通过抑制外排泵提高流式细胞术检测造血干细胞和祖细胞线粒体膜电位的准确性

摘要

异源物质外排泵在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中具有高度活性，会导致线粒体膜电位荧光染料TMRM被排出。本文介绍了一种在维拉帕米（一种外排泵抑制剂）存在的情况下，使用TMRM准确测定HSPCs中线粒体膜电位的实验方案。

摘要

由于细胞代谢是造血干细胞（HSC）自我更新的关键调控因素，HSC 研究人员已广泛研究了线粒体在造血稳态中的多种作用。线粒体的活性水平可通过其膜电位（ΔΨm）来反映，而膜电位可利用细胞通透性的阳离子染料（如 TMRM（四甲基罗丹明甲酯））进行检测。然而，外排泵将这些染料从细胞中排出的能力可能限制其应用效果。这种测量偏差在评估 HSC 时尤为关键，因为异源物质转运蛋白在 HSC 中的表达水平和活性高于分化细胞。本文介绍了一种利用外排泵抑制剂维拉帕米（Verapamil）准确测量骨髓中多个细胞群 ΔΨm 的实验方案。结果显示，抑制外排泵活性可提高造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中的 TMRM 荧光强度，而在成熟细胞组分中该强度则相对保持不变。这凸显了在使用依赖 ΔΨm 的染料时，必须密切关注染料外排活性的重要性；本方案通过文字描述与图示展示，可用于准确比较骨髓内不同细胞群之间，或不同实验模型中同一细胞群的 ΔΨm 水平。

引言

造血干细胞（HSCs）具有自我更新能力、多向分化潜能，并能产生血液中的所有细胞类型^1,2。细胞代谢与转录因子、内在信号及微环境共同，是调控HSC维持的关键因素^3,4,5。因此，线粒体功能和质量的恰当调控对HSC的维持至关重要^6,7。

线粒体膜电位（ΔΨm）是评估线粒体功能的关键参数，因为它直接反映了线粒体的功能状态，这种功能源于电子传递链中质子泵活动与F₁/F_O ATP合酶介导的质子回流之间的平衡。这两种过程均是氧依赖性ADP磷酸化生成ATP所必需的，其活性取决于基因表达和底物的可利用性^8,9。利用线粒体区室的电负性特性，已开发出多种电位敏感性染料用于检测ΔΨm。其中一种是高氯酸四甲基罗丹明甲酯（TMRM），该染料已被广泛用于通过流式细胞术在多种细胞中测定ΔΨm¹⁰，包括造血干细胞和祖细胞¹¹。 

然而，在造血干细胞（HSCs）中使用线粒体染料时必须谨慎，因为这些细胞中外源性物质外排泵的活性很高，可能导致染料被排出¹²。事实上，线粒体染料（如罗丹明123）的外排已被研究人员用于分离HSCs¹³，或通过利用Hoechst Blue与Hoechst Red染料外排的差异来鉴定HSC的“侧群”细胞^14,15。此外，已有研究表明，Fumitremorgin C（一种ATP结合盒亚家族G成员2（ABCG2）转运蛋白的特异性抑制剂）并不影响MitoTracker在造血祖细胞（HSPCs）中的染色模式¹⁶。在这些结果发表后，多项研究在未使用外源性物质外排泵抑制剂的情况下使用了线粒体染料，从而普遍认为HSCs仅含有少量线粒体且线粒体膜电位（ΔΨm）较低^16,17,18。

然而，最近有研究表明，维拉帕米（Verapamil）——一种广谱外排泵抑制剂——会显著改变线粒体染料MitoTracker Green的染色模式¹⁹。这种差异很可能是由于Fumitremorgin C对Abcg2具有高度选择性，而造血干细胞（HSCs）还表达其他转运蛋白，例如Abcb1a（该蛋白对Fumitremorgin C仅表现出微弱敏感性）¹⁹。我们还报道过，其他线粒体染料（如TMRM、壬基吖啶橙和Mitotracker Orange（MTO））表现出与MitoTracker Green相同的染色模式。更重要的是，我们观察到造血干/祖细胞（HSPCs）的流式细胞术图谱不仅反映其线粒体质量，还反映其线粒体膜电位（ΔΨm）¹¹。

TMRM 染料的摄取严格依赖于线粒体的负电荷，但染料的最终积累量处于摄取与外排泵清除之间的动态平衡状态²⁰。造血干细胞（HSCs）与成熟细胞群体之间外源性物质外排泵表达水平的差异会影响这一平衡，可能导致结果偏差。因此，在使用电位敏感性染料分析膜电位（ΔΨm）时，应考虑使用维拉帕米等特异性抑制剂。本文介绍了一种基于 TMRM 的流式细胞术精确测定 ΔΨm 的改进方案，该方法通过使用特异性抑制剂校正外源性物质转运蛋白活性对结果的影响。

方案

本文所述所有方法均已获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 溶液的配制

1. 染色缓冲液（磷酸盐缓冲液 (PBS) + 2% 胎牛血清 (FBS)）：在500 mL无菌PBS溶液中加入10 mL FBS。
   注意：该溶液可在无菌条件下于4 °C保存至少一个月。开始后续操作前，将一份该溶液（50 mL）置于冰上预冷。
2. ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液：在开始实验前，将一份ACK裂解缓冲液（1 mL）置于冰上预冷。
   注意：如需配制相同成分的非商用缓冲液，可将8.02 g NH₄Cl、1 g KHCO₃ 和37.2 mg Na₂EDTA 溶解于1 L H₂O中，调节pH至7.2–7.4。可在室温下保存长达6个月。
3. 培养基：在无血清培养基中加入50 ng/mL干细胞因子 (SCF) 和50 ng/mL血小板生成素 (TPO)，用于造血细胞的培养与扩增（推荐的商用培养基见材料表）。
4. TMRM储存液：将5 μg TMRM粉末溶于10 mL乙醇中，配制成1 μM的TMRM溶液。避光保存于-20 °C。
5. 维拉帕米储存液：将24 mg维拉帕米溶于1 mL乙醇中，配制成50 mM的维拉帕米溶液。保存于-20 °C。
6. FCCP储存液：将254 mg羰基氰化对三氟甲氧基苯腙 (FCCP) 溶于1 mL乙醇中，配制成1 M的FCCP溶液。避光保存于-20 °C。

2. 骨髓分离

1. 根据机构指南，通过吸入 CO₂ 处死小鼠，并用 70% 乙醇喷洒小鼠。
   注意：此步骤可防止目标细胞污染，同时不影响实验结果。
2. 使用镊子和锋利的剪刀，在小鼠腹侧皮肤上剪开一个小口，并将皮肤拉伸。
3. 取出股骨和胫骨，注意不要松动股骨头，因其含有大量骨髓细胞。将取出的骨骼置于盛有 1.5 mL 染色缓冲液的 6 孔板中。
   注意：此操作无需在无菌环境中进行。
4. 去除骨骼上的肌肉组织，并剪去骨两端，以便骨髓流出（图 1A）。将清理后的骨骼放入新的孔中，每孔加入 1.5 mL 染色缓冲液。
   注意：必须仔细去除肌肉和其他组织，以避免下一步操作中堵塞注射器。
5. 使用带有 25 G 针头的 3 mL 注射器冲洗骨髓。
   注意：持续冲洗骨髓，直至骨骼变白（图 1B）。
6. 将所有细胞收集至 1.5 mL 离心管中，以 180 × g 离心 5 分钟，弃去上清液（图 1C）。
7. 将沉淀物小心地重悬于 300 μL 冰冷的 ACK 裂解缓冲液中，冰上孵育 1 分钟，立即加入 1 mL 染色缓冲液以终止裂解反应。以 180 × g 离心 5 分钟。
   注意：细胞沉淀呈白色（图 1D）。分离得到的细胞总数约为 2–4 × 10⁷。
8. 将沉淀物重悬于 1 mL 染色缓冲液中，使用带 35 μm 尼龙滤网的细胞滤器帽（12 × 75 mm²，容量 5 mL）过滤，以获得单个核细胞。阻断后，将样品置于冰上保存。

3. 肝星状细胞检测的免疫染色

1. 制备谱系（Lin）抗体混合液。在400 μL染色缓冲液中加入以下生物素标记的抗体各4 μL：抗CD3e、CD4、CD8、B220、CD11b、Gr1、Ter119、CD19、Nk1.1、IgM和Il7Ra，使终浓度为1:100。
2. 制备荧光素偶联抗体（Abs）。在400 μL染色缓冲液中加入以下抗体各4 μL，使终浓度为1:100：链霉亲和素-太平洋蓝（Streptavidin-Pacific Blue）、Sca1-PE/Cy7、c-kit-APC/Cy7、CD48-APC、CD150-PerCP/Cy5.5和CD34-FITC。置于冰上，避光保存。
3. 将样品以180 × g离心5分钟，弃去上清液。
4. 向细胞沉淀中加入400 μL Lin抗体混合液，再加入4 μL CD135-生物素标记抗体。快速涡旋混匀，冰上孵育30分钟。
5. 加入3 mL染色缓冲液洗涤样品，以180 × g离心5分钟，弃去上清液。
6. 加入400 μL抗体溶液，快速涡旋混匀，冰上孵育30分钟。
7. 用3 mL染色缓冲液洗涤样品，以180 × g离心5分钟，弃去上清液。

4. TMRM 染色

1. 配制TMRM染色液。在1.1 mL含TPO和SCF的无血清造血细胞培养与扩增培养基中（参见材料表中推荐的商品化培养基），加入2.2 μL TMRM储备液和1.1 μL维拉帕米（终浓度分别为2 nM和50 μM）。
   注意：这是本实验方案中最关键的步骤。必须添加维拉帕米以阻断在造血干细胞（HSCs）中高表达的外排泵，这些泵可将TMRM排出细胞外。
2. 将骨髓细胞重悬于1 mL TMRM染色液中，快速涡旋混匀后，在37 °C孵育1小时。
   注意：TMRM染色后无需洗涤去除。用于PE通道专用补偿对照的样本也需重悬于100 μL TMRM染色液中，快速涡旋后于37 °C孵育1小时。
3. 使用带35 μm尼龙滤网的细胞筛帽（12 x 75 mm²，容量5 mL）过滤样品，以防止流式细胞仪发生堵塞。
   注意：TMRM染色会增加样品中形成堵塞的风险。建议在进行流式检测前对样品进行过滤处理。
4. 加入1 μL 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），通过流式细胞术排除死细胞。

5. 流式细胞仪检测

1. 运行骨髓样本，至少获取 1 × 10⁶ 个事件。
2. 建立设门策略以鉴定不同的造血细胞群体（图 2）。
   1. 在Pacific Blue图中显示活骨髓单个核细胞（BM-MNCs），即DAPI⁻组分，以鉴定CD135⁻Lin⁻（Lin⁻）和Lin⁺组分。
   2. 在APC/Cy7（c-kit）对PE/Cy7（Sca-1）图中分析Lin⁻组分，鉴定多能祖细胞（MPP）组分，即c-kit⁺且Sca-1⁺。
   3. 在APC（CD48）对PerCP/Cy5.5（CD150）图中分析MPP组分，鉴定造血干细胞（HSC）组分，即CD150⁺且CD48⁻。
   4. 在FITC（CD34）图中显示HSC组分，区分CD34⁻-HSC和CD34⁺-HSC。
3. 获取各细胞群的TMRM荧光强度（PE通道）。
4. 采集完成后，向样本中加入1 μL FCCP，使其终浓度为1 mM，37 °C孵育5分钟，然后再次获取1 × 10⁶ 个事件。
   注意：FCCP是一种线粒体解偶联剂，用于消除线粒体膜电位（ΔΨm），作为实验对照以确认TMRM染色功能正常。加入FCCP后，TMRM荧光强度应显著降低（图 3A）。
5. 分析数据时，将各细胞群PE通道的平均荧光强度归一化为全部BM-MNCs的PE通道强度。

结果

上述方案可轻松实现从小鼠模型中分离骨髓单个核细胞。图1总结了该方案的主要步骤：骨骼分离、骨髓冲洗、红细胞裂解，以及抗体染色后进行TMRM染色，以检测特定造血细胞群体中的线粒体膜电位。

骨髓单个核细胞（BM-MNCs）包含多种细胞群体，其中包括造血干细胞（HSCs）。本方案中所用的抗体混合物已广泛用于纯化HSCs（CD34⁻ 和 CD34⁺）、多能祖细胞（MPPs）、Lin⁻ 以及 Lin⁺ 细胞²¹。分离这些细胞亚群的设门策略见图2。

在确定目标细胞群后，评估TMRM荧光强度，其信号应呈现明亮状态。强烈推荐在无血清扩增培养基（SFEM）中进行TMRM染色，因为在PBS加2% FBS中染色可能导致造血干/祖细胞（HSPCs）中的TMRM信号特征发生改变（

讨论

线粒体膜电位的测量是分析和评估线粒体功能的核心方法，而线粒体对细胞的代谢状态至关重要。本文介绍了一种利用TMRM染色法分析ΔΨm的实验方案。TMRM是一种可穿透细胞膜的荧光染料，能够因ΔΨm的存在而在具有活性的线粒体中富集，其在细胞外、胞质和线粒体各组分间的分布保持动态平衡¹⁰。该方案可适用于多种染料，包括四甲基罗丹明乙酯（TMRE）和JC-1。合适的染色条件对于获得准确结果至关重要，这些条件包括：避免光照、适当的孵育时间、维持恒定温度（37 °C）以及控制细胞外染料浓度。当TMRM染料尚未达到完全平衡时，在流式细胞术的数据采集过程中可能会检测到染色强度的意外变化。因此，建议TMRM的染色时间应为1小时，而非某些TMRM产品说明书中提到的30分钟。此外，建议在5分钟内至少连续采集样本两次，以评估染料信号的稳定性。

该实验方案的另一个关键步骤是抗体与染料之间高效的颜色匹配。造血细胞群体可通过流式细胞术，利用已确立的表面标志物进行检测²¹。本文所述的设门策略（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ACK 裂解缓冲液	Life Technologies	A1049201
B220-生物素	BD Bioscience	553086
CD3e-生物素	Life Technologies	13-0031-85
CD4-生物素	Fischer Scientific	BDB553782
CD8-生物素	Life Technologies	13-0081-85
CD11b-生物素	BD Bioscience	553309
CD19-生物素	BD Bioscience	553784
CD34-FITC	eBioscience	11-0341-85
CD48-APC	eBioscience	17-0481-82
CD135-生物素	eBioscience	13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5	Biolegend	115922
c-kit-APC/Cy7	Biolegend	105826
环孢素 H	Millipore Sigma	SML1575-1MG
DAPI 溶液 (1 mg/mL)	Life Technologies	62248
胎牛血清 (FBS)	Denville	FB5001-H
FCCP	Millipore Sigma	C2920-10MG
Gr1-生物素	Biolegend	108404
IgM-生物素	Life Technologies	13-5790-85
Il7Rα-生物素	eBioscience	13-1271-85
Nk1.1-生物素	Fischer Scientific	BDB553163
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Life Technologies	10010023
Sca-1-PE/Cy7	eBioscience	25-5981-81
SCF 小鼠	PEPROTECH	250-03-10UG
StemSpan SFEM 培养基	STEMCELL technologies	9605
链霉亲和素-太平洋蓝	eBioscience	48-4317-82
Ter119-生物素	Fischer Scientific	BDB553672
TMRM	Millipore Sigma	T5428-25MG
TPO	PEPROTECH	315-14-10UG
盐酸维拉帕米	Millipore Sigma	V4629-1G