移植物抗宿主病是异基因骨髓移植后的主要并发症。树突状细胞在移植物抗宿主病的发病机制中起着关键作用。本文介绍了一种新型骨髓移植平台，用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病发生以及移植物抗白血病效应中的作用。
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方法文章
用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
同种异体骨髓移植（BMT）因移植物抗白血病（GVL）效应可有效清除肿瘤，是治疗血液系统恶性肿瘤的有效疗法。然而，其临床应用受到移植物抗宿主病（GVHD）的限制，GVHD是BMT的主要并发症。当供体移植物中的T细胞识别受者细胞表达的同种异体抗原时，便会引发对受者健康组织的异常免疫攻击，从而导致GVHD的发生。因此，传统治疗方法旨在抑制供体T细胞的同种反应性。然而，这些方法会显著削弱GVL效应，因而无法改善受者的生存率。因此，深入理解各种治疗策略对BMT、GVL及GVHD的影响至关重要。由于受者树突状细胞（DCs）具有抗原呈递和分泌细胞因子以激活供体T细胞的能力，其在GVHD的诱导过程中发挥着关键作用。因此，靶向受者DCs成为控制GVHD的潜在策略。本研究介绍了一种新型BMT平台，用于探究宿主DCs如何调控移植后GVH和GVL反应；同时提供了一种有效的BMT模型，用于研究移植后GVHD与GVL的生物学机制。
引言
异基因造血干细胞移植（BMT）是治疗血液系统恶性肿瘤的有效疗法1,2 通过移植物抗白血病（GVL）效应3然而，供体淋巴细胞总会对受体组织发起不希望出现的免疫攻击，这一过程称为移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GVHD）。4.
GVHD 的小鼠模型是研究 GVHD 生物学特性及 GVL 反应的有效工具5。小鼠是一种经济高效的实验动物模型，体型小，适用于在分子和生物制剂研发早期阶段进行高效给药6。小鼠是遗传操作研究的理想实验动物，因其遗传背景明确，非常适合研究生物学通路和机制6。目前已建立多种小鼠主要组织相容性复合体（MHC）不匹配的 GVHD 模型，例如 C57BL/6 (H2b) → BALB/c (H2d) 和 FVB (H2q) → C57BL/6 (H2b)5,7。这些模型对于确定....
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方案
实验程序已获得中佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 移植物抗宿主病的诱导
注意：同种异体骨髓（BM）细胞移植（步骤 1.2）需在照射后 24 小时内进行。以下所述所有操作均须在无菌环境中进行。操作应在组织培养罩内完成，并使用过滤过的试剂。
- 第0天：准备受体小鼠。
- 使用雌性野生型（WT）BALB/c背景（CD45.2）小鼠+ H2kd+），10–12 周龄作为受体。
- 在TBI前对受体小鼠进行耳标标记并称重。然后将最多11只小鼠放入照射室，并置于辐照仪中。以700 cGy单次剂量辐照10−15分钟。
- 将照射后的动物放回笼中，并在移植前饲养于无病原体环境中。
注意：受体动物的最低体重应约为20 g。以此体重为参考，计算实验期间的体重下降情况。
- 第1天：从供体小鼠中制备T细胞耗竭的骨髓（TCD-BM）。
- 通过 CO₂ 处死 CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 小鼠2 窒息后等待2−3分钟，直至小鼠失去意识。必要时实施颈椎脱位作为二次安乐死措施。
- 将每只小鼠置于干净的操作板上，用70%异丙醇消毒毛发和皮肤。
- 使用镊子和剪刀取....
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结果
主要MHC不相容的B6（H2kb）-BALB/C（H2kd）模型与移植后移植物抗宿主病（GVHD）的发展过程高度一致（图2）。在接受野生型B6 T细胞移植的受体小鼠中， Cooke等人先前确立的全部六项GVHD临床体征均出现16，而仅接受骨髓移植的受体小鼠（步骤1.5）则未出现这些体征，后者代表GVHD阴性组。在此模型中，GVHD的发展分为两个阶段：首先，在移植后约第11天达到病情严重程度的高峰，随后临床评分下降，体重在第16天前逐渐恢复。在这一阶段，多种机制如辐射诱导的炎症反应和植入综合征推动了疾病的发生和发展。受体小鼠通常在移植后30−40天内因GVHD死亡。
至少85%的骨髓细胞分化为树突状细胞（DC）（图3A
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讨论
利用干细胞为特定个体进行治疗是治疗晚期和耐药性癌症的有效方法18。然而，小分子药物长期以来一直是个性化癌症治疗的主要关注点。另一方面，在细胞治疗中，供体与宿主之间的多种相互作用可能决定性地影响治疗效果，例如造血干细胞移植（BMT）后移植物抗宿主病（GVHD）的发生1。
主要MHC不相合的小鼠BMT模型是研究GVHD生物学机制及评估药物治疗效果的有力工具。其中，C57BL/6 (H2b)→BALB/c (H2d) 和 FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b) 是已建立成熟的模型5,7。这些模型采用清髓性放疗作为预处理方案，其中BALB/c模型使用单次剂量，而C57BL/6模型则采用分次剂量，各次间隔3–8小时，以降低肠道毒性5。两种模.......
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致谢
本研究由中佛罗里达大学医学院启动资金（资助 HN）、匹兹堡大学医学中心希尔曼癌症中心启动资金（资助 HL）、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 #1P20CA210300-01 以及越南卫生部资助项目 #4694/QD-BYT（资助 PTH）支持。我们感谢南卡罗来纳医科大学 Xue-zhong Yu 博士为本研究提供材料。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA pH 8.0 100ML | 弗舍科学 | BP2482100 | MACS 缓冲液 |
| 10X PBS | 弗舍科学 | BP3994 | MACS 缓冲液 |
| A20 B细胞淋巴瘤 | 中佛罗里达大学 | 本实验室 | GVL 实验 |
| ACC1 fl/fl | 杰克逊实验室 | 30954 | GVL 实验 |
| ACC1 fl/fl CD4cre | 中佛罗里达大学 | GVL 实验 | |
| 抗生物素微珠 | 美天旎生物技术 | 130-090-485 | T细胞富集 |
| 抗人/小鼠 CD45R (B220) | 赛默飞世尔科技 | 13-0452-85 | T细胞富集 |
| 抗小鼠 B220 FITC | 赛默飞世尔科技 | 10452-85 | 流式细胞术分析 |
| 抗小鼠 CD11c- AF700 | 赛默飞世尔科技 | 117319 | 流式细胞术分析 |
| 抗小鼠 CD25 PE | 赛默飞世尔科技 | 12-0251-82 | 流式染色 |
| 抗小鼠 CD4 生物素 | 赛默飞世尔科技 | 13-0041-86 | T细胞富集 |
| 抗小鼠 CD4 eFluor® 450（太平洋蓝® 替代品） | 赛默飞世尔科技 | 48-0042-82 | 流式染色 |
| 抗小鼠 CD45.1 PE | 赛默飞世尔科技 | 12-0900-83 | 流式细胞术分析 |
| 抗小鼠 CD8a APC | 赛默飞世尔科技 | 17-0081-83 | 流式细胞术分析 |
| 抗小鼠 H-2Kb PerCP-Fluor 710 | 赛默飞世尔科技 | 46-5958-82 | 流式细胞术分析 |
| 抗小鼠 MHC II类抗体 APC | 赛默飞世尔科技 | 17-5320-82 | 流式细胞术分析 |
| 抗小鼠 TER-119 生物素 | 赛默飞世尔科技 | 13-5921-85 | T细胞富集 |
| 抗Thy1.2 | 生物优博 | BE0066 | 骨髓细胞生成 |
| B6 fB-/- 小鼠 | 中佛罗里达大学 | 本实验室 | 受体 |
| B6.Ly5.1 (CD45.1+) 小鼠 | 查尔斯河实验室 | 564 | 供体 |
| BALB/c 小鼠 | 查尔斯河实验室 | 028 | 移植受体 |
| C57BL/6 小鼠 | 查尔斯河实验室 | 027 | 供体/受体 |
| CD11b | 赛默飞世尔科技 | 13-0112-85 | T细胞富集 |
| CD25-生物素 | 赛默飞世尔科技 | 13-0251-82 | T细胞富集 |
| CD45R | 赛默飞世尔科技 | 13-0452-82 | T细胞富集 |
| CD49b 单克隆抗体 (DX5)-生物素 | 赛默飞世尔科技 | 13-5971-82 | T细胞富集 |
| 40 µm 细胞筛 | 赛默飞世尔科技 | 22363547 | 细胞制备 |
| 70 µm 细胞筛 | 赛默飞世尔科技 | 22363548 | 细胞制备 |
| D-荧光素 | Goldbio | LUCK-1G | 活体动物成像 |
| 胎牛血清 (FBS) | 亚特兰大生物 R&D 系统 | D17051 | 细胞培养 |
| 流式细胞术管 | 弗舍科学 | 352008 | 流式细胞术分析 |
| FVB/NCrl | 查尔斯河实验室 | 207 | 供体 |
| 脂多糖 (LPS) | 密理博西格玛 | L4391-1MG | 树突状细胞成熟 |
| LS 柱 | 美天旎生物技术 | 130-042-401 | 细胞制备 |
| MidiMACS | 美天旎生物技术 | 130-042-302 | T细胞富集 |
| New Brunswick Galaxy 170R 培养箱 | 艾本德 | Galaxy 170 R | 细胞培养 |
| 青霉素+链霉素（10,000 单位青霉素 / 10,000 mg/ml 链霉素） | GIBCO | 15140 | 培养基 |
| RPMI 1640 | 赛默飞世尔科技 | 11875-093 | 培养基 |
| TER119 | 赛默飞世尔科技 | 13-5921-82 | T细胞富集 |
| Xenogen IVIS-200 | 珀金埃尔默 | Xenogen IVIS-200 | 活体动物成像 |
| X-RAD 320 生物辐照仪 | 精准X射线 | X-RAD 320 | 全身照射 |
参考文献
- Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
- Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
- Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M.
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重印与许可
