成年斑马鱼端脑内质粒DNA体内递送的电穿孔方法

摘要

本文介绍了一种用于在成年斑马鱼端脑中递送质粒DNA并标记室管膜胶质细胞的电穿孔方法。该方案是一种快速高效地观察和示踪单个室管膜胶质细胞的技术，为将电穿孔技术应用于广泛的遗传操作提供了新的可能性。

摘要

电穿孔是一种转染方法，通过向细胞施加电场，在细胞膜上形成临时孔隙，从而增加其通透性，使不同分子得以进入细胞。本文中，采用电穿孔技术将质粒导入成年斑马鱼端脑室区壁的室管膜胶质细胞。这些细胞中的一部分具有干细胞特性，可在斑马鱼大脑中生成新的神经元；因此，研究其行为对于明确其在神经发生和再生过程中的作用至关重要。通过电穿孔导入质粒，可实现对单个室管膜胶质细胞的长期标记与追踪。此外，可将如Cre重组酶或Cas9等质粒递送至单个室管膜胶质细胞，从而实现基因重组或基因编辑，为在受控且自然的环境中评估细胞自主性基因功能提供了独特机会。最后，本详细、分步的电穿孔实验方案可用于成功将质粒导入大量单个室管膜胶质细胞中。

引言

斑马鱼是研究脑部刺伤后再生的优良动物模型。与哺乳动物相比，在进化阶梯上较为低等的物种（如斑马鱼）通常表现出更高的持续性神经发生率以及更广泛的成体神经干细胞分布区域，从而在成体生命期间持续不断地在大脑大多数区域生成新的神经元。这一特征似乎与斑马鱼显著更强的再生能力密切相关¹，因为斑马鱼在已研究的大多数脑损伤模型中均展现出高效生成新神经元的卓越潜力^{2,3,4,5,6,7,8}。本研究聚焦于斑马鱼的端脑，因其是成年期神经发生显著的脑区。这些成体神经发生区域与成年哺乳动物脑内的神经发生区具有同源性^9,10,11。

由于存在类似放射状胶质细胞或室管膜胶质细胞的细胞，斑马鱼端脑中具有丰富的神经发生区域。室管膜胶质细胞作为内源性成体神经干细胞，在完整大脑和再生大脑中新神经元的生成过程中发挥重要作用^3,5。谱系追踪实验表明，脑室周围的室管膜胶质细胞在受到损伤后会被激活，随后增殖并产生新的成神经细胞，这些细胞迁移至损伤部位⁵。由于斑马鱼端脑具有外翻的结构特征，室管膜胶质细胞排列于脑室表面，并构成腹侧脑室壁；而背侧脑室壁则由一层背侧室管膜细胞形成（图1A）。重要的是，斑马鱼的室管膜胶质细胞兼具哺乳动物放射状胶质细胞和室管膜细胞的特征：长的放射状突起是放射状胶质细胞的典型特征，而细胞突起、紧密连接结构以及其位于脑室表面的位置则是室管膜细胞的典型特征^12,13,14。因此，这类细胞被称为室管膜胶质细胞。

为了在再生过程中追踪单个室管膜胶质细胞的体内行为，需要对这些细胞进行可靠地标记。此前已有多种用于荧光显微镜的活体细胞标记方法被报道，例如内源性报告基因或脂溶性染料¹⁵。与电穿孔相比，这些方法可能需要更长的时间，且通常无法实现单细胞标记或长期稳定的示踪。而电穿孔技术除了能够实现单细胞标记外，还具备将外源DNA导入宿主细胞的可能性。此外，与其他将DNA转入细胞的方法相比，电穿孔已被证明是最高效的方法之一^16,17,18,19。

本文展示了一种经过优化的电穿孔实验方案，旨在对成年斑马鱼端脑中的单个室管膜胶质细胞进行标记。该方案可实现对单个室管膜胶质细胞的标记，从而能够对这些细胞进行长期追踪²⁰，或以细胞自主的方式调控特定信号通路^21,22。

方案

本方案中使用的所有动物均在标准饲养条件下进行培育，实验操作均遵循欧盟以及上巴伐利亚政府的动物使用指南和规定（许可编号：AZ 55.2-1-54-2532-0916）。

1. 电穿孔用质粒混合物的制备

1. 将目标质粒溶解于无菌水中，并加入快绿染料储备液［1 mg/mL］。确保质粒的终浓度为  ∼1 µ克/µL. 加入染料的浓度不超过3%，因为其唯一作用是为溶液着色，以便观察脑室注射情况。
2. 配制完成后，通过反复吹打或轻弹管壁混匀质粒溶液。室温（RT）保存，待用。
   注意： 对于将两种质粒共电穿孔转入同一细胞，需确保混合物中每种质粒的浓度均至少为 0.8 ng/µL，以1:1的摩尔比混合，以获得80%–90%的共电穿孔效率。

2. 注射与电穿孔实验的准备工作

1. 在拉针仪中准备好用于注射的玻璃毛细管（外径 1 mm，内径 0.58 mm）。
2. 为注入正确体积的质粒（见上文），使用两个轻砝码和两个重砝码，在 68.5 °C 温度下拉制毛细管（拉制仪规格参见材料表）。
   注意：若使用不同的拉针仪，需校准毛细管以使其释放适当体积的电穿孔混合液。
3. 手动将注射装置的注射压力设定为 200 hPa（通过调节 Pi 旋钮），维持恒定压力为 0 hPa。将注射时间设为手动模式，并通过脚踏开关控制压力。
4. 将电穿孔仪设置为“LV 模式”，参数为 54–57 V，共 5 次脉冲（每次 25 ms，间隔 1 s）。将电极连接至仪器。
5. 准备一个装有洁净鱼水的鱼缸，用于电穿孔操作后鱼从麻醉中苏醒。在整个恢复期间，保持气石与气泵连接，持续曝气，直至鱼完全清醒。
6. 取一块普通厨房海绵，在海绵上纵向切开一条切口，用于在注射和电穿孔过程中固定鱼体（参见先前发表的研究³）。
   注意：厨房海绵应定期清洗或更换，以去除可能存在的有毒化学物质。
7. 在注射与电穿孔装置旁放置少量高导电性多功能超声耦合凝胶。
   注意：这将确保足够的电导率，从而使电穿孔后的细胞在整个端脑内均匀分布。

3. 斑马鱼麻醉

1. 在麻醉之前，用蒸馏水配制含有0.2% MS222的麻醉剂储备液，并用Tris-HCl缓冲液将pH值调节至7。使用鱼用培养水将该储备液稀释10倍（即稀释至0.02% MS222）。
2. 将鱼置于上述工作液中直至其身体和鳃的运动减弱（通常数分钟），以实现麻醉。

4. 质粒溶液注射

1. 使用微量移液吸头将10 µL质粒溶液吸入已制备好的玻璃毛细管中。避免毛细管内产生气泡。
2. 在注射装置上按下菜单/更换毛细管。将针头插入并固定在针头夹持器中。
3. 在放大倍数为3.2倍或4倍的体视显微镜下，使用尖端精细的镊子仅剪断毛细管的尖端。将注射装置从更换毛细管模式切换至注射模式，然后用脚踏板施加压力，确保质粒溶液顺畅无阻地从针头流出。
4. 将鱼从饲养箱转移至含有麻醉剂溶液的容器（塑料盒）中。等待数分钟，直至鳃部运动减弱。
5. 将鱼腹面朝下放置于预先润湿的海绵中，背部朝上。所有后续注射步骤均需在体视显微镜下进行，以确保操作的准确性。
6. 使用切割刃长40 mm、厚度0.5 mm的不锈钢解剖微型刀，在端脑后部的鱼颅骨上（图1B）靠近视顶盖边界处开一个小孔。
   注意：此步骤应谨慎操作，因为开孔应非常小且浅表，仅穿透颅骨，以避免脑组织损伤。
7. 根据需要倾斜鱼体，并以适当角度调整玻璃毛细管尖端朝向颅骨，以便毛细管尖端顺利穿过小孔。
8. 小心地将毛细管尖端穿过颅骨小孔，直至到达端脑脑室（见图1B）。此过程需穿透背侧室管膜细胞层。特别注意不要插入过深，以避免接触脑组织。穿破背侧室管膜层后，应将毛细管精确保持在两个半球之间，并始终位于脑室内。
   注意：此为极为精细的步骤。使用色素突变品系（如brassy²⁴）可提高操作准确性，便于在注射过程中更清晰地观察玻璃毛细管的位置。
9. 当毛细管尖端位于脑室内时，通过脚踏板施加压力约10秒，注入质粒溶液，相当于注入约1 µL质粒溶液。
   注意：若更换拉针仪、毛细管或注射器，应重新校准系统，以确保每次均准确注入1 µL质粒溶液。可通过测量质粒液滴在矿物油（如石蜡油）中排出后的直径，并据此计算液滴体积来进行校准。注射10秒后，应有约1 µL质粒液体排入矿物油中。
10. 通过观察液体在脑室内的扩散情况，确认上一步操作成功。

5. 电穿孔

1. 将鱼从注射装置中取出，同时仍将其固定在海绵中。
2. 将电极尖端内侧浸入超声耦合剂中。
3. 在鱼端脑表面覆盖少量超声耦合剂。
4. 将鱼头置于两个电极之间，正极置于鱼头腹侧，负极置于背侧（图1C），同时仍用海绵固定鱼体。此电极布置可使电流方向符合对位于脑室下区的室管膜胶质细胞进行电穿孔的需要。
5. 轻轻而准确地将电极压紧在端脑上（图1C），用脚踏开关施加电流，并保持电极位置直至完成全部五个脉冲。

6. 鱼类恢复

1. 将鱼放回先前准备好的、持续通气的水箱中，使其恢复直至苏醒。可在头骨上涂抹利多卡因凝胶，以缓解可能产生的疼痛。

结果

所述的电穿孔方法可将质粒DNA递送至位于斑马鱼端脑浅层且紧邻背侧室管膜细胞层下方的室管膜胶质细胞（图1A）。

如果电穿孔结果为阳性，则可在其他室管膜胶质细胞（白色细胞，见图2A,B）之中观察到被标记的单个室管膜胶质细胞（红色细胞，见图2A,B）。根据电穿孔效率的不同，被标记的室管膜胶质细胞数量可能较多（图2A）或较少（图2B）。然而，本方案获得的标记细胞数量高于此前已发表的方法²⁰，这一点在图3A和视频1中清晰可见。值得注意的是，由于注射的质粒液体在两个半球之间的分布方式，标记细胞的最高密度通常...

讨论

该电穿孔方案是一种可靠的体内标记单个室管膜胶质细胞的方法。若需标记其他细胞类型（如神经元或少突胶质细胞），该方案可能需要进一步优化。为实现成功的标记，可使用含有不同启动子的质粒。既往研究中已采用鸡β-肌动蛋白启动子、eF1α、CMV以及泛素启动子来驱动室管膜胶质细胞及其子代细胞中不同转基因的表达²³。然而，不同启动子驱动的转基因表达动力学存在差异，需予以考虑。例如，CMV启动子驱动的转基因表达非常迅速（24小时后即可观察到表达），而eF1α启动子则需要更长时间。除了用于标记外，该电穿孔方案还可作为利用Cre重组酶或CRISPR Cas9技术进行基因编辑的快速且直接的平台²²。此外，在细胞类型特异性的Cre小鼠品系中，使用含有翻转盒（flip-cassette）²⁵的质粒进行电穿孔，可作为该方法的明确拓展，用于标记或编辑电穿孔后产生的室管膜胶质细胞子代中的目标基因。

本方案包含若干关键步骤。首先，在注射步骤中，实验人员需注意确保每条鱼注射的质...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/材料
快绿（Fast Green）	Sigma-Aldrich	F7258-25G	用于染色质粒溶液
MS222	Sigma-Aldrich	A5040-25G	MS222 应在室温下保存（最长两周），并避光
超声耦合剂	SignaGel, Parker Laboratories INC.	15-60	电极凝胶
设备
气泵	TetraTec APS 50, 10l-60l		可在宠物用品商店购买
BTX Tweezertrodes 电极	铂金镊形电极，BTX Harvard Apparatus	45-0486	直径 1 mm
电穿孔仪	BTX ECM830 方波电穿孔系统，BTX Harvard Apparatus	45-0662
显微注射装置	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013
标准壁硼硅酸盐玻璃毛细管	Warner Instruments	64-0766	型号：G100-4
微量加样头（Microloader tips）	Eppendorf	5242956003
微型刀具（Micro-knife）	Fine Science Tools	10056-12
操纵杆式显微操作器	Narishige Japan	MN - 151
持针器	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013	持针器随注射装置一同提供
拉针仪	Narishige Japan	型号：PC-10	PC-10 已于 2017 年被 Narishige 停产，由 PC-100 取代
培养皿	Greiner Bio-One International	633161