本文介绍了一种用于在成年斑马鱼端脑中递送质粒DNA并标记室管膜胶质细胞的电穿孔方法。该方案是一种快速高效地观察和示踪单个室管膜胶质细胞的技术，为将电穿孔技术应用于广泛的遗传操作提供了新的可能性。
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本文内容
摘要
摘要
电穿孔是一种转染方法，通过向细胞施加电场，在细胞膜上形成临时孔隙，从而增加其通透性，使不同分子得以进入细胞。本文中，采用电穿孔技术将质粒导入成年斑马鱼端脑室区壁的室管膜胶质细胞。这些细胞中的一部分具有干细胞特性，可在斑马鱼大脑中生成新的神经元；因此，研究其行为对于明确其在神经发生和再生过程中的作用至关重要。通过电穿孔导入质粒，可实现对单个室管膜胶质细胞的长期标记与追踪。此外，可将如Cre重组酶或Cas9等质粒递送至单个室管膜胶质细胞，从而实现基因重组或基因编辑，为在受控且自然的环境中评估细胞自主性基因功能提供了独特机会。最后，本详细、分步的电穿孔实验方案可用于成功将质粒导入大量单个室管膜胶质细胞中。
引言
斑马鱼是研究脑部刺伤后再生的优良动物模型。与哺乳动物相比，在进化阶梯上较为低等的物种（如斑马鱼）通常表现出更高的持续性神经发生率以及更广泛的成体神经干细胞分布区域，从而在成体生命期间持续不断地在大脑大多数区域生成新的神经元。这一特征似乎与斑马鱼显著更强的再生能力密切相关1，因为斑马鱼在已研究的大多数脑损伤模型中均展现出高效生成新神经元的卓越潜力2,3,4,5,6,7,8。本研究聚焦于斑马鱼的端脑，因其是成年期神经发生显著的脑区。这些成体神经发生区域与成年哺乳动物脑内的神经发生区具有同源性9,10,11。
由于存在类似放射状胶质细胞或室管膜胶质细胞的细胞，斑马鱼端脑中具有丰富的神经发生区....
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方案
本方案中使用的所有动物均在标准饲养条件下进行培育，实验操作均遵循欧盟以及上巴伐利亚政府的动物使用指南和规定（许可编号：AZ 55.2-1-54-2532-0916）。
1. 电穿孔用质粒混合物的制备
- 将目标质粒溶解于无菌水中，并加入快绿染料储备液［1 mg/mL］。确保质粒的终浓度为 ∼1 µ克/µL. 加入染料的浓度不超过3%，因为其唯一作用是为溶液着色，以便观察脑室注射情况。
- 配制完成后，通过反复吹打或轻弹管壁混匀质粒溶液。室温（RT）保存，待用。
注意： 对于将两种质粒共电穿孔转入同一细胞，需确保混合物中每种质粒的浓度均至少为 0.8 ng/µL，以1:1的摩尔比混合，以获得80%–90%的共电穿孔效率。
2. 注射与电穿孔实验的准备工作
- 在拉针仪中准备好用于注射的玻璃毛细管（外径 1 mm，内径 0.58 mm）。
- 为注入正确体积的质粒（见上文），使用两个轻砝码和两个重砝码，在 68.5 °C 温度下拉制毛细管（拉制仪规格参见材料表）。
注意：若使用不同的拉针仪，需校准毛细管以使其释放适当体积的电穿孔混合液。 - 手....
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结果
所述的电穿孔方法可将质粒DNA递送至位于斑马鱼端脑浅层且紧邻背侧室管膜细胞层下方的室管膜胶质细胞（图1A）。
如果电穿孔结果为阳性，则可在其他室管膜胶质细胞（白色细胞，见图2A,B）之中观察到被标记的单个室管膜胶质细胞（红色细胞，见图2A,B）。根据电穿孔效率的不同，被标记的室管膜胶质细胞数量可能较多（图2A）或较少（图2B）。然而，本方案获得的标记细胞数量高于此前已发表的方法20，这一点在图3A和视频1中清晰可见。值得注意的是，由于注射的质粒液体在两个半球之间的分布方式，标记细胞的最高密度通常.......
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讨论
该电穿孔方案是一种可靠的体内标记单个室管膜胶质细胞的方法。若需标记其他细胞类型（如神经元或少突胶质细胞），该方案可能需要进一步优化。为实现成功的标记，可使用含有不同启动子的质粒。既往研究中已采用鸡β-肌动蛋白启动子、eF1α、CMV以及泛素启动子来驱动室管膜胶质细胞及其子代细胞中不同转基因的表达23。然而，不同启动子驱动的转基因表达动力学存在差异，需予以考虑。例如，CMV启动子驱动的转基因表达非常迅速（24小时后即可观察到表达），而eF1α启动子则需要更长时间。除了用于标记外，该电穿孔方案还可作为利用Cre重组酶或CRISPR Cas9技术进行基因编辑的快速且直接的平台22。此外，在细胞类型特异性的Cre小鼠品系中，使用含有翻转盒（flip-cassette）25的质粒进行电穿孔，可作为该方法的明确拓展，用于标记或编辑电穿孔后产生的室管膜胶质细胞子代中的目标基因。
本方案包含若干关键步骤。首先，在注射步骤中，实验人员需注意确保每条鱼注射的质.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
特别感谢James Copti对本文手稿的编辑工作。我们还衷心感谢德国研究基金会（DFG）通过SFB 870项目、“嗅觉整合分析”优先计划（SPP）以及SPP 1738“非编码RNA在神经系统发育与可塑性中的新兴作用”优先计划为JN提供的经费支持。 & 疾病”、SPP1757“胶质细胞异质性”以及慕尼黑系统神经学集群卓越战略框架（EXC 2145 SyNergy – 编号 390857198）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/材料 | |||
| 快绿（Fast Green） | Sigma-Aldrich | F7258-25G | 用于染色质粒溶液 |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 应在室温下保存（最长两周），并避光 |
| 超声耦合剂 | SignaGel, Parker Laboratories INC. | 15-60 | 电极凝胶 |
| 设备 | |||
| 气泵 | TetraTec APS 50, 10l-60l | 可在宠物用品商店购买 | |
| BTX Tweezertrodes 电极 | 铂金镊形电极，BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 直径 1 mm |
| 电穿孔仪 | BTX ECM830 方波电穿孔系统，BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| 显微注射装置 | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| 标准壁硼硅酸盐玻璃毛细管 | Warner Instruments | 64-0766 | 型号：G100-4 |
| 微量加样头（Microloader tips） | Eppendorf | 5242956003 | |
| 微型刀具（Micro-knife） | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 操纵杆式显微操作器 | Narishige Japan | MN - 151 | |
| 持针器 | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | 持针器随注射装置一同提供 |
| 拉针仪 | Narishige Japan | 型号：PC-10 | PC-10 已于 2017 年被 Narishige 停产，由 PC-100 取代 |
| 培养皿 | Greiner Bio-One International | 633161 |
参考文献
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J.
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重印与许可
