2'-OMe修饰的小RNA检测更为灵敏，但对普通小RNA的检测则不然。本文中，我们选择详细描述TS5方法，该方法在接头末端采用随机化设计，连接反应中使用PEG，并通过磁珠纯化去除过量的3'接头。需要指出的是，另一种使用MRL接头的方法（TS7）可能比TS5方法性能略优。然而，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2100 生物分析仪	Agilent	G2939BA
酸性酚:氯仿，pH 4.5（含IAA，125:24:1）	ThermoFisher	AM9720
腺苷-5'-三磷酸（ATP）	New England Biolabs	P0756S
Agencourt AMPure XP 磁珠	Beckman Coulter	A63880
生物分析仪高灵敏度DNA试剂盒	Agilent	5067-4626
生物分析仪小RNA试剂盒	Agilent	5067-1548
Corning Costar Spin-X 离心管滤器	Sigma Aldrich	CLS8162-96EA
Dark Reader 透射仪	多家供应商
含dNTPs的HotStart PCR试剂盒	Kapa Biosystems	KK2501
NEXTflex 小RNA-seq V3 试剂盒	BIOO Scientific	NOVA-5132-05	可选
Novex 6% TBE 凝胶	ThermoFisher	EC6265BOX
Novex 15% TBE 尿素凝胶	ThermoFisher	EC6885BOX
QIAquick 核苷酸去除试剂盒	Qiagen	28304
Qubit 4 定量起始试剂盒	ThermoFisher	Q33227
Qubit ssDNA 检测试剂盒	ThermoFisher	Q10212
RNA凝胶上样染料（2X）	ThermoFisher	R0641
RNA凝胶上样染料（2X）	ThermoFisher	R0641
鼠源RNase抑制剂	New England Biolabs	M0314S
SuperScript IV 逆转录酶	ThermoFisher	18090200
SYBR Gold 核酸凝胶染料	ThermoFisher	S11494
T4 RNA连接酶1（ssRNA连接酶）	New England Biolabs	M0204S
T4 RNA连接酶2，截短型	New England Biolabs	M0242S
TrackIt 50 bp DNA Ladder	ThermoFisher	10488043
TruSeq 小RNA文库制备试剂盒	Illumina	RS-200-0012/24/36/48	可选
UltraPure 甘油	ThermoFisher	10814010
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
ZR 小RNA Ladder	Zymo Research	R1090
最后两位数字对应索引编号