方法文章

大肠杆菌-表达自组装蛋白纳米颗粒的生产，用于需要三聚体异体的疫苗

DOI：

10.3791/60103

⸱

2019年8月21日

 ,  ,  , 
1U.S. Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 2Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, 3Alpha-O Peptides AG

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里提供了一种详细的方法，描述了用于疫苗开发中的自组装蛋白纳米颗粒（SDNA）的纯化、再折叠和表征。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自组装蛋白纳米粒子（SPN）作为重复抗原显示功能，可用于开发针对不同传染病的各种疫苗。在本文中，我们演示了一种生产 SAPN 内核的方法，该核体包含六螺旋束 （SHB） 组件，能够在三元构理中呈现抗原。我们描述了大肠杆菌系统中SHB-SAPN的表达，以及必要的蛋白质纯化步骤。我们包括异丙醇洗涤步骤，以减少残留的细菌脂多糖。作为蛋白质特性和纯度的指示，该蛋白与西方斑点分析中已知的单克隆抗体发生反应。重新折叠后，粒子的大小落在预期范围内（20至100纳米），动态光散射、纳米粒子跟踪分析和透射电子显微镜证实了这一点。此处描述的方法针对 SHB-SAPN 进行了优化，但是，只需稍作修改即可应用于其他 SAPN 构造。该方法还易于转移到大规模生产，用于人类疫苗的GMP制造。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

虽然传统的疫苗开发侧重于灭活或衰减的病原体，但现代疫苗的重点已经转向亚单位疫苗1。这种方法可以导致更有针对性的反应，并可能更有效地疫苗候选者。然而，主要的缺点之一是亚单位疫苗不是颗粒像整个生物体，可以导致降低免疫原性2。纳米粒子作为一种重复的抗原显示系统，既具有靶向亚单位疫苗方法的优点，又具有整个生物体1、3的颗粒性质。

在现有类型的纳米疫苗中，合理设计的蛋白质组件允许设计和开发疫苗候选体，这些候选疫苗可能以原生形1、4的形式呈现多种抗原拷贝 ，5，6.这些蛋白质组合的一个例子是自组装蛋白纳米粒子（SAPN）7。SPN基于盘绕线圈域，传统上以大肠杆菌8表示。SAPN疫苗候选疫苗已开发用于各种疾病，如疟疾、SARS、流感、弓形虫病和HIV-19、10、11、12、13 ,14,15,16,17,18,19.每个 SAPN 候选物的设计都特定于感兴趣的病原体，但是，生产、纯化和再折叠技术通常广泛适用。

我们目前的兴趣之一是有效的艾滋病毒-1疫苗。在RV144（HIV-1疫苗的III期临床试验中，证明疗效适中）的感染风险降低与IgG抗体与包络蛋白20、21的V1V2环相关。该地区原生状的三元状物表达被认为对保护性免疫原性22很重要。为了尽可能接近原生构象来呈现 V1V2 环，我们开发了一种原理验证 SAPN 疫苗候选项，该候选疫苗包含 HIV-1 包环融合后的六螺旋束 （SHB），将 V1V2 环呈现到正确的构象 9 中。.该候选物被已知的HIV-1包络蛋白的单克隆抗体所识别。小鼠接种V1V2-SHB-SAPN疫苗，引发V1V2特异性抗体，最重要的是，与gp70 V1V2结合，正确的构象表位9。SHB-SAPN 内核除了作为 HIV-1 V1V2 环路的载体角色外，还可以具有其他功能。在这里，我们描述了SHB-SAPN内核的表达、纯化、重新折叠和验证的详细方法。序列选择、纳米粒子设计、分子克隆、大肠杆菌转化等都曾被描述为9。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 大肠杆菌BL21（DE3）中SHB-SAPN蛋白的表达

  1. 按照制造商的说明，将介质中部件 A 的 95 mL 和介质 B 组件的 5 mL 混合到 2 L 无菌玻璃 Erlenmeyer 烧瓶中（参见材料表）。将安西林添加到100μg/mL的最终浓度中。
  2. 用大肠杆菌从先前建立的甘油库存培养基中接种介质。在 30°C 下孵育培养，以每分钟 200 次旋转 （rpm） 摇动 48 小时。
    注:所使用的大肠杆菌BL21（DE3）库存含有耐异氯联素表达载体23与SHB-SAPN基因。 虽然介质的一般方案建议在37°C下孵育24小时，但30°C的48小时孵育为SHB-SAPN提供了更高的产量。
  3. 将培养体转移到两个 50 mL 锥形管中。在 4，000 x g下将管离心 10 分钟，在 4°C 下使用固定角度转子。去除上清液并保存颗粒以收获细胞。
    注:细胞颗粒可以立即处理或在-80°C冷冻，直到使用。

2. 大肠杆菌BL21（DE3）通过声波的解压

注:使用在250°C下烘烤的非热性塑料制品和玻璃器皿至少30分钟。 Tris（2-carboxyhyl）磷化物（TCEP）作为还原剂，可破坏蛋白质内部和蛋白质之间的二硫化物粘结。如果显示的抗原含有S-S键，则在此协议期间的缓冲液中需要TCEP。仅对于 SHB-SAPN 内核，在缓冲区中不存在 TCEP 并不是必须的。

  1. 制备无氧缓冲液（8 M 尿素、50 mM 磷酸钠单基、20 mM Tris 底座、5 mM TCEP）pH 8.0（使用 5 N NaOH 调节），并使用 0.22 μm 真空瓶过滤单元对其进行过滤。
  2. 在一个 50 mL 锥形管中，使用 40 mL 的无 imidazol 缓冲液重新悬浮颗粒细胞（从步骤 1.3 开始）。用探针在冰上声波5分钟（4秒的声波，6秒的静止），声波输出为150W。
  3. 在4°C下将细胞液化液（40 mL）在29，000 x g下离心25分钟，在固定角度转子中产生澄清的上清液。将上清液转移到 150 mL 无菌烧瓶中并丢弃颗粒。使用无 imidazol 缓冲液（在协议中稍后称为"样品"）将上清液稀释至 100 mL。
    注: 此稀释步骤是为了防止 FPLC 系统压力在列上的裂化加载过程中变得过高。

3. 使用他柱进行蛋白质纯化

注:此协议是使用FPLC仪器执行的，但可以适应重力流。

  1. 准备以下缓冲液并使用0.22 μm真空瓶过滤装置进行过滤:（i） 无二甲苯缓冲液"缓冲A"（8M尿素，50mM磷酸钠单基，20 mM Tris底座，5 mM TCEP）pH 8.0;（ii） 500 mM imidazole 缓冲液"缓冲 B"（8 M 尿素、50 mM 磷酸钠单基、20 mM Tris 碱、5 mM TCEP、500 mM Imidazole） pH 8.0;和 （iii） 异丙醇洗涤 （20 mM Tris， 60% 异丙醇） pH 8.0.
    注:每个缓冲器的pH被调整为5 N NaOH。
  2. 平衡他的列。
    注:对于实验室规模生产，此协议使用 5 mL 预包装的 His 列，但可以使用任何较大的列。
    1. 打开 FPLC 软件并单击"新方法"选项。它将立即打开到"方法设置"菜单。在列位置的下拉菜单下，选择C1 端口 3。
    2. 在"按技术显示"下拉菜单中选择亲和力。在列类型下拉菜单中选择其他，Histrap HP，5 mL。列体积和压力箱将自动设置为相应的值。
    3. 单击"方法大纲"按钮。从"阶段"库弹出式菜单中拖动以下按钮:平衡、示例应用、列洗和按该确切顺序在箭头旁边洗脱。关闭"阶段库"菜单。
    4. 单击平衡按钮。表中列出的值应为"初始缓冲区 B"（4%）、"最终缓冲区 B"（4%）和"卷 （CV）"5。
    5. 单击"示例应用程序"框。在样品加载框中，单击带样品泵的列上注入样品的单选按钮。确保使用系统泵盒的样品喷射中选中了方法设置中的"使用流量"旁边的框。屏幕右侧的音量框旁边，将值更改为20 mL。
    6. 单击"列"洗涤按钮。表中列出的值应为"初始缓冲区 B"（4%）、"最终缓冲区 B"（4%）和"卷 （CV）"5。分数收集方案旁边取消单击"启用"框。
    7. 单击洗脱按钮。表中列出的值应为"初始缓冲区 B"0%、"最终缓冲区 B"100%和"卷 （CV）"5。分数收集方案旁边单击"启用"框。在下面的填充框中取消单击"使用方法设置中的小数大小"，并将分数大小调整为 4 mL。
    8. 单击软件顶部的"保存为"按钮。为文件命名"平衡"。
    9. 将 5 mL 预包装的 His 列连接到 FPLC 上的相应列端口 3。泵 A 和泵 B 油管以及样品泵管应放入 0.22 μm 过滤脱离子水中。运行平衡程序。
    10. 将泵 A 和泵 B 以及样品泵管放入无 imidazole 缓冲液 （Buffer A） 中，然后再次运行平衡协议。
  3. 将样品与柱上结合并纯化蛋白质。
    1. 打开 FPLC 软件并单击"新方法"选项。它将立即打开到"方法设置"菜单。在列位置的下拉菜单下，选择C1 端口 3。在"按技术显示"下拉菜单中选择亲和力。在列式下拉菜单中选择其他，Histrap HP，5 mL。列体积和压力箱将自动设置为相应的值。
    2. 单击"方法大纲"按钮。从"阶段库"弹出式菜单中拖动按钮:平衡、示例应用、列洗（洗涤 1）、列洗（洗涤 2）、列洗（洗涤 3）和其中箭头旁边的洗脱确切的顺序。关闭"阶段库"菜单。
    3. 单击"平衡"按钮。表中列出的值应为"初始缓冲区 B"4%、"最终缓冲区 B"4%和"卷 （CV）"5。
    4. 单击"示例应用程序"框。在样品加载框中，单击带有样品泵的列上的I nject 样品的单选按钮。确保使用系统泵盒的样品喷射中选中了方法设置中的"使用流量"旁边的框。
    5. 屏幕右侧的音量框旁边，将值更改为 100 mL。分数收集方案旁边单击"启用"按钮。取消单击"使用方法设置"框中的"使用分数大小"，然后将分数大小更改为 4 mL。
    6. 单击第一列洗涤按钮（洗涤 1）。表中列出的值应为"初始缓冲区 B"4%、"最终缓冲区 B"4%和"卷 （CV）"10。分数收集方案旁边单击"启用"框。取消单击方法设置中的"使用分数大小"，然后将分数大小更改为 4 mL。
    7. 单击第二列洗涤按钮（洗涤 2）。表中列出的值应为"初始缓冲区 B"0%、"最终缓冲区 B"0%和"卷 （CV）"5。分数收集方案旁边单击"启用"框。取消单击方法设置中的"使用分数大小"，然后将分数大小更改为 4 mL。
    8. 单击第三列洗涤按钮（洗涤 3）。表中列出的值应为"初始缓冲区 B"0%、"最终缓冲区 B"0%和"卷 （CV）"5。分数收集方案旁边单击"启用"。 取消单击"使用方法设置"框中的"使用分数大小"，然后将分数大小更改为 4 mL。
    9. 单击"洗脱"按钮。在表格中右键单击列出的信息，并在上一步的菜单上单击"删除步骤"。将异种渐变按钮拖到表上两次，以便有两个条目。
    10. 第一个条目的值应为"初始缓冲区 B" 30%、"最终缓冲区 B"30%和"卷 （CV）"10。第二个条目的值应为"初始缓冲区 B" 100%、"最终缓冲区 B"100%和"卷 （CV）"10。分数收集方案旁边单击"启用"按钮。单击"使用方法设置中的小数大小"旁边的框。
    11. 单击软件顶部的"另存为"按钮。命名文件"净化"。泵 FPLC 的 A 管应放入无 imidazol 洗涤缓冲液中，而泵 B 管应放入 500 mM imidazole 缓冲液中。样品泵管应放入 100 mL 样品中。
    12. 运行"净化"程序，等待需要 60% 异丙醇的时间（Wash 2）。暂停程序，将泵 A 管从无异丙醇洗涤液移入 60% 异丙醇洗涤中。重新启动程序。
    13. 异丙醇步骤完成后，再次暂停程序，并将泵 A 管移回无异丙酮洗涤缓冲液中。重新启动净化程序（其余运行是自动的）。

4. 通过SDS-PAGE进行纯度评估和蛋白质鉴定

  1. 结合所有与 （i） 流通（未绑定到他的柱的细胞流源）对应的所有分数，（ii） 洗涤 1，（iii） 洗涤 3 （60% 异丙醇洗涤），和 （iv） 在单独的 50 mL 锥形管中洗涤 3。不要合并洗脱步骤中的 2 mL 分数。
  2. 将每个池分馏分和洗脱步骤中的所有馏分中15μL与2xLaemmli样品缓冲液混合在0.5 mL微离心管中，并在95°C下变性10分钟。
  3. 当蛋白质变性时，在1xTris-甘氨酸SDS-PAGE运行缓冲液中设置3个无污渍的4⁄20%预制聚丙烯酰胺凝胶的凝胶运行装置。
  4. 将分子量标记的8μL加载到第一口井，将30μL的变性样品加载到凝胶的其他井中。以 200 V 的速度运行凝胶，直到染料正面击中凝胶底部（约 30 分钟）。从设备中取出凝胶，然后用去离子水短暂冲洗。使用无污渍成像系统立即对凝胶进行成像。
  5. 识别含有正确大小（18.07 kDa）的蛋白质带的分数。汇集所有这些分数。

5. 蛋白质识别由西方污点

  1. 使用他特异性抗体（抗6x HisTag）和SHB特异性抗体（167-D-IV）运行一个西体标记，以识别纯化的全长蛋白。抗6x HisTag抗体识别蛋白质的N终点，167-D-IV抗体识别C终点，证明全长蛋白的存在。
  2. 确定 （i） 流通、（ii） 洗涤 1、（iii） 洗涤 2 （60% 异丙醇洗涤）、（iv） 洗涤 3 和从光谱仪在 280 nm 的吸光度下洗脱步骤中的所有分数。在15 μL的无酰胺酶缓冲液中产生含有100 ng蛋白质的稀释剂。
  3. 将15μL的2x莱姆利样品缓冲液添加到每个15μL的样品中，并像步骤4.1那样变性。变性完成后，旋转管，以确保所有蛋白质可以转移。
  4. 将样品和预染色标记物装入无污渍的4-20%预制聚丙烯酰胺凝胶中。在 200 V 下运行电泳，直到染料正面到达凝胶底部。
  5. 当凝胶运行时，在 TBS-T 中生产 1 L 的 TBS-T（20 mM Tris、150 mM NaCl 和 0.1% 补间 20）和 200 mL 的 5% 非脂牛奶。
  6. 使用西印带转移系统将蛋白质转移到硝化纤维素膜上。使用预组装的转移堆栈，并将凝胶放在其上。设置系统以 25 V 运行 7 分钟。检查硝基纤维素膜上是否存在预染色标记，指示完全转移。
    注: 所有后续步骤在室温 （RT） 设置为 100 rpm 的轨道摇床上执行。
  7. 传输完成后，用 TBS-T 洗涤两次，每次 10 分钟。
  8. 用TBS-T中的5%无脂牛奶块附硝基纤维素膜（斑点），至少1小时。用TBS-T清洗两次，每次10分钟。
  9. 在 TBS-T（库存 Ab）中稀释原发性 167-D-IV 和抗 6x HisTag 抗体至 1 mg/mL。将库存 167-D-IV 10，000 倍和抗 6x HisTag 5，000 倍的库存 Abs 稀释，将库存 167-D-IV 和 4 μL 的库存抗 6x HisTag 抗体的 2 μL 添加到两个包含 20 mL TBS-T 的不同管中。将原抗体的总体积20 mL，每个斑点一个，孵育1小时。用TBS-T洗涤2次，10分钟。
  10. 在20 mL TBS-T（1:5，000稀释）中稀释小鼠抗人二级抗体与碱性磷酸酶结合的4 μL，即1mg/mL。在 20 mL TBS-T （1:5，000 稀释） 中稀释 4 μL 的 1 mg/mL 山羊抗小鼠二级抗体与碱性磷酸酶结合。将二级抗体添加到相应的血块。
    注:抗人类二级抗体与167-D结合，抗小鼠与抗6xHisTag结合。用 TBS-T 洗涤 2 次，10 分钟。
  11. 加入足够的BCIP/NBT碱性磷酸酶基板，以覆盖布带。开发污点约10分钟，直到带出现。用冷水冲洗冲泡，让它们干燥，然后用平板扫描仪扫描。

6. 重新折叠 SHB-SAPN

  1. 将汇集的蛋白质（共10μu201220 mL）加入10 kDa分子量切断透析盒，并将其透析成8M尿素，20mM Tris，5%甘油，5mM TCEP pH 8.5在RT（18\u201226 °C）过夜。
  2. 通过将透析缓冲液中的尿素浓度每 2 小时递减 2 M，缓慢地将尿素从样品中剥离。在尿素浓度为2 M时，将透析装置移至4°C（不要从此步骤中使用透析缓冲液中的TCEP）。在4°C过夜时，将样品透析成120 mM尿素、20 mM Tris、5%甘油、pH 8.5，完成再折叠。
  3. 从透析盒中取出重新折叠的蛋白质（SHB-SAPN）。使用 0.22 μm 聚氯乙烯 （PVDF） 注射器文件。将SHB-SAPN亚分到无菌管中，将其冷冻在-80°C，在RT处留下至少100μL，以便后续分析。

7. 按尺寸和外观验证粒子

  1. 动态光散射 （DLS）
    1. 通过以下参数测量 SHB-SAPN 的平均粒径:选择蛋白质作为材料，为 120 mM 尿素、20 mM Tris、5% 甘油 25°C 温度创建复合缓冲液，选择一次性比色皿进行分析，选择自动测量，设置为 5 次运行。
    2. 将 45 μL 的 SHB-SAPN 添加到一次性比色皿中，并通过单击绿色箭头运行软件。选择读出的百分比音量。
  2. 纳米粒子跟踪分析
    1. 在重新折叠的缓冲区中稀释样品 1:20。制作 10 mL 的稀释样品。
    2. 使用 3 mL 注射器，用重新折叠缓冲液冲洗 NTA 仪器，并加载约 1.5 mL 的样品以平衡仪器。使用示例的其余部分进行分析。
    3. 单击SOP选项卡在 NTA 软件中创建新的 SOP。在选项卡下，将捕获次数更改为 3，并将捕获时间更改为 30 s。 按下屏幕左侧的自动对焦按钮，使示例进入焦点。使用机器侧面的手动对焦旋钮微调对焦。
    4. 当系统提示使用注射器加载少量样品时，运行创建的 SOP。系统获取所有捕获后，将自动打开分析屏幕。滑动检测限制栏，以便所有真实粒子都标有红色十字标记。按下运行分析按钮，分析将自动开始。
  3. 传输电子显微镜 （TEM）
    1. 发光放电形态/碳 400 网状铜 TEM 支撑膜。
    2. 以0.075mg/mL浓度向网格添加3μL样品，使用滤纸将液体从液体中除掉30s。
    3. 用3 μL的去离子水清洗电网三次，每次用滤纸把水吸出。
    4. 在支撑膜中加入3 μL的0.5%酸酯，让它坐30s. Wick关闭大部分醋酸尿酸酯，但在水面上留下一层薄膜。在传输电子显微镜上成像之前，让样品干燥。
    5. 在 TEM 上以 80 kV 的成像样本。

8. 使用动力学脂质溶酶（LAL）测定样品中内毒素水平的测定

  1. 从冰箱中取出套件和样品，以便与 RT 平衡。
  2. 为了执行此测定，需要具有热块的板读取器，并且能够在 37°C 下以 405 nm 的波长读取 40 个读数的样本。编写程序模板，以便每 150 s 读取一口井以识别开始时间点（与第一次读取相比，OD 增加了 0.2）。
  3. 将样品稀释至PBS中的免疫剂量浓度。
    注: 重新折叠缓冲液的 pH 超出 LAL 测定范围。PBS 中样品的稀释会将 pH 设置为可接受的范围。
  4. 根据分析证书确定，在适当的无内毒素 LAL 水中重新悬浮控制内毒素，以生成 50 EU/mL。大力涡旋小瓶15分钟，以确保内毒素完全重新悬浮。
  5. 通过在 50 EU 至 0.005 EU/mL 范围内的玻璃瓶中预成型 10 倍的连续稀释，生成内毒素标准曲线。对于每次稀释，将先前稀释的 0.1 mL 添加到 0.9 mL 的 LAL 水。组合后大力涡旋1分钟。
  6. 将标准曲线稀释和 SHB-SAPN 样品重复添加到 96 孔板中。在重复中使用 LAL 水作为负控制。在37°C下预育板15分钟。
  7. 在孵育结束时，用2.6 mL的LAL水重新悬浮测定试剂瓶。用血清学移液器轻轻混合内容。
  8. 在 96 孔板的每个孔中加入 100 μL 的测定试剂。快速将板移到板读取器，并运行步骤 8.2 中编写的程序模板。
  9. 程序完成后，使用控件的日志值与开始时间的日志值生成标准曲线。使用此曲线生成的公式计算样品中的内毒素浓度。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此处显示的完全组装的 SHB-SAPN 基于蛋白质序列（图 1A），这些蛋白质序列预计将折叠成包含 60 个单体副本的粒子（图 1B）。图 2概述了 SHB-SAPN 内核的生产、纯化和识别方法。含有PPep-T表达载体的甘油蛋白大肠杆菌在BL21（DE3）大肠杆菌中诱导。细菌细胞在变性和还原条件下成功生长和分生。

总细胞裂液用于用Ni2+列（图3A）通过FPLC纯化SHB-SAPN单体。FPLC色谱仪显示，蛋白质在150 mM和500 mM imidazole（图3A）处均洗脱。色谱图还显示另外两个峰值，分别为185 mL和210 mL总体积，分别对应于异丙醇洗涤和无异丙酮洗涤。重组蛋白的分数和纯度通过梯度SDS-PAGE凝胶识别（图3B）。感兴趣的蛋白质主要位于分数 68\u201279 （278\u2012300 mL 总体积）。这些分数被合并用于进一步分析。具有抗他抗体（N-端）和167-D-IV抗体（C-端）的西方斑点表明，汇集的分数确实是感兴趣的蛋白质（图4A，B）。这些污点也显示了SHB-SAPN多体体的存在。早期的洗液和洗脱部分往往含有更高浓度的多美化蛋白，因此被排除在外。

含有感兴趣的蛋白质单体的样品通过透析折叠到完全组装的SHB-SAPN中。颗粒大小分布由DLS和纳米粒子跟踪分析确定（图5A，B）。DLS 识别了 Z 平均流体动力学直径为 67 nm 的粒子，而 NTA 系统测量的平均尺寸为 81 nm。轻微的尺寸差异是由于粒子大小调整技术，但是两个分析的大小都在20\u2012100nm8，24，25的预期范围内。SHB-SPN通过TEM可视化，图像显示形成良好的单个粒子，其大小分布从两种粒子大小调整技术中获得（图5C）。

在蛋白质的纯化过程中，用异丙醇清洗该柱，以减少最终SHB-SAPN产品中的LPS污染。为了验证内毒素水平是否可接受免疫，通过动力学LAL测定测定了在SHB-SAPN样品中LPS的浓度，无论是否使用异丙醇洗涤步骤。结果表明，异丙醇洗涤将内毒素水平从>0.25欧/微克降至0.010欧/μgSHB-SAPN蛋白（表1）。

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图1:SHB-SAPN蛋白序列和结构。（A） SHB-SAPN单体氨基酸序列.（B） 由60种蛋白质单体组成的完全组装的SHB-SAPN核心结构的计算机模型。氨基酸序列的配色方案:灰色 = HisTag;绿色 = 五角星;深蓝色 = 新设计修剪器;浅蓝色 = 六螺旋束。请点击此处查看此图的较大版本。

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图 2:流程图SHB-SAPN生产协议。配色方案:黑色=大肠杆菌中蛋白质单体表达;深灰色=单体纯化;中灰色 = 单体识别;浅灰色 = 重新折叠和表征;白色 = 完全组装的 SHB-SAPN 产品。在标有深色和中灰色的步骤中，蛋白质处于变性和减少条件。请点击此处查看此图的较大版本。

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图3:SHB-SAPN单体的蛋白质纯化。（A） 从FPLC纯化的色谱仪。色谱图上方的绿线表示纯化步骤。色谱图中的蓝线表示 280 nm 波长分数的光学密度。黑线显示在纯化每个阶段使用的缓冲液B（8M尿素、20 mM Tris、50 mM磷酸钠单基、5mM TCEP、500 mM Imidazole、pH 8.5）的百分比。（B） 来自解液 （L）、 流经 （FT）、 第一洗涤 （W1）、 异丙醇洗涤 （W2）、 第三洗涤 （W3） 的池状馏分的 SDS-PAGE 凝胶，以及 150 mM imidazole （E150） 和 500 mM imidazole （E500） 的单个馏分净化。第一通道 （M） 中的分子标记识别 10 到 250 kDa 之间的波段。目标蛋白由黑色箭头指示。请点击此处查看此图的较大版本。

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图4:西影蛋白的鉴定。所有通道都装有100纳克的蛋白质。（A） 带有反6xHisTag的西方污点的结果.（B） 带有167-D-IV HIV-1单克隆抗体的西方污点的结果。车道被标记为:M = 分子量标记;1 = 莱沙;2 = 流经;3 = 第一次洗涤;4 = 异丙醇洗涤（第二次洗）;5 = 第三次洗涤;6 = 池体积分数 56_u201261 （第一洗脱峰值），7 = 池体积派系 62\u201267（两个峰值之间），8 = 池体积分数 68\u201278 （第二个洗脱峰值）。目标蛋白的预期波段大小为18.07 kDa，作为单体SHB-SAPN带由黑色箭头指示。车道 7 和 8 中的额外条纹是 SHB-SAPN（红色箭头）的调暗器、修剪器和多通道。请点击此处查看此图的较大版本。

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图 5:重新折叠的 SHB-SAPN 的特性。（A） 由 DLS 确定的粒子大小分布。（B） 由纳米粒子跟踪（系统）确定的粒径。（C） TEM 对 SHB-SAPN 粒子的可视化。请点击此处查看此图的较大版本。

样品内毒素 （欧盟/mL）内毒素（欧盟/μg蛋白质）
SAPN 带异丙醇洗涤2.020.01
SAPN 无异丙醇洗涤>50>0.25
负控制低于检测级别不适用

表1:重新折叠的SHB-SVPN的内毒素水平。在SHB-SAPN样品中，使用或不带异丙醇洗涤的内毒素水平既呈现为内毒素单位/mL，也同时作为SHB-SAPN蛋白的内毒素单位/μg。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

纳米技术为亚单位疫苗开发提供了许多优势和解决方案。纳米疫苗可以反复将抗原作为微粒呈现给宿主免疫系统增加免疫原性26。虽然纳米疫苗有很多种，但我们认为，由脱新设计的蛋白质组成的疫苗似乎是疫苗开发中最强的方法。它们无需与宿主蛋白进行任何序列同源性设计，并在接近原生形构象的构象中呈现感兴趣的抗原，同时提供低生产成本和高产品产量。这种方法的一个最佳例子是SAPN技术，我们已经应用于多种传染病的疫苗7。为了解决HIV-1疫苗开发中的困难，我们设计了一个独特的SHB-SAPN核心，有效地将V1V2抗原呈现在原生型三元形构件9中。许多疫苗靶点，特别是病毒性疾病的疫苗靶点，都是作为27号疫苗存在的。这一现象表明，我们的SAPN设计对亚单位疫苗的开发有着广泛的影响。

在此方法中，我们演示了如何在大肠杆菌表达系统中生成SHB-SVPN。我们表示蛋白质的高产量（约6毫克/100毫克培养）。该蛋白质含有10个组氨酸，使用Ni2+柱的固定金属亲和色谱法很容易纯化。这一长度的His-Tag被发现是最高蛋白质产量的最佳。纯化的蛋白质包含设计蛋白质的全长，如N端HisTag和C端分子重复的存在所示。我们采用广泛接受的技术，并针对 SHB-SAPN 内核的表达、生产和表征进行了优化。在开发含有新蛋白质表位的SAPN过程中缺乏全长蛋白的产生可能表明宿主细胞中基因的表达问题。如果发生这种情况，基因和表达系统必须重新设计并适应所述协议。声波时间或强度的改变也可能增加预测的全长蛋白质的浓度。

根据DLS和纳米粒子跟踪分析，重新折叠的粒子在预期尺寸范围（20至100纳米）8、24、25。这些结果通过使用 TEM 得到了进一步的确认。如果此步骤中出现问题，通常是由于重新折叠缓冲液的 pH 或离子强度问题。在颗粒大小调整技术上检测到大尺寸颗粒时，它表示聚合，可以通过增加重新折叠缓冲区的 pH 值来避免聚合。如果DLS未检测到颗粒，则验证蛋白质的浓度并检查缓冲液的pH值。DLS的最终蛋白质浓度应至少为100μg/mL。如果浓度不是问题，它表示小，不完全形成的粒子的丰度，其浓度可以通过降低pH值降低。或者，氯化钠浓度可以调整到最佳范围，以尽量减少具有不需要大小的颗粒的存在。

最后，通过在净化过程中使用异丙醇洗涤步骤，我们能够将宿主大肠杆菌的污染LPS降低至0.01欧/μg SAPN，低于美国食品和药物管理局（FDA）对注射产品5欧/千克体重的限制28.通过使用称为 Q 列的 Anion 交换列，可以进一步降低此级别。如果仍然存在高水平的内毒素，请检查用于缓冲液制备的所有材料。请记住，在这种方法中，只使用脱热化玻璃器皿和不含内毒素的塑料器皿。

这些结果表明，我们已经成功地开发出一种可用于临床前免疫研究的SHB-SAPN核。当添加感兴趣的抗原时，只需稍作修改（如果有），即可对SHB-SPN的纯化应用这种方法。使用此方法作为起点的主要变化之一是在洗脱步骤。不同的蛋白质在必须经过实验确定的不同二甲苯浓度下洗去。另一个主要区别可能是重新折叠缓冲区的组成。优化需要测试不同的pH条件以及离子强度。

考虑到今后的工作，只需进行两次细微的修改，即可允许人类应用SHB-SAPN。第一，由于人类的阿霉素过敏，表达向量需要更改为卡那霉素抵抗可选择标记。人类使用蛋白质制造的另一个主要要求是在无动物产品的介质中生产SHB-SAPN。一项小规模的研究已经表明，在植物基培养基中蛋白质的合理产量。这里介绍的工作很容易扩展，以最终生产GMP，如疟疾疫苗候选者FMP01416所示。这种大规模的 FMP014-SAPN 生产包括阳离子交换和阳离子交换步骤，以进一步减少最终产品中的 LPS 和 Ni2+含量。这种细菌表达的SAPN已经扩展到即将到来的1/2a期临床试验。

披露

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所表达的观点是作者的观点，不应被解释为代表美国陆军或国防部的立场。彼得·伯克哈德对阿尔法-O肽股份公司感兴趣，并拥有该技术的专利。其他作者与本文所介绍的主题事项没有经济利益的任何公司没有隶属关系或财务关系。

致谢

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这项工作得到了亨利·杰克逊军事医学促进基金会和美国国防部的合作协议（W81XWH-11-2-0174）的支持。抗HIV-1 gp41 mAb 167-D IV抗体由苏珊·佐拉-帕斯纳博士通过NIH艾滋病试剂项目接收。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x Tris/甘氨酸/SDSBioRad16107321 L
2-巯基乙醇BioRad161071025 mL
2-丙醇FisherBP261814 L
2x Laemmli 样品缓冲液BioRad161073730 mL
40 ul 比色皿 100 个装，带塞马尔文帕纳科ZEN0040100 包
4–20% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶，10 孔，30 &微量;lBioRad456109310 包
氨苄青霉素FisherBP1760-2525 g
抗 6X His 标签抗体 [HIS.H8]AbCamab18184100 mg
抗 HIV-1 gp41 单克隆 （167-D IV）艾滋病试剂库11681100 mg
BCIP/NBT 底物，溶液Southern Biotech0302-01  100 毫升
康宁 一次性真空过滤器/存储系统Fisher09-761-108各种尺寸
Formvar/Carbon 400 目，铜 大约网格孔径：42µmTed Pella， Inc01754-F25包
GE医疗保健 5 mL HisTrap HP 预装柱GE HealthCare45-000-3255 包
甘油FisherBP229-44 L
山羊抗小鼠 IgG H&L（碱性磷酸酶）ABCamab970201 毫克
咪唑FisherO3196-500500 克
速溶脱脂奶粉质量生物 A614-100310 包
动力学-QCL 动力学促脉络生成鲎试剂测定Lonza Walkersville50650U192 检测试剂盒
鲎试剂级多孔板Lonza Walkersville25-3401板
Magic Media 大肠杆菌 表达培养基ThermoFisherK68031 L
MilliporeSigma Millex 无菌注射器 0.22 mm 过滤器MilliporeSLGV033RB250 包
小鼠抗人 IgG Fc-APSouthern Biotech9040-04  1.0 毫升
One Shot BL21 Star （DE3） 化学感受态 大肠杆菌ThermoFisherC60100320 小瓶
Precision Plus 蛋白质 未染色蛋白质标准品，链球菌标记重组，BioRad16103631 mL
Slide-A-Lyzer 透析盒，10K MWCO，12 mLThermoFisher66810,8支装
氯化钠FisherBP358-212,2.5kg
磷酸二氢钠FisherBP329-500500 g
Tris 碱FisherBP152-11 kg
Tris-（2-羧乙基）盐酸膦Biosynth InternationalC-1818100 g
乙酸铀酰，试剂，A.C.S电子显微镜服务541-09-325 g
尿素FisherBP169-5002.5 千克
Whatman 定性滤纸Sigma AldrichWHA10010155包 500
名称Company目录号评论
 设备
ChromLab 软件 版本 4BioRad12009390软件
Epoch 2 微孔板分光光度计BioTekEPOCH2读板仪
Fiberlite F14-14 x 50cy 固定角转子ThermoFisher096-145075转子
凝胶 Doc EZ 凝胶成像系统BioRad1708270凝胶成像仪免染凝胶
JEOL TEMJEOL1400透射电子显微镜
用于小型预制凝胶的 Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽BioRad1658004电泳凝胶
NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计ThermoFisherND-ONE-W用于蛋白质浓缩
NanoSight NS300马尔文帕尔文颗粒分子量测定
NanoSight NTA 软件 NTA马尔文 Panalytical颗粒分子量测定
New Brunswick Innova 44/44REppendorfM1282-0000培养箱/摇床
NGC Quest 10 色谱系统BioRad7880001FPLC 辅助蛋白质纯化
PELCO easiGlow 辉光排放清洁系统Ted Pella， INC91000S清洁网格
PowerPac通用电源BioRad1645070运行凝胶
Rocker ShakerDaiggerEF5536A适用于Western
Sonifer 450Branson也被称为096-145075 超声波仪
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 高速离心机ThermoFisher75-006-580离心机
Trans-Blot Turbo 迷你硝酸纤维素转移套装BioRad1704158用于 Western
Trans-Blot Turbo 转印系统BioRad1704150用于 Western
Vortex-Genie 2DaiggerEF3030AVortex
Zetasizer Nano ZS马尔文帕纳科颗粒分级
Zetasizer 软件马尔文帕纳科粒度分析

参考文献

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