骨髓移植平台研究树突状细胞在移植与宿主疾病中的作用

异体造血干细胞移植（BMT）是治疗血液恶性肿瘤^{的有效疗法1、22}通过移植对白血病（GVL）效应^3。然而，供体淋巴细胞总是对受体组织进行不需要的免疫攻击，这个过程称为移植与宿主疾病（GVHD）4。⁴

GVHD的毛利模型是研究GVHD生物学和GVL反应⁵的有效工具。老鼠是一种具有成本效益的研究动物模型。它们很小，在发育的早期阶段就有效地与分子和生物制剂结合^。老鼠是基因操作研究的理想研究动物，因为它们在基因上定义得很好，非常适合研究生物途径和机制^。几种小鼠主要组织相容性复合（MHC）MHC不匹配的GVHD模型已经建立，如C57BL/6（H2^b）到BALB/c（H2^d）和FVB（H2q）_C57BL/6（H2^{qbb）5，7。,7}这些是确定单个细胞类型、基因和影响GVHD的因素的作用的特别重要的模型。从C57/BL/6（H2^b）父母捐赠者移植到MHC I（B6.C-H2^bm1）和/或MHC II（B6.C-H2b^m12）突变的接受者，表明MHC I类和II类的不匹配是急性GVHD发展的重要要求。这表明^CD4+和^CD8+T细胞都是疾病发展^{所需的7，8。8}GVHD还参与了被称为"亲炎细胞因子风暴"的炎症级联^。在鼠模型中最常见的调理方法是 X 射线或¹³⁷C 的总身体辐照 （TBI）。这导致接受者的骨髓消融，从而允许供体干细胞移植，并防止移植的排斥。这是通过限制受体T细胞的增殖来响应供体细胞来实现的。此外，遗传差异在疾病诱导中起着重要作用，这也取决于轻微的MHC不匹配^10。因此，骨髓照射剂量在不同的小鼠菌株中有所不同（例如，BALB/c=C57BL/6）。

宿主抗原呈现细胞（APC）激活供体T细胞对GVHD发育至关重要。在APC中，树突状细胞（DC）是最有效的。它们具有遗传性诱导GVHD的能力，因为它们具有优越的抗原摄入、T细胞共刺激分子的表达以及产生使T细胞极化成致病子集的亲炎细胞因子。接受性D对^{促进移植后,}T细胞充注和GVHD诱导^{至关重要。}因此，在治疗GVHD¹²时，DC已成为有趣的目标。

需要TBI来增强供体细胞的移植。由于TBI效应，接受者DC在移植¹²后被激活并存活一小段时间。尽管在使用生物发光或荧光方面取得了重大进步，但建立一个有效的模型来研究受体D在GVHD中的作用仍然具有挑战性。

由于供体T细胞是GVL活动的驱动力，使用免疫抑制药物如类固醇抑制T细胞过敏反应的治疗策略往往导致肿瘤复发或感染^13。因此，针对受体 DC 可以提供治疗 GVHD 的替代方法，同时保持 GVL 效果并避免感染。

简而言之，目前的研究提供了一个平台，以了解接收D中不同类型的信令如何调节GVHD的发展和BMT后GVL效应。

实验程序得到了中佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. GVHD 感应

注:异体骨髓（BM）细胞移植（步骤1.2）在辐照后24小时内进行。下面描述的所有程序都在无菌环境中执行。在组织培养罩中执行该过程，并使用过滤试剂。

1. 第 0 天:准备接收鼠标。
   1. 在 BALB/c 背景 （CD45.2⁺ H2k^d+）上使用雌性野生类型 （WT） 小鼠，10~12 周大作为接受者。
   2. 在 TBI 之前标记和称重收件人。然后，将多达11只小鼠放入辐照室，并将其保存在辐照器中。在 700 cGy 的单剂量下照射 10~15 分钟。
   3. 在移植前，将辐照动物送回笼子，并把它们安置在无病原体的设施中。
      注:受试者的最小体重应在20克左右。用这个重量作为计算实验期间体重损失的参考。
2. 第1天:从供体小鼠中制备T细胞耗尽的骨髓（TCD-BM）。
   1. 通过 CO₂窒息对 CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 小鼠进行安乐死，等待 2-3 分钟，直到它们失去知觉。如有必要，将宫颈脱位作为继发性安乐死。
   2. 将鼠标放在干净的工作板上。用70%异丙醇对毛皮和皮肤进行消毒。
   3. 用钳子和剪刀从双腿收集头骨和股骨。将它们放入冰冷RPMI中，含有1%FCS和100 U/mL青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺（1%RPMI），在50 mL锥形管中。使用钳子和剪刀去除所有肌肉组织，彻底清洁股骨和头骨。将股骨和头骨从50mL锥形管转移到直径为92毫米的培养皿中，含有1%的RPMI。
   4. 使用剪刀，切割股骨或头骨的末端。用 25 mL 1% RPMI 1640 中等填充 50 mL 管。使用此功能将 3 mL 注射器填充到 26 G 针上，3 mL 的 1% RPMI。将此注射器插入骨骼，然后推柱塞将骨髓 （BM） 从腔中取出，以 1% RPMI （±3 mL/骨）冲洗出腔内。
   5. 对于来自其他供体小鼠的所有剩余头骨和股骨，重复步骤 1.2.4。将所有收集管放在冰上。
   6. 通过 75 μm 网状细胞滤网冲洗骨髓片，使单个细胞悬浮。在 50 mL 管中收集单细胞悬架。
   7. 在 800 x g下，在 4 °C 下，离心管 5 分钟。吸气并丢弃上清液。在20 x 10⁶细胞/mL下，在含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液中重新悬浮颗粒。保存 2 x 10⁶个细胞的等号，以便进行纯度染色。
   8. 在0.05 μg/10⁶细胞¹⁴处加入Thy 1抗体，在4°C下孵育30分钟。用25 mL冷PBS洗涤一次。在 0.5% BSA/10% 幼兔补/2% DNase（无菌 H₂O 中 10，000 U/mL）重新悬浮。⁶在37°C下孵育45分钟，洗涤2倍。
      注:T细胞使用针对Thy1的mAb耗尽，这是一种由所有T细胞表达的蛋白质，而不是其他白细胞。
   9. 在含有0.5%BSA的PBS缓冲液的20 mL中重新悬浮细胞。使用血细胞计将骨髓细胞以1%的醋酸计数。保持 2 x 10⁶细胞的等位，在细胞纯化后通过流细胞测定进行纯度检查。
      注:一只供体小鼠通常产生约25 x 10⁶ TCD-BM。
   10. 使用流细胞测定仪确认成功的T细胞耗尽。染色 1 x 10⁶细胞，从步骤 1.2.7（T 细胞耗尽之前）和 1.2.9（T 细胞耗尽后的 TCD-BM）保留，具有以下抗体:β-CD3 （17A2）、β-CD4 （GK1.5） 和 β-CD8+（53-6.7）。
3. 第1天:从供体小鼠中制备T细胞
   1. 使用 CD45.2⁺ H2k^b+ C57BL/6 野生类型 （WT） 小鼠作为 T 细胞的捐赠者。
   2. 按二氧化碳_（CO2）窒息对C57BL/6小鼠进行安乐死，如1.2.1所述。
   3. 用70%乙醇彻底清洁小鼠的毛皮和皮肤。使用注射器柱塞和40μm网状滤网器，切除脾脏和淋巴结，并将其分离成单细胞悬浮物的单细胞悬浮液。用 1% RPMI（1% FBS 包含 RPMI 介质）清洗滤网和注射器柱塞，以收集所有减员。
   4. 在 4 °C 下将电池悬浮液在 800 x g下离心 5 分钟。丢弃上清液后加入 5 mL 的 ACK 压合缓冲液（1 mM Na₂EDTA，10 mM KHCO₃、144 mM NH₄Cl、pH 7.2）。在室温下孵育细胞悬浮液5分钟。
      注:ACK 压网液用于压网红血球。
   5. 添加 5 mL 的 1% RPMI 以阻止套回。在 800 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下。丢弃上清剂。
   6. 制备冰冷的磁活细胞分拣（MACS）缓冲液（0.5%BSA，PBS中的2 mM EDTA，pH 7.2）。使用前对缓冲液进行气。在 MACS 缓冲液的 5 mL 中重新悬浮细胞颗粒。
   7. 使用血细胞计和 1% 锥形蓝色，对全细胞进行计数并检查活细胞和死细胞。保存 2 x 10⁶个细胞的等位，通过流细胞测定分析评估纯化产量。
   8. 在 MACS 缓冲液中浓度为 200 x 10⁶/mL 时重新悬浮脂质细胞。加入0.03μL的生物素抗鼠-Ter-119，0.03μL的生物素抗小鼠CD11b，0.03μL的生物素抗小鼠CD45R，和0.03μL的生物素抗鼠-DX5每10⁶细胞。在4°C下孵育15分钟。
      注:生物素抗小鼠-Ter-119、生物素抗小鼠-CD11b、生物素抗小鼠-CD45R和生物素抗小鼠DX5分别用于与红细胞、颗粒细胞、B细胞和NK细胞发生反应。因此，这些细胞子集在步骤¹⁵中耗尽。
   9. 将 10 mL 的冷式 MACS 缓冲液添加到电池悬浮液中。在 800 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下。丢弃上清剂。
   10. 以 100 x 10⁶/mL 的浓度重新悬浮 MACS 缓冲液中的细胞颗粒。在增生细胞悬浮液中加入抗生物青星（0.22 μL/10⁶细胞）。混合好，在4°C下孵育15分钟。使用 10 mL 的冷式 MACS 缓冲液清洗电池悬浮液一次。在 800 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下丢弃上清液。
   11. 在磁场中放置一个磁分离柱。用 3 mL 的 MACS 缓冲液冲洗列。将细胞悬架拖放到列上。在一个新的15 mL锥形管中收集由未绑定、浓缩T细胞组成的流通。使用 3 mL 的冷式 MACS 缓冲液清洗 MS 柱。
       注: 在执行洗涤步骤之前，请确保列为空。
   12. 在 4 °C 下将电池悬浮液在 800 x g下离心 5 分钟。将细胞颗粒重新悬浮在 5 mL 的 MACS 缓冲液中。
   13. 使用血细胞计以 1% 锥蓝色计数细胞。保存 2 x 10⁶个细胞的等位，以便通过流式细胞测定进行纯度检查。
       注:此方法分离的全性 T 细胞的平均产量为每只小鼠 +20×25 x 10⁶细胞。
   14. 通过流细胞测定确认T细胞富集的收率。染色 1 x 10⁶细胞，从步骤 1.3.7（T 细胞耗尽之前）和 1.3.13（T 细胞耗尽后的 TCD-BM）保存，具有以下抗体:β-CD3 （17A2）、β-CD4 （GK1.5） 和 β-CD8+（53-6.7）。
4. 第1天:用供体T细胞和TCD-BM注射辐照小鼠。
   1. 用 PBS 清洗 TCD-BM 和 T 电池 2 倍（在 4 °C 下为 800 x g 5 分钟）。重新悬浮冰冷PBS中的细胞进行注射。将 TCD BM 的细胞浓度调整为 20 x 10⁶/mL，将 T 细胞的电池浓度调整为 4 x 10⁶/mL。
   2. 使用加热灯加热动物，以提高双尾静脉的可见度。如有必要，将鼠标放在约束器中。
   3. 使用 70% 异丙醇清洁尾部表面。使用或不使用 T 细胞（0.75 x 10⁶个单元/鼠标）注射 TCD-BM（5 x 10⁶个单元/鼠标）。小心不要将任何空气引入注射器。
   4. 取出针头，将防腐拭子直接涂抹到注射部位 5~10 s 以停止任何出血。
5. 在 2-80 天评估 GVHD。
   1. 跟踪动物的生存情况。监测GVHD的临床体征，适应库克等人¹⁶先前建立的评分系统，以及受体小鼠每周2倍的体重。使用 TBI 之前确定的体重来计算体重损失。
   2. 单独称重每只鼠标。对减肥评分如下:0级=小于10%;等级 1 = 10%~20%;等级 2 = 超过 20%。
   3. 评分收件人的姿势标志:0 级 = 无预感;0.5级 = 轻微的驼背，但行走时拉直;1年级 = 动物行走时保持驼背;等级1.5 = 动物不矫正;等级 2.0 = 动物站在后脚趾上。
   4. 对收件人的移动性标志进行评分:0 级 = 非常活跃;0.5级 = 比幼鼠慢;等级 1.0 = 仅在戳上时移动;等级 1.5 = 戳时稍微移动;等级 2.0 = 戳时不移动。
   5. 评分接受者的皮肤:0级 = 无擦伤、病变或缩放;0.5级 = 一个特定区域的发红;1级 = 一个区域的磨损或两个区域的轻度磨损;1.5级 = 两个或两个以上地区的严重擦伤;等级 2.0 = 严重擦伤、皮肤开裂、血液干燥。
   6. 对获奖者的毛皮打分:0级 =无异常迹象;0.5级 = 在颈部腹部或尿布的侧面，1.0 级 = 穿过或穿过腹部和颈部的侧;1.5级 = 松哑的磨砂和褶皱毛皮;等级 2.0 = 腹部和背部的毛皮严重磨砂。
   7. 评分的接受者腹泻:0级 = 无腹泻;0.5级 = 轻微和柔软的凳子;1.0级 = 轻度（黄色凳子）;1.5年级 = 中等（黄色大便，有一点血）;等级 2 = 严重（浅黄色和血腥的凳子，"干蛋糕凳子"出现在肛门区域）。

2. 共移植模型

1. 生成骨髓衍生的树突状细胞（BM-DC）。
   1. 将骨髓从WT或因子B（fB）的股骨和骨子偏^）中分离出，如步骤1.2.3_1.2.4所述。以 800 x g旋转细胞 5 分钟。
   2. 在5 mL的ACK压水液缓冲液中重新悬浮颗粒，用于红血球压网。在冰上孵育细胞悬浮液5分钟。在电池悬浮液中加入 10 mL 的 1% RPMI，在 4 °C 下以 800 x g停止套系统并离心 5 分钟。丢弃上清剂。
   3. 在10 mL培养介质中重新悬浮细胞颗粒（RPMI 1460含有10%FBS、100 U/mL青霉素/链霉素、2 mM l-谷氨酰胺和50 mMβ-汞氨基乙醇），并调整体积以满足2 x 10⁶细胞/mL的最终浓度。
   4. 在细胞悬浮液中加入20纳克/mL粒细胞-巨噬细胞-刺激因子（GM-CSF）。在37°C下在5%CO₂中培养骨髓细胞在100 x 15 mm培养皿中6天。
   5. 在第 3 天用含有 40 ng/mL GM-CSF 的新鲜介质替换一半的当前文化介质（约 5 mL）。
   6. 在 37 °C 的水浴中预热培养介质。从骨髓培养皿中收集大约5 mL的介质。在 800 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下。丢弃上清剂。在含有40纳克/mL GM-CSF的5 mL培养介质中重新悬浮细胞颗粒。
   7. 在培养物的第6天，将25μg/mL脂多糖（LPS）添加到介质中，使BM-DC成熟。保存2×10⁶个细胞的分配额，通过流细胞测定确定直流分化效果。
   8. 收集成熟的 BM-DC:使用细胞升降机从培养皿中轻柔地刮取 DC。收集 50 mL 锥形管中的所有细胞悬浮液。在 800 x g下离心，在 4 °C 下 5 分钟。丢弃上清剂。用 50 mL 的冷 PBS 清洗 3 倍的细胞颗粒。节省约 2 x 10^{6 BM-DC，}通过流细胞测定进行免疫表型分析。
2. 执行BMT（DC-协移植BMT）的树突细胞共移植。
   注:使用FVB（H2k^q）小鼠作为T细胞和BM细胞的捐赠者。以1，100 cGy（2剂，3小时间隔）的剂量照射B6 Ly5.1受体小鼠。请参阅步骤 1.1 中的详细信息。
   1. 将BM与FVB供体小鼠的股骨和铁骨分离。请参阅步骤 1.2.3_1.2.10 的详细信息。
      注:在此模型中使用完全分离的骨髓而不是 TCD-BM。
   2. 从FVB供体小鼠的脾脏和淋巴结中净化T细胞。请参阅步骤 1.3.1-1.3.13 的详细信息。
   3. 在实验课程的第 0 天用 BM-DC（2 x 10⁶/鼠标）注射 BM（5 x 10⁶/鼠标）、T 细胞（0.5 x 10⁶/鼠标）。
   4. 在移植后的第3天，通过流动细胞测定检查供体DC重组。
      1. 从接受者的眼睛里收集血液。
      2. 用3%的西露酶吸入麻醉CD45.1/Ly5.1 B6小鼠。检查因对脚趾捏缺乏反应而麻醉的深度。
      3. 将无菌玻璃移液管放在眼睛的中段，以从鼻子平面的 30×45° 角度定向。轻轻旋转管时施加压力。
      4. 将血液放入含有10μL肝素的无菌1.5mL微离心管中。将50μL的血液输送到5 mL玻璃流管中。
      5. 添加 2 mL 的 ACK 帧缓冲液。在水浴中孵育37°C45分钟。加入2 mL的FACS染色缓冲液。在 800 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下。丢弃上清剂。
      6. 用含有适当流动染色抗体（活/死亡黄色、β-H-2K b、β-CD45.1、β-CD45.2、β-CD11c和β-MHCII）的200μL的FACS缓冲液重新悬浮细胞颗粒。^b在黑暗中4°C孵育15分钟。使用 1 mL FACS 缓冲液洗涤 2 倍。在FACS缓冲液的200μL中重新悬浮细胞颗粒，并通过流细胞测定进行分析。

3. BMT 的 GVHD/GVL 型号

1. 执行 GVHD/GVL 感应。
   1. 在RPMI培养介质中培养透明酶转导A20 B细胞淋巴瘤。
   2. 在 700 cGy（单剂量）下照射 BALB/c 背景 WT 或 Ly5.1 受体。请参阅步骤 1.1 中的详细信息。
   3. 将 TCD-BM 与 B6 的股骨和肋骨分离。莱5.1供体小鼠。请参阅步骤 1.2.1_1.2.10 的详细信息。
   4. 从C57BL/6供体小鼠的脾脏和淋巴结中纯化T细胞。请参阅步骤 1.3.1_1.3.15 的详细信息。
   5. 用 25 mL 的 PBS 清洗 A20 淋巴瘤 2 倍。在10mL的冰冷PBS中重新悬浮细胞颗粒。取细胞悬浮脂肪（10 μL），并使用1%的锥蓝色和血细胞计对细胞进行计数。将细胞浓度调整到 20，000 细胞/mL。
   6. 注射TCD-BM（5 x 10⁶/鼠标），带或不带T细胞（0.75 x 10⁶/鼠标）和A20淋巴瘤（5，000个细胞/鼠标）。
   7. 在实验过程中跟踪接受者生存、GVHD临床体征和体重损失。请参阅步骤 1.5 中的详细信息。
2. 进行生物发光成像。
   1. 通过向受体小鼠注射4毫克D-Luciferin来监测移植受体的肿瘤生长。孵育5分钟，以确保透明明与透明酶发生反应。
   2. 在生物发光成像仪的腔室中使用3%的isoflurane对小鼠进行麻醉，并在D场对受体进行5分钟的成像，曝光时间为1分钟。
   3. 使用图像分析软件分析数据。更改伪彩色图像的比例以获得最佳效果。
      注:所有图片必须在实验中处于相同的比例。
   4. 使用图像分析软件通过计算从每个感兴趣区域发射的通量（光子/s）来确定感兴趣的区域并量化信号密度。

主要的MHC不匹配的B6（H2k b）-BALB/C（H2kd）模型与移植后GVHD的发展密切相关（图2）。b库克等人16日建立的所有6个GVHD临床体征均发生在使用WT-B6 T细胞移植的接受者中，但不包括单独移植BM的接受者（步骤1.5），后者代表GVHD阴性组。此模型中 GVHD 开发有两个阶段。首先，严重程度的峰值在移植后大约11天，随后临床评分下降，体重恢复长达16天。在这个阶段，一些机制，如辐照引起的炎症和移植综合征驱动疾病致病性和GVHD。接受者在移植后约30-40天内均匀地屈服于GVHD。

至少85%的BM分化成DC（图3A）。有趣的是，用fB-/--D进行移植提高了接受者的存活率和GVHD临床评分（图3B，C）。鉴于fB-/-DCs的抗原呈现能力较低，MHCII表达较低，共刺激受体表达17减少，共同移植协议可能足以检查BMT后GVHD开发中接收D中的各种信号或靶点。

浓缩后T细胞纯度为90%（图4A）。路西线酶转导的A20 B细胞淋巴瘤允许监测活体动物的肿瘤生长（图4B）。在这个模型中，如果接受者死亡没有任何信号和高GVHD临床评分，则得出结论，他们死于GVHD。所有仅接受BM加A20的WT BALB/c接受者都死于肿瘤复发（图3B）。相比之下，如果动物死于更高的信号密度，则断定它们死于肿瘤复发。如图3 Figure 3B所示，从ACC1fl/fl B6供体（ACC1+/+T细胞fl/fl）移植的BM和T细胞的WT+/+ BALB/c受体死于GVHD。如果动物死于疾病信号，则断定它们死于GVHD和肿瘤复发。接受ACC1fl/fl x CD4克里B6供体（ACC1-/---T-/-细胞）BM和T细胞的动物死于GVHD和肿瘤复发（图3B）。动物可以放回笼子里，在以后的时间点进行成像，或安乐死，以便进行前活体成像。使用该软件，动物中的肿瘤质量也可以单独分析（图3B）。

图 1:BMT 过程的原理图表示形式。（A） MHC 不匹配的 B6_BALB/c BMT 模型的方案。（B） 直流共移植FVB+B6模型方案。（C） B6_BALB/c GVHD/GVL 型号的方案。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 2:主要 MHC 不匹配的 B6_BALB/c GVHD 型号。BALB/c小鼠单独用5 x 106 BM或0.75 x 106 T细胞进行致命辐照和移植。（A） 生存数据， （B） 体重减轻， 和 （C） 临床评分数据 BM 的接受者单独或与 T 细胞.请点击此处查看此图形的较大版本。

图3:直流共移植HCT模型。BM从WT和fB-/-----B6小鼠中分离出来，并通过与GM-CSF进行培养，分化成DC。（A） 通过流细胞测定，用CD11c和MHCII染色，检查DC的纯度。致命的辐照B6受体移植与BM（3 x 106/鼠标）加上纯化T细胞（1 x 106/小鼠）从FVB捐赠者。接受者在移植当天还接受了2 x 106 WT或fB-/-----B6 BM-DC细胞。显示了存活率 （B） 和临床评分 （C） .请点击此处查看此图形的较大版本。

图 4:主要 MHC 不匹配的 B6_BALB/c GVHD/GVL 型号。WT BALB/c受体单独移植TCD-BM（5 x 106/小鼠），或与ACC1+/+T细胞或ACC1+/+T细胞（1 x 106/小鼠）从B6背景供体小鼠分离。此外，接受者在移植时接受了2 x 103 A20-luc。T细胞纯度通过流细胞测定通过活/死黄色、CD3、CD4和CD8流动抗体（A）染色进行检测。接受者被监测肿瘤生长由全身生物发光成像（BLI）（B）确定。请点击此处查看此图形的较大版本。

提交人没有利益冲突。