改进小RNA测序：减少偏差并更好检测2'-O-甲基化RNA

摘要

我们提供了一种偏倚低于标准方法且对2'-O-甲基化RNA具有更高灵敏度的详细小RNA文库构建方案。该方案可使用自制试剂以降低成本，也可使用现成试剂盒以提高操作便利性。

摘要

利用下一代测序技术（NGS）研究小RNA（sRNA）时，文库构建过程中的偏倚问题是一大挑战。多种类型的小RNA，例如植物微小RNA（miRNA），在其3'末端核苷酸上带有2'-O-甲基（2'-OMe）修饰。这种修饰会抑制3'接头连接反应，从而带来额外困难。我们先前已证明，对“TruSeq（TS）”方案进行修饰后的版本可减少偏倚，并更有效地检测2'-OMe修饰的RNA。本文详细描述了整体表现最优的TS5方案。TS5方案既可使用自制试剂，也可使用TS试剂盒中的试剂，两者性能相当。

引言

小分子RNA（sRNA）参与调控多种生物学过程¹。真核生物中具有调控功能的sRNA通常长度在20至30个核苷酸之间；主要包括三类：微小RNA（miRNA）、PIWI相互作用RNA（piRNA）和小干扰RNA（siRNA）。异常的miRNA表达水平已被证实与多种疾病相关²。这凸显了miRNA在健康与疾病中的重要作用，以及开发准确、定量的研究工具以检测sRNA的必要性。

下一代测序（NGS）是一种广泛用于研究小RNA（sRNA）的方法。与定量PCR或微阵列技术（qPCR）等其他方法相比，NGS的主要优势在于无需预先了解sRNA序列，因此可用于发现新的RNA分子；此外，其背景信号和饱和效应更少。同时，NGS能够检测单核苷酸差异，通量也高于微阵列。然而，NGS也存在一些缺点：测序运行成本仍然相对较高，且将样本转化为测序文库所需的多步骤流程可能引入偏差。在典型的sRNA文库构建过程中，首先使用RNA连接酶2（RNL2）的截短形式和预先腺苷酸化的3'接头，在无ATP条件下将3'接头连接至sRNA（通常从总RNA中经凝胶纯化获得）（图1）。该步骤可提高sRNA与接头连接的效率，并减少sRNA环化或串联等副反应的发生。随后，通过RNA连接酶1（RNL1）连接5'接头，再进行逆转录（RT）和PCR扩增。这些步骤均可能引入偏差^3,4。因此，测序读数可能无法真实反映sRNA的实际表达水平，从而导致人为的、依赖于方法的表达模式。某些特定的sRNA可能在文库中被过高或过低代表，而严重低代表的sRNA甚至可能无法被检测到。这一问题在具有3'末端2'-O-甲基（2'-OMe）修饰的植物miRNA、昆虫和植物中的siRNA，以及昆虫、线虫和哺乳动物中的piRNA中尤为复杂¹。这种修饰会强烈抑制3'接头的连接效率⁵，使得这类RNA的文库构建成为一项困难的任务。

先前的研究表明，由于RNA序列/结构的影响，接头连接会引入严重的偏差^{6,7,8,9,10,11}。接头连接后续的步骤，如逆转录和PCR，并不会显著导致偏差^6,11,12。接头连接偏差可能源于这样一个事实：具有特定序列的接头分子会与反应体系中的小RNA（sRNA）分子相互作用，形成共折叠结构，这些结构可能形成有利于或不利于连接的构型（图2）。Sorefan等人的数据⁷表明，RNL1偏好单链环境，而RNL2则偏好双链结构进行连接。由于接头/sRNA共折叠结构由特定的接头和sRNA序列决定，这解释了为何在特定接头组合下某些sRNA会被过度或不足地代表。还需注意的是，在一系列需要相互比较的sRNA文库中，应使用相同的接头序列。事实上，先前已有研究观察到，在测序文库中通过引入不同的条形码序列更换接头会改变miRNA的谱型^9,13。

在连接 junction 附近对接头序列进行随机化，可能降低这些偏差。Sorefan 及其同事⁷使用了在其末端带有4个随机核苷酸的接头，称为"高分辨率"（HD）接头，并证明使用此类接头可构建出更真实反映小RNA（sRNA）表达水平的文库。最近的研究进一步证实了这些发现，并表明随机化区域无需紧邻连接 junction¹¹。这种新型接头被命名为"MidRand"接头。综上所述，这些结果表明，优化的接头设计能够减少偏倚。

除了修饰接头外，还可以通过优化反应条件来抑制偏好性。聚乙二醇（PEG）是一种已知可提高连接效率的大分子拥挤剂¹⁴，已被证明能显著降低偏好性^15,16。基于这些结果，市场上出现了多种"低偏好性”试剂盒。这些试剂盒有的在连接反应中使用PEG，无论是与经典接头还是HD接头联合使用；另一些试剂盒则完全避免连接反应，分别通过3'多聚腺苷酸化和模板转换来添加3'和5'接头¹²。还有一种策略是在3'接头连接后进行环化步骤，从而省去5'接头的连接¹⁷。

在之前的一项研究中，我们致力于寻找一种偏倚尽可能低且对2'-OMe RNA检测效果最佳的小RNA（sRNA）文库构建方案¹²。我们测试了上述几种被称为“低偏倚”的试剂盒，发现它们对2'-OMe RNA的检测能力优于标准方案（TS）。然而令人意外的是，通过对标准方案进行若干改进（包括使用随机接头、在连接反应中添加PEG，以及通过纯化步骤去除过量的3'接头），其在检测2'-OMe RNA方面的表现反而超过了其他商用试剂盒。本文详细描述了一种基于TS方案优化而来的“TS5”方案，该方案在整体上实现了对2'-OMe RNA的最佳检测效果。该方案可使用TS试剂盒中的试剂搭配“Nf”试剂盒中的一种试剂完成；或者为节约成本，也可使用自制试剂，其性能与前者相当。此外，我们还提供了从总RNA中纯化sRNA以及制备预腺苷化3'接头的详细操作流程。 

方案

1. 小RNA的分离

1. 使用基于苯酚的试剂或其他方法提取总RNA，并验证RNA质量是否良好。
2. 以200 V电压预电泳15% TBE-尿素凝胶（见材料表）15分钟。
3. 在凝胶预电泳的同时，取5–20 µg总RNA（体积为5–15 µL），加入等体积的甲酰胺上样染料（见材料表；含95%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、5 mM EDTA pH 8），于200 µL PCR管中混匀。同样，取10 µL（200 ng）小RNA分子量标记物（见材料表）与等体积甲酰胺上样染料混合。在带加热盖的PCR仪中65 °C孵育5分钟，随后立即将PCR管置于冰上。
4. 将分子量标记物和样品加样至同一块凝胶中，两者之间至少间隔一个泳道，以200 V电压电泳，直至溴酚蓝（深蓝色）迁移至凝胶长度约三分之二处（约40分钟）。
5. 按如下方式准备从凝胶中洗脱RNA的系统：用21号针头在无核酸酶的0.5 mL微量离心管底部打孔，将打孔后的0.5 mL管放入一个无核酸酶的圆底2 mL微量离心管中。
6. 取出凝胶，加入30 mL 水和3 μL核酸凝胶染料（10,000倍浓缩液；见材料表），室温孵育10–15分钟。
7. 在“Dark Reader”透射成像仪上观察凝胶（强烈建议避免使用紫外光，以免损伤RNA），切下位于17 nt与29 nt分子量标记条带之间的小RNA条带。将凝胶片段转移至第1.5步中的0.5 mL管中。
8. 将装有凝胶片段的0.5 mL管放入2 mL管中，于微量离心机中以最大转速离心2分钟。取出已空的0.5 mL管。
9. 向含有破碎凝胶的2 mL管中加入300 µL无核酸酶的0.3 M NaCl溶液，室温下旋转孵育至少2小时，或4 °C过夜（16小时）。
10. 将破碎凝胶的悬浮液转移至离心柱中（见材料表），于微量离心机中以最大转速离心2分钟。
11. 加入1 µL（20 µg/µL）糖原（见材料表）和950 µL室温100%乙醇。于-80 °C孵育至少30分钟。
12. 在4 °C条件下以最大转速离心20分钟。弃去上清液，用800 µL预冷的80%乙醇洗涤沉淀。再次于4 °C离心5分钟，小心吸除所有上清液。将RNA沉淀重悬于15 µL无核酸酶水中。通常可回收约5–20 ng小RNA，回收量取决于起始总RNA的投入量（每1 µg总RNA可回收约1 ng小RNA）。
13. 建议增加步骤：检测回收的小RNA的浓度与质量（例如，使用小RNA检测试剂盒进行毛细管凝胶电泳；见材料表）。

2. 预腺苷酸化3' HD接头的制备

注意：3' HD 接头的预腺苷化处理方法与 Chen 等人¹⁸所述方案类似。请注意，可直接订购预腺苷化接头（/5rApp/ 修饰），但成本较高。

1. 订购5'端磷酸化、3'端封闭的3' HD接头寡核苷酸。接头序列及修饰信息见表1。注意，“3AmMO”为3'端氨基修饰基团，大多数供应商均可提供此类修饰的寡核苷酸。用无核酸酶水稀释至100 µM。
2. 配制100 µL反应体系，包含以下试剂：10 µL寡核苷酸（100 µM）、10 µL T4 RNA连接酶缓冲液（10×）、10 µL ATP（10 mM）、40 µL 50% PEG8000、5 µL T4 RNA连接酶1（50单位）、25 µL无核酸酶水。20 °C过夜孵育。
3. 对预腺苷化寡核苷酸进行经典的酚-氯仿抽提，随后进行乙醇沉淀。加入100 µL酸性（pH 4.5）酚:氯仿溶液，涡旋混匀。室温下高速离心5分钟 。小心转移90 µL上层水相至新离心管；加入10 µL 3 M乙酸钠（pH 5.2）、1 µL超纯糖原及250 µL预冷的100%乙醇。
4. 于-20 °C静置至少30分钟。4 °C下最大转速离心30分钟。弃去上清液，用500 µL预冷的80%乙醇洗涤沉淀一次。作为酚-氯仿抽提与乙醇沉淀的替代方法，可使用核苷酸去除试剂盒（见材料表）。将沉淀溶于25 µL水中。
5. 使用专用于单链DNA检测的定量试剂盒测定接头浓度（见材料表）。稀释至80 ng/µL（10 µM）。 
6. 建议增加步骤：通过15% TBE-尿素凝胶电泳（见材料表）检测预腺苷化效率，取1 µL 10 µM接头与未经处理的寡核苷酸一同上样。预腺苷化接头的迁移速度应略慢于未经处理的寡核苷酸。如需要， 可对预腺苷化接头进行凝胶纯化；操作步骤同上（1.2–1.12步）。

3. 文库构建 - 方案 TS5

注意：我们在此介绍之前描述过的改良型 TS 方案“TS5”¹²，该方案可使用试剂盒中的试剂或自行提供的试剂进行。需要指出的是，我们曾使用另一种方案“TS7”获得了相似甚至略优的结果。然而，TS7 方案更难去除接头二聚体。因此，我们选择详细描述 TS5 方案，但可通过简单替换接头的方式采用 TS7 方案。对于 TS7，请使用“类中段随机（MidRand-Like, MRL）”接头序列（表 1）。请注意，此处随机化区域位于接头的中间位置。逆转录和 PCR 引物将分别与 3' 接头中随机区域下游序列以及 5' 接头中随机区域上游序列杂交。测序将从 5' 接头中的第一个随机化核苷酸开始。

1. 3'接头连接。
   1. 在0.2 mL微量离心管中，将1 µL预腺苷化3' HD接头（10 µM）与1 µL纯化的小RNA（~0.1–1 µM）混合。在热循环仪中于72 °C孵育2分钟，然后立即置于冰上。
   2. 加入4 µL 50% PEG 8000（黏稠溶液；缓慢移液），1 µL RNA连接酶缓冲液（10×），1 µL H₂O，1 µL T4 RNA连接酶2截短型，以及1 µL RNase抑制剂。于16 °C过夜孵育。
2. 去除未连接的3'接头
   1. 加入10 µL无核酸酶水并充分混匀。加入6 µL 3 M NaOAc pH 5.2或Nf试剂盒中的“接头耗竭溶液”（材料表），并充分混匀。加入40 µL磁性纯化珠（材料表）和60 µL异丙醇，并充分混匀。室温孵育5分钟。
   2. 将样品置于磁力架上，直至溶液变澄清。移除并弃去上清液。
   3. 加入180 µL新配制的80%乙醇。孵育约30秒后移除。注意使用新配制的80%乙醇，且避免长时间孵育在80%乙醇中。
   4. 短暂离心管子，去除可能积聚在孔底的残留液体。让磁珠干燥2分钟，然后重悬于22 µL 10 mM Tris pH 8或Nf试剂盒中的重悬缓冲液中。孵育2分钟，然后将样品置于磁力架上直至溶液变澄清。
   5. 在新管中加入6 µL 3 M NaOAc pH 5.2或Nf试剂盒中的“接头耗竭溶液”（材料表） 。将上一步的20 µL上清液转移至该新管中，并通过移液混匀。加入40 µL磁性珠和60 µL 100%异丙醇，并通过移液充分混匀。孵育5分钟。
   6. 将样品置于磁力架上直至溶液变澄清，然后移除并弃去上清液。
   7. 加入180 µL新配制的80%乙醇。孵育约30秒后移除。注意使用新配制的80%乙醇，且避免长时间孵育在80%乙醇中。
   8. 短暂离心管子，去除可能积聚在孔底的残留液体。让磁珠干燥2分钟，然后重悬于10 µL无核酸酶水中。孵育2分钟，然后将样品置于磁力架上直至溶液变澄清。
   9. 将9 µL上清液转移至新管。加入1 µL T4 RNA连接酶缓冲液（10×）和1 µL水。或者，加入2 µL TS试剂盒中的连接酶缓冲液。
3. 5'接头连接。
   1. 在带有加热盖的热循环仪中，将1 µL 5' HD接头（10 µM；表1）加入一个200 µL PCR管中。于70 °C孵育2分钟，然后立即将管子置于冰上。
   2. 加入1 µL 10 mM ATP和1 µL T4 RNA连接酶1。轻轻移液充分混匀。取3 µL该混合液加入第3.2.9步中已连接3'接头的RNA中，并通过移液混匀。于28 °C孵育1小时。
4. 逆转录（RT）
   1. 将6 µL已连接3'和5'接头的RNA转移至新的200 µL PCR管中（如有需要，将剩余约8 µL保存于-80 °C备用）。加入1 µL RT引物（10 µM；表1），并通过移液混匀。于70 °C孵育2分钟，然后立即将管子置于冰上。
   2. 加入以下逆转录试剂：2 µL 5×第一链缓冲液，0.5 µL 12.5 mM dNTP混合物，1 µL 100 mM DTT，1 µL RNase抑制剂，以及1 µL逆转录酶（材料表）。于50 °C孵育1小时。
5. PCR扩增
   1. 向12.5 µL逆转录反应混合物中加入以下试剂：10 µL PCR聚合酶缓冲液，2 µL通用P5引物（10 µM；表1），2 µL P7-index引物（10 µM；表1），1 µL 12.5 mM dNTPs，0.5 µL DNA聚合酶（材料表），以及22 µL水。反应物保持在冰上直至使用。
   2. 运行以下PCR程序：98 °C 30秒，11个循环（98 °C 10秒，60 °C 30秒，72 °C 15秒），最后72 °C延伸10分钟。反应结束后将样品保持在4 °C。
      注：关于PCR循环数，我们通常进行11个循环，但用户应根据实际情况优化。尽量使用最少可能的PCR循环数。
6. 凝胶纯化
   1. 取5、10和20 µL PCR产物，与合适的DNA分子量标记物（见材料表）一起上样至原生6% TBE凝胶（见材料表）。在145 V电压下电泳约1小时（直至溴酚蓝迁移至凝胶底部；该染料迁移位置约为65 bp）。
   2. 取出凝胶，加入核酸染色剂水溶液（见材料表）中孵育10–15分钟。
   3. 在"Dark Reader"透射式光源上观察凝胶（强烈建议避免使用紫外光，因其可能损伤RNA），切下150 bp处的文库条带。按照第1.5步所述准备系统以从凝胶中洗脱RNA，并将凝胶片段转移至0.5 mL离心管中。
   4. 在微量离心机中以最大速度离心2分钟。移除此时应为空的0.5 mL管。
   5. 向含有破碎凝胶的2 mL管中加入300 µL无核酸酶水，并在室温下旋转至少2小时，或在4 °C过夜。
   6. 将水中破碎凝胶的悬浮液转移至离心柱中，以最大速度离心2分钟。
   7. 加入1 µL（20 µg/µL）糖原，30 µL 3 M NaOAc和975 µL冰冻100%乙醇。在4 °C下以最大速度离心20分钟。
   8. 将沉淀重悬于20 µL 10 mM Tris pH 8中。取1 µL用于浓度测定，1 µL用于质量控制。

4. 数据分析

注意：以下所述的数据分析流程基于 Linux 操作系统 Ubuntu 16.04 LTS。

1. 原始序列文件的处理
   1. 下载测序运行期间生成的 FASTQ 序列文件。如有需要，使用 bcl2fastq2（版本 V2.2.18.12；手册可从以下链接下载：http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html）进行解复用。
      使用以下命令：
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatches 1 --aggregated-tiles AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16
   2. 使用 Cutadapt¹⁹ 版本 1.15 去除接头序列。手册可在此处下载：https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html。
      使用以下命令：
      Pathway_to_cutadapt/cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG  -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz
      请注意，命令中的序列为 3’ HD 接头序列，不包含 4 个随机核苷酸；因此这些随机核苷酸在此步骤中不会被去除。
   3. 使用 seqtk（https://github.com/lh3/seqtk）去除测序读段末端的随机核苷酸。使用以下命令（变量名以粗体表示）：
      seqtk trimfq -b 4 -e 4 Output_File_Read1_cutadapt.fastq > Output_File_Read1_trimmed.fastq
   4. 使用以下 awk 命令丢弃长度短于 10 nt 的序列：
      awk 'BEGIN {FS = "\t" ; OFS = "\n"} {header = $0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; if (length(seq) >= 10) {print header, seq, qheader, qseq}}' Output_File_Read1_trimmed.fastq > Length_Filtered.fastq
2. 修剪后序列的比对
   1. 从 miRBase 下载对应研究生物的数据库。访问 http://www.mirbase.org/ftp.shtml 并下载“mature.fa”文件。请注意，序列以 RNA 表示法给出。使用以下命令将 U 残基替换为 T：
      sed -i '/^>/! s/U/T/g' mature.fa
      注意：这将生成 miRBase 中所有 miRNA 的完整列表，这些 miRNA 来自多种生物。
   2. 使用以下命令选择目标生物的 miRNA 序列：
      awk 'name_of_the_organism{print; nr[NR+1]; next}; NR in nr' mature.fa > mature_name_of_the_organism_mirs.fa
   3. 使用 Bowtie2²⁰（版本 2.3.0）将读段比对至上述创建的文件，且不允许错配。首先，使用以下命令为文件构建索引：
      bowtie2-build mature_name_of_the_organism_mirs.fa mature_name_of_the_organism_mirs
   4. 将测序读段比对至数据库，要求读段完全匹配数据库中的某个 miRNA，且无任何错配。为此，请使用以下工具：
      bowtie2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --end-to-end --time -x mature_name_of_the_organism_mirs -U Length_Filtered.fastq -S Length_Filtered_ALIGNMENT.sam
      注意：选项 --score-min C,0,0 确保比对过程中无任何错配。有关该工具中各参数的说明，请访问以下网站：http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
   5. 使用以下命令丢弃未比对上的读段：
      samtools view -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs.sam
      注意：经过上述步骤后，您应已获得对应于 miRNA 的比对读段。

结果

关键步骤包括从起始的总RNA材料中分离小RNA组分（图3）以及获得目标的最终文库产物（图4）。这两个步骤均涉及聚丙烯酰胺凝胶纯化；小RNA从15% TBE尿素凝胶中分离，而最终文库则从6%非变性TBE凝胶中分离。从凝胶中分离的小RNA可在小RNA毛细管电泳芯片上进行分析（材料表；图3B）。这将使用户能够估算回收的小RNA量以及样品中miRNA所占的比例。

对最终文库产物进行凝胶纯化是一个精细的步骤，因为在电泳过程中会形成多种迁移位置接近目标文库的副产物。切勿过量上样，否则会增加文库被其他产物（如接头二聚体）污染的风险。例如（图4），将不同量的PCR扩增文库（来自 B. napus RNA）上样至凝胶，切取对应于预期大小（150 bp）的条带（

讨论

由于偏倚问题，小RNA文库构建仍然具有挑战性，其中主要偏倚来源于接头连接步骤。3'端带有2'-OMe修饰的RNA（例如植物miRNA、昆虫、线虫和哺乳动物中的piRNA，以及昆虫和植物中的小干扰RNA（siRNA））尤其难以研究，因为2'-OMe修饰会抑制3'接头的连接。文献中已提出多种改进小RNA文库构建方案的方法，但目前大多数商业试剂盒仍基于存在严重偏倚的经典TS方法。少数“低偏倚”试剂盒已经出现，例如采用随机化接头并加入PEG进行连接反应的Nf试剂盒，以及最近出现的完全避免接头连接的若干试剂盒¹²。我们此前曾报道，与标准TS方法相比，Nf方法可检测到更多的不同miRNA，而方法“S”（无接头连接）则因副产物显著形成而表现相对较差¹²。令人意外的是，经改进的TS方法对2'-OMe修饰的小RNA检测更为灵敏，但对普通小RNA的检测则不然。本文中，我们选择详细描述TS5方法，该方法在接头末端采用随机化设计，连接反应中使用PEG，并通过磁珠纯化去除过量的3'接头。需要指出的是，另一种使用MRL接头的方法（TS7）可能比TS5方法性能略优。然而，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2100 生物分析仪	Agilent	G2939BA
酸性酚:氯仿，pH 4.5（含IAA，125:24:1）	ThermoFisher	AM9720
腺苷-5'-三磷酸（ATP）	New England Biolabs	P0756S
Agencourt AMPure XP 磁珠	Beckman Coulter	A63880
生物分析仪高灵敏度DNA试剂盒	Agilent	5067-4626
生物分析仪小RNA试剂盒	Agilent	5067-1548
Corning Costar Spin-X 离心管滤器	Sigma Aldrich	CLS8162-96EA
Dark Reader 透射仪	多家供应商
含dNTPs的HotStart PCR试剂盒	Kapa Biosystems	KK2501
NEXTflex 小RNA-seq V3 试剂盒	BIOO Scientific	NOVA-5132-05	可选
Novex 6% TBE 凝胶	ThermoFisher	EC6265BOX
Novex 15% TBE 尿素凝胶	ThermoFisher	EC6885BOX
QIAquick 核苷酸去除试剂盒	Qiagen	28304
Qubit 4 定量起始试剂盒	ThermoFisher	Q33227
Qubit ssDNA 检测试剂盒	ThermoFisher	Q10212
RNA凝胶上样染料（2X）	ThermoFisher	R0641
RNA凝胶上样染料（2X）	ThermoFisher	R0641
鼠源RNase抑制剂	New England Biolabs	M0314S
SuperScript IV 逆转录酶	ThermoFisher	18090200
SYBR Gold 核酸凝胶染料	ThermoFisher	S11494
T4 RNA连接酶1（ssRNA连接酶）	New England Biolabs	M0204S
T4 RNA连接酶2，截短型	New England Biolabs	M0242S
TrackIt 50 bp DNA Ladder	ThermoFisher	10488043
TruSeq 小RNA文库制备试剂盒	Illumina	RS-200-0012/24/36/48	可选
UltraPure 甘油	ThermoFisher	10814010
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
ZR 小RNA Ladder	Zymo Research	R1090
最后两位数字对应索引编号