微孔板辅助移液发光装置（M.A.P.L.E.）是一种由计算机驱动的设备，可系统地照亮微孔板中的孔位，为微孔板的手动制备提供操作指引。 M.A.P.L.E. 在提高微孔板制备准确性的同时，实现了数据记录的自动化。 此外，该装置还可协助检查微孔板质量，或辅助识别操作错误。
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摘要
摘要
微孔板在现代实验室环境中被广泛用于多种任务，既适用于小规模的实验台操作，也适用于大规模的高通量筛选（HTS）项目。尽管实验室自动化显著提升了微孔板的使用效率，但在某些情况下，基于自动化的仪器设备并不可行、不具备成本效益，或与微孔板的格式需求不兼容。在这些情况下，微孔板必须通过手动方式进行制备。手动操作微孔板存在的问题是，可能在样本操作的准确追踪、数据记录以及对孔位异常或格式错误的质量控制（QC）检查等方面出现多种困难。随着微孔板孔密度的增加（例如96孔、384孔、1536孔），引入错误的可能性也急剧上升。 此外，对于小型实验台规模的实验室操作，亟需以具有成本效益的方式提高样本处理的便捷性和准确性。本文介绍了一种作为半自动化移液辅助指南的系统，称为微孔板辅助移液发光装置（Microplate Assistive Pipetting Light Emitter，M.A.P.L.E.）。 M.A.P.L.E. 具有多项用途，可用于支持高通量筛选或实验室实验台操作中的化合物命中挑选和微孔板制备，也可用于微孔板质量的QC/质量保证（QA）诊断评估或可视化孔位格式错误。
引言
正如近期发表的研究1所述，斯克里普斯研究所（Scripps Research）2的先导化合物筛选实验室开发并发布了一款用于微孔板制备的开源照明装置，称为微孔板辅助移液发光器（Microplate Assistive Pipetting Light Emitter, M.A.P.L.E.）。无论是用于化合物管理还是生物检测，微孔板的手动制备过程都容易出现人为错误，且随着微孔板孔密度的增加，错误率显著上升。此外，对微孔板内容/格式的正确记录和数据日志管理也容易出现人工录入错误。在高通量筛选（HTS）自动化设施中，这些问题通过使用计算机驱动的机器人工作站得以缓解，这些工作站与自动数据库记录系统集成，最大限度地减少了人工操作，降低了格式设置和数据记录错误的风险。然而，在许多情况下，基于自动化的仪器设备并不具备可行性或无法兼容特定的微孔板格式需求，因而仍需依赖人工干预。此外，还存在对小型实验室操作的支持需求，这些实验室需要紧凑且成本效益高的半自动化设备，以提高其通量、准确性，并实现微孔板制备过程中的数据记录自动化。
尽管目前已存在其他微孔板照明系统，但这些系统均为专有的商业解决方案3,4,5,6,7，仅限于特定的微孔板格式，且由于其专有闭源的性质，用户无法对其进行自主修改，从而难以将这些设备适配于特殊实验操作。 M.A.P.L.E. 被设计为一种低成本的开源设备，其源代码及所有设计文件均可免费在线获取8。掌握表面贴装焊接技术的用户可利用 GitHub 上提供的代码和设计文件自行组装 M.A.P.L.E. 设备，也可根据自身需求修改所提供的印刷电路板（PCB）设计、3D 打印外壳的计算机辅助设计（CAD）模型以及程序代码。制造导光板 PCB 所需的完整元器件清单见补充表 1和2，关于光源面板设计与实现的更多技术细节可参见近期发布的文档资料1。希望购买基于开源文件预制的导光板 PCB 的用户，可在网络上找到相关产品信息9。
M.A.P.L.E. 为用户提供了一个易于控制的照明面板，该面板具有基于微孔板的尺寸规格，且发光二极管（LED）之间的间距符合生物分子筛选学会（Society for Biomolecular Screening, SBS）对微孔板的标准要求10。M.A.P.L.E. 的设计支持 96 孔和 384 孔密度的微孔板，允许用户以任意所需的配置、颜色和强度对孔位进行照明。这些照明面板可用于在移液操作过程中照亮微孔板11，或用于模拟实验室中的格式化操作或仪器（如微孔板读数仪）12,13，以满足教学和演示需求。该项目的开源特性使用户能够轻松修改面板、固件或图形用户界面（GUI）软件，以支持任何新的所需功能。引导过程和数据记录由计算机驱动，可与电子表格集成，或导入数据库系统。由于 M.A.P.L.E. 设计为使用纯文本逗号分隔文件，因此任何能够导入或导出 CSV 格式文件的电子表格或数据库软件均可轻松扩展以与 M.A.P.L.E. 配合使用。此外，该系统所设计的外壳可在移液操作期间将微孔板向用户倾斜，从而在实验台操作时提供更自然的姿势，提升人体工学性能。M.A.P.L.E. 系统的具体操作功能包括：（i）通过照亮微孔板上的单一来源孔和目标孔，辅助手动移液操作，支持定制化孔板的化合物管理；该过程可通过计算机脚本辅助完成，并在操作结束后保存为电子记录。（ii）M.A.P.L.E. 可在微孔板的任意行或列中照亮任意数量的孔，非常适合快速连续稀释操作或特定重复对照的放置。（iii）M.A.P.L.E. 可以演示模式运行，以满足实验室培训需求，或突出显示样品与对照布置、专用孔使用（例如边缘效应屏障间隙）等方面的格式要求。（iv）M.A.P.L.E. 可对透明/半透明孔进行背光照明，便于观察沉淀/结晶、气泡、孔内不均一性、空孔等现象；同时也便于最终用户轻松拍摄孔板图像以满足记录和归档需求。
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方案
半自动 "板对板" 样本转移准备
- 生成一个如所示的 CSV 文件 图1 包含源板和目的板的电子表格文件，需使用电子表格编辑应用程序进行编辑。生成的 CSV 文件必须按以下顺序包含表头列：Source_barcode；Destination_barcode；Source_well；Dest_well；Transfer_volume。
- 在标题列下方，确保在 CSV 文件中为每个所需的移液操作（即样本转移）包含一行，内容如下：
- 源微孔板条形码：源微孔板的字母数字条形码，例如 S1007372；若无相关条形码，则留空。
- 目标板条码：目标微孔板的字母数字条码，例如 D0573282；若无相关条码则留空。
- 源孔：从源板中移液的孔的字母数字行列标识，例如 H10 表示第 H 行（8）th 行）、第10列（ANSI/SLAS标准孔位编号，例如A1、C10…）。
- Dest_well：目标板中待移液孔的字母数字行列标识符，例如 A3 表示 A 行（1st 行）、第3列（ANSI/SLAS标准孔位编号，例如A1、C10…）。
- 转移体积：从源条码的源孔转移到目标条码的目标孔的体积（数值且无单位：通常以 µL 为单位）。
- 打开微孔板辅助移液照明发射器 板对板 GUI 应用程序，如图所示 图2，通过打开 Light Guide 程序（Maple-LightGuide.exe）实现。
- 点击 选择挑取文件 GUI 左上角的按钮。
- 使用文件浏览器窗口，如图所示 图3，导航至上述步骤 1.1 和 1.2 生成的 CSV 文件，然后点击 开放 按钮。应用程序将解析 CSV 文件的第一行，并高亮显示源板和目标板中的相应孔位。
- 使用 上一步 良好 和 下一个孔 按钮，位于 GUI 右上角，如图所示 图4，以按需遍历 CSV 文件。图形用户界面将以灰色高亮显示先前已点亮的行，并以棕色高亮显示当前活动的行。
- 根据需要进行移液操作，将样本从源板的源孔转移至目标板的目标孔。一个未使用M.A.P.L.E.辅助的手动移液操作示例如下所示： 图5，与当前用户移液操作视野的对比见于 图4 和 图6除了用户图形界面外，还可通过连接在照明面板上的液晶显示屏验证板条码。
- 继续操作，直至到达 CSV 文件末尾 下一步 良好 按钮。要加载新的 CSV 文件，可 选择挑取文件 可随时点击。要退出程序，请点击红色 X 可点击图形用户界面右上角的按钮。
2. 用于平行转移和连续稀释的多孔光照
- 通过打开序列稀释程序（Maple-SerialDilution.exe），启动微量滴定板辅助移液光源的“序列稀释”应用。
- 使用 图7 和 图8 所示的图形用户界面（GUI）指定所需的滴定模式（列向或行向）、板密度以及起始行或起始列。该界面还允许用户设置列或行的掩码，以控制特定行或列中哪些LED被点亮，从而实现仅点亮某一行或列中的部分LED，而非整行或整列全部点亮。
- 使用 下一步 和 上一步 按钮，按顺序从初始起始行或列逐步操作至微孔板的最后一个行或列。每次点击 下一步 或 上一步 按钮时，光源面板将点亮对应微孔板位置的LED。
- 持续操作直至完成整个滴定序列。如需退出程序，请点击图形用户界面右上角的红色 X 按钮。
3. 实验室培训：检测方法开发与筛选技术
- 将一个96孔或384孔微孔板放入便携式导光装置中。该便携式导光装置内置电池及所有必要的电子元件，可独立于计算机使用。这使得便携式导光装置能够以手持模式操作，并可通过内置的按钮在不同演示模式之间切换。
- 使用便携式导光装置外壳上的电源开关打开系统电源。
- 确定便携式导光装置所需运行的模式。默认情况下，装置将进入HTS demo模式，该模式为用户提供一个典型的检测板视觉示意图，如图9所示。在此模式下，用户可使用导光装置顶部右侧的按钮依次切换以下样品照明模式：
- 所有孔以红色照明，模拟检测中试剂的加入过程，例如（含悬浮细胞的培养基）。
- 所有孔以黄色照明，模拟染料试剂的添加。
- 第一列和最后一列孔以绿色照明，中间“样品区域”的各列以蓝色照明，表示微孔板正在微孔板读数仪上读取。样品区域中的随机孔还将显示不同强度的绿色，以代表阳性信号（hits）。
- 要切换导光装置在HTS demo模式与Titration demo模式之间的运行状态，请按下左侧的按钮开关。此时装置将进入Titration demo模式，为用户提供视觉指导，帮助理解如何在化合物板中进行滴定操作。当导光装置进入Titration demo模式时，将发生以下情况：
- 第3列和第13列的所有孔以黄色照明。
- 随后每次按下右侧按钮开关，将依次点亮后续列，例如（第4和14列、第5和15列，依此类推）。
- 当按钮在达到第12和第22列后再次按下时，第4至12列和第13至22列的孔将以逐渐减弱的黄色强度点亮，以模拟滴定过程。
- 如需修改导光装置的默认行为，可通过USB线缆将其连接至计算机，并按照项目GitHub页面8上提供的详细说明，使用Arduino IDE更新默认固件。通过更新固件，用户可自定义这些模式以显示其他LED序列或组合。
4. 微孔板中干扰物的光照
- 将一个96孔或384孔微孔板放入便携式导光板中。
- 通过按最左侧的按钮开关两次，将导光板切换至照明模式。
注意：该模式的实际应用示例如图10 和 图11所示，其中化合物已从溶液中析出，可在微孔板底部观察到。若无背光照明，大多数沉淀物肉眼不可见，但M.A.P.L.E.背光可使沉淀物显现，便于用户检查及拍照记录。 - 根据应用需要，使用右侧按钮在一组预设颜色之间切换。每次按下右侧按钮，灯板将依次点亮所有LED，显示以下颜色：红色、蓝色、绿色、橙色、白色、紫色、黄色和靛蓝色。
- 作为可选步骤，可使用相机或智能手机拍摄被照亮的微孔板，用于存档或实验记录。
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结果
M.A.P.L.E. 平台能够以多种用户可配置的方式对96孔和384孔微孔板中的孔位进行照明，从而在每个孔中独立且简便地控制光的颜色和强度。通过减少手动移液操作中出错的可能性，M.A.P.L.E. 可帮助用户更有信心地制备微孔板，确保每个孔都含有目标内容物。在板间转移样品以及制备系列稀释板（如图12和图13所示示例）时，用户无需担心工作中分心而导致遗漏某些移液步骤。移液操作完成后，M.A.P.L.E. 平台还可用于照明微孔板，帮助用户识别潜在的异常现象，例如沉淀物、空孔、未完全加样孔或气泡。通过在微孔板制备的同时检测到这些异常，用户可在将样品送入后续实验流程前采取措施优化样品质量。
为验证M.A.P.L.E.的功能，开展了一项对照测试，用于评估使用打印工作列表与采用第1节协议中所述步骤进行移液操作时的速度和准确性。在该测试中，先导化合物筛选实验室的七名用户分别采用离线打印工作列表和M.A.P.L.E.引导模式完成相同的任务。这七名用户具有不同的移液经验，涵盖多年实...
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讨论
通过将 M.A.P.L.E. 作为开源平台发布，我们推出了一种不仅具有实用价值，而且能够轻松扩展以满足最终用户不断变化需求的实验工具。台式微孔板样品制备是一项在多种实验室环境中普遍进行的常规操作，而此类操作可通过 M.A.P.L.E. 这类技术得到显著改进。
M.A.P.L.E. 平台在设计之初就充分考虑了对未来应用的适应性。其各个组件（电子照明面板、固件、图形用户界面、外壳）均可单独提取使用，也可作为整个系统的一部分或任意中间组合形式使用。例如，3D 打印的项目外壳即使不配备照明面板，也可用于改善台面移液操作的人体工学性能。照明面板具有简单的三线接口，可连接至任何能够提供 +5 V 控制信号、+5 V 电源和接地（GND）的系统。软件图形用户界面（GUI）的功能和用途可通过 Python 代码进行修改，照明面板的电路可在 KiCad 中修改，而用于控制面板的微控制器固件则可在 Arduino IDE 中编辑。凭借这种灵活性，M.A.P.L.E. 平台可扩展以满足未来的需求。
在先前开发的用于微孔板照明的类似设备
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披露
作者对构建M.A.P.L.E.装置所建议的任何制造部件均无经济利益或利益冲突。所列来源仅为方便用户使用，可根据需要选用其他来源的任何兼容部件。
致谢
作者谨此感谢 Lina DeLuca、Fakhar Singhera、Hannah Williams、Lynn Deng、Osinachi Nwosu 和 Sarah Wachtman 在测试 M.A.P.L.E. 平台过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔或384孔微孔板 | https://zh.wikipedia.org/wiki/微孔板 | ||
| 微孔板辅助移液发光装置 | 开源 | https://github.com/pierrebaillargeon/Microplate-Assistive-Pipetting-Light-Emitter | |
| 移液器 | https://www.jove.com/science-education/5033/微量移液器简介 | ||
| 光谱仪 | 海洋光学 | USB-650 红潮 |
参考文献
- Baillargeon, P., et al. Design of Microplate-Compatible Illumination Panels for a Semiautomated Benchtop Pipetting System. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. , (2019).
- Baillargeon, P., et al. The Scripps Molecular Screening Center and Translational Research Institute. SLAS DISCOVERY: Advancing Life Sciences R&D. 24 (3), 386-397 (2019).
- BioSistemika. Pipetting Aid PlatR. , Available from: https://biosistemika.com/products/pipetting-platr/ (2019).
- Gilson Trackman Pipetting Tracker. Daigger Scientific. , Available from: https://www.daigger.com/gilson-trackma-pipetting-tracker-i-gsnf70301 (2019).
- TRACKMAN Connected US. Gilson. , Available from: https://www.gilson.com/default/systemm-trackman-connected-us.html (2019).
- LI-2100LightOne™ Pro. Embi Tec. , Available from: http://embitec.com/li2100-lightone-pro-384-and-96-well.html (2019).
- 96 well plate pipette light guide. qit vision. , Available from: https://www.qitvision.com/projects/#Plate (2019).
- Microplate Assistive Pipetting Light Emitter GitHub repository. , Available from: https://github.com/pierrebaillargeon/Microplate-Assistive-Pipetting-Light-Emitter (2019).
- Maplebear Electronics Tindie store. , Available from: http://maplebearelectronics.com (2019).
- Hawker, C. D., Schlank, M. R. Development of Standards for Laboratory Automation. Clinical Chemistry. 46, 746-750 (2000).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to the Micropipettor. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- General Laboratory Techniques. Introduction to the Spectrophotometer. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- General Laboratory Techniques. Introduction to the Microplate Reader. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
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重印与许可
