利用红外纳米光谱与原子力显微镜表征单个蛋白质聚集体

摘要

我们描述了红外纳米光谱学和高分辨率原子力显微镜在可视化蛋白质自组装形成寡聚体聚集体和淀粉样纤维过程中的应用，该过程与多种人类神经退行性疾病的发病和发展密切相关。

摘要

蛋白质错误折叠与聚集现象会导致高度异质性蛋白聚集体的形成，这些聚集体与阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病密切相关。特别是低分子量聚集体——淀粉样寡聚体，已被证实具有普遍的细胞毒性，并被认为在多种类型的痴呆症中发挥神经毒素作用。本文阐述了基于原子力显微镜（AFM）的方法在表征这些聚集体的形貌、结构和化学性质方面的应用，由于这些聚集体具有高度异质性和瞬时性，常规的结构方法或整体生物物理方法难以对其进行研究。扫描探针显微技术现已能够以亚纳米分辨率解析淀粉样聚集体的形貌。本文进一步表明，红外纳米光谱技术（AFM-IR）可同时利用AFM的高分辨率和红外光谱的化学识别能力，实现对单个蛋白质聚集体结构特性的表征，从而为聚集机制提供深入见解。由于本文所述方法还可用于研究蛋白质组装体与小分子及抗体之间的相互作用，因此有望为开发用于诊断或治疗神经退行性疾病的新型治疗化合物提供基础性信息。

引言

目前全球有超过 4000 万人受到阿尔茨海默病（AD）¹和帕金森病（PD）²等神经退行性疾病的困扰。更广泛地说，已有超过五十种病理在分子水平上与蛋白质错误折叠和聚集有关，这一过程会导致不溶性纤维状蛋白质聚集体——即淀粉样沉积物——的增殖^3,4。然而，神经退行性病变的分子起源及其与导致淀粉样物质形成的蛋白质构象变化之间的关联仍不明确，很大程度上是由于这些致病性聚集体具有高度异质性、瞬时性和纳米级尺寸^4,5。

近几十年来，蛋白质结构研究的诸多重大成果在很大程度上依赖于体相（bulk）方法的应用，包括X射线晶体学、冷冻电子显微镜和核磁共振波谱法^5,6,7,8,9。在这一类技术中，红外（IR）光谱已成为解析蛋白质等生物体系化学特性的灵敏分析工具⁸。IR方法能够量化蛋白质在错误折叠和聚集过程中其二级和四级结构的变化。此外，为了在微观层面进一步阐明蛋白质聚集过程中复杂自由能景观所涉及的机制细节，一个重要的进展是化学动力学工具的发展，使其可拓展至包括淀粉样纤维形成在内的复杂自组装路径^{5,6,7,10,11,12}。然而，体相光谱方法仅能提供溶液中异质物种集合或特定微观步骤的平均信息，因而使得在纳米尺度上研究单个聚集物种的生物物理特性变得极具挑战性^13,14。

近几十年来，出现了多种能够在小于光衍射极限的尺度上运行的显微技术。这类方法包括电子显微镜（EM）和原子力显微镜（AFM）。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）可提供样品的二维（2D）图像，而原子力显微镜（AFM）在过去几十年中已成为一种强大且多功能的技术，能够以亚纳米分辨率研究样品的三维（3D）形貌及其纳米力学特性^{13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}。利用原子力显微镜（AFM）研究蛋白质聚集的原理在于，该方法能够对溶液中存在的单个物种的形貌进行表征^{13,14,16,17,19,20,21,25,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37}。特别是通过随时间监测样品，AFM 可用于研究样品中物种形貌的动态演变过程，从而实现对淀粉样蛋白形成路径的追踪与可视化^{23,25,38,39,40,41,42}。此外，AFM 还能够量化溶液中单个物种的结构参数，例如其横截面高度和长度^{13,19,30,31,32,33,34,35,36,37,40,43,44,45,46,47,48}。然而，在研究异质且复杂的生物系统时，仅研究单一的生物物理性质（如形貌）往往并不充分。单独使用 AFM、SEM 或 TEM 成像方法难以在纳米尺度上直接揭示淀粉样蛋白聚集体中不同组分的化学特性。

最近，随着红外纳米光谱技术（AFM-IR）在蛋白质聚集研究领域的开发与应用，对这一尺度下异质性生物样品的分析取得了重大进展^{24,26,38,42,49,50,51,52}。这一创新方法结合了原子力显微镜（AFM）的空间分辨率（约1−10 nm）与红外光谱（IR）的化学分析能力。AFM-IR技术基于红外激光激发产生的光热诱导共振效应，并通过AFM探针测量样品的热膨胀。样品可由红外激光从上方直接照射，或从下方以全内反射方式照射，类似于传统的红外光谱技术^24,42,52,53。红外激光可采用脉冲模式，典型频率在数百千赫兹范围内（1−1000 kHz），并可在宽光谱范围（通常为1000−3300 cm^-1）内调谐。尽管激光光源覆盖的区域直径约为30 µm，AFM-IR技术的空间分辨率主要由AFM探针尖端的直径决定，该探针用于检测样品局部的热膨胀。AFM-IR非常适合研究生物样品，因为其红外信号在样品厚度达1−1.5 µm范围内与厚度成正比，且所得红外光谱通常与相应的傅里叶变换红外透射光谱（FTIR）一致^13,54,55。因此，光谱学中已建立的分析方法可直接应用，例如化学位移分析、谱带形状变化分析以及二阶导数去卷积分析⁵²。总体而言，AFM-IR将AFM的空间分辨率与红外光谱的化学识别能力相结合，能够在纳米尺度上同时获取样品的多种形貌、力学和化学性质。

本文介绍了一种表征蛋白质聚集过程的实验方案，该方案结合了体外荧光分析、高分辨率原子力显微镜（AFM）成像以及纳米级AFM-红外光谱（AFM-IR）技术。这种联合方法已在多个研究领域中展现出卓越的能力，包括对蛋白质聚集体形成的微液滴的化学与结构特性进行详细分析、研究蛋白质液-液相分离过程，以及在纳米尺度上探究单个聚集物的异质性与生物物理特性^{23,26,38,45,50,53,56,57}。

方案

1. 荧光酶标仪上的聚集实验

注意：此处描述的实验方案是通过化学动力学研究任何蛋白质或肽聚集过程的一个示例。特别是，本文介绍了一种优化后的方案，用于研究与阿尔茨海默病发生和发展相关的 Aβ42 肽的聚集行为^58,59。类似方案可经适当调整后应用于其他蛋白质或肽聚集过程的研究。

1. 通过离子交换层析和尺寸排阻层析技术获得高纯度的Aβ42单体溶液，以区分含有Aβ42的蛋白组分，并从所获得的其他Aβ42聚集态形式中分离出单体组分^58,59.
2. 将Aβ42肽溶于pH 8.0的20 mM磷酸钠缓冲液（含200 µM EDTA）中⁵⁸ 至终浓度为1−5 µM，置于1.5 mL低吸附离心管中。用于原子力显微镜（AFM）检测的样品不应含有聚集分析中使用的荧光染料（硫黄素T，ThT），因其可能在AFM样品沉积过程中引入伪影。因此，需制备两组相同的溶液，每组三个重复：i）第一组含单体Aβ42，用于通过AFM监测聚集过程；ii）第二组在单体Aβ42基础上添加20 µM ThT作为示踪剂，用于监测聚集动力学。
   注意：步骤 1.1 和 1.2 必须在冰上操作。此操作旨在确保单体 Aβ42 溶液在被放入酶标仪之前不会发生聚集。处理样品时，应小心移液，避免引入气泡，以免影响蛋白质样品。
3. 在96孔黑色聚苯乙烯半区培养板（透明底、非结合表面）的每个孔中，分别加入80 µL每种样品。
4. 用铝箔密封反应板，以尽量减少聚集过程中样品的蒸发。
5. 将酶标仪温度平衡至37 °C。
6. 建立聚集实验方案，以440 nm为激发波长、480 nm为发射波长，在固定时间间隔读取荧光信号。聚集反应应在静止条件下启动。
7. 将培养板放入酶标仪中。
   注意：操作酶标板时需格外小心，以确保在启动酶标仪读数之前不会提前引发聚集反应。使用增益调节设置，以确保每份样品荧光信号的读数处于最佳状态。
8. 开始测量。
   注意：当 ThT 荧光 S 形曲线达到平台期时，聚集实验即告结束⁵⁸.

2. AFM 和纳米红外测量的样品制备

1. 使用胶带或双面胶将最高等级V1的云母片粘附到高质量的磁性不锈钢片上。
2. 通过将一片胶带贴在云母表面并撕去云母的顶层来刻蚀云母。此操作将产生清洁且原子级平整的表面，适用于样品沉积。
   注意：刻蚀后的表面必须均匀且光滑。
   警告：切勿触摸或直接对着新刻蚀的云母表面呼吸，以免引入人为假象。
3. 暂停或停止酶标仪测量，以在蛋白质聚集过程中采集感兴趣的时间点数据。
4. 移除密封箔，从孔中取出不含ThT的10 µL样品，转移至1.5 mL低吸附离心管中。
5. 将10 µL样品滴加至新刻蚀的云母表面。对于AFM-IR测量，样品必须沉积在新剥离的金基底上。
6. 让溶液在云母表面孵育1分钟，以实现物理吸附。
   注意：延长孵育时间可促进样品在表面的更好吸附，但可能引发人为的自组织和自组装现象²⁵。为避免这些效应，可采用喷雾沉积法²⁵。
7. 用1 mL超纯水冲洗三次。
8. 在温和的氮气气流下干燥，以便在空气环境中测量样品。

3. 蛋白质聚集体形态的原子力显微镜成像

注意：形貌测量既可在接触模式下进行，也可在轻敲模式下进行。以下步骤描述的是后者，因为该模式可减小侧向力，从而以高分辨率测量样品的三维形貌。AFM-IR 测量将在接触模式下进行，以提高 AFM-IR 的信噪比。

1. 在开始测量前至少30分钟开启原子力显微镜（AFM）系统，以确保系统达到热稳定状态。点击Setup，然后点击Probe。在Probe Change窗口中点击Next，以准备Z, Focus Stage。
2. 关闭AFM光束开关（如果处于开启状态）。解锁燕尾锁，将探头从系统上断开，并在Probe Change窗口中点击Next。
3. 将AFM悬臂安装到探头支架上。将探头重新连接至系统并锁紧燕尾锁。
   注意：在动态模式AFM中用于研究生物样品的最佳悬臂，其弹簧常数范围为2−40 N m^-1，尖端曲率半径范围为2−8 nm¹⁴。
4. 打开AFM激光束开关，并在Probe Change窗口中点击Next。
5. 在弹出窗口中，如果悬臂类型未改变，则点击No。调节光学对准旋钮以找到悬臂。将焦距对准悬臂，然后点击Next。
6. 在弹出窗口中，如果焦距已对准悬臂，则点击Yes。
7. 使用控制检测激光位置的旋钮，将激光束对准悬臂末端。通过调节控制反射激光束在位置敏感光电二极管（PSPD）上位置的旋钮，使四象限光电二极管测得的总信号最大化，至少达到>1 V。在Probe Change窗口中点击Next，然后点击Close。
8. 等待15分钟，使悬臂达到热稳定状态。如有必要，重新调节反射激光束在PSPD上的位置。
9. 点击NCM SWEEP，选择所需的振荡幅度，点击Use Phase，点击auto，并将悬臂调谐至其第一自由共振峰附近，对于弹簧常数为40 N m^-1的悬臂，其共振频率约为300 kHz。
   注意：将悬臂调谐偏离其自由共振峰值可确保更高的测量稳定性¹⁴。
10. 将样品放置在样品台上。选择合适的成像参数。对于1 x 1 µm²至5 x 5 µm²的扫描区域，典型的扫描速率为0.3−1.0 Hz。通常所需的分辨率为256 x 256至1024 x 1024像素。点击Scan Area以选择扫描尺寸和像素数量。
11. 将光学视图对焦于样品上。点击Approach以接近样品表面。接近完成后，点击Lift 100 µm，使AFM针尖上升至样品表面以上100 µm处。点击样品光学图像上的Expand。点击Focus Stage栏，将视图对焦于样品表面。
12. 使用箭头键移动至感兴趣的样品区域。按下Approach按钮使针尖接触表面。点击Line Scan按钮，检查针尖是否良好跟随样品表面，如有必要，调节Set Point。
13. 按下Scan按钮开始对样品表面进行成像。在成像过程中，为避免过大的成像力并保持不同独立样品之间的一致性，应维持相位变化恒定，且不超过Δ20°⁴²。
14. 输入文件名，并选择保存所获取图像的基本目录。

4. 蛋白质聚集体的红外纳米光谱测量

1. 在测量前 30−60 分钟开启原子力显微-红外（AFM-IR）系统和红外（IR）激光器⁶⁰，以实现热稳定。AFM-IR 仪器常用的激光器包括光参量振荡器（OPO）和量子级联激光器（QCL）。
2. 打开仪器内置控制软件，点击 file，然后点击 new，以新建一个 nanoIR 文件。按下 initialise 按钮以启动 AFM-IR 系统。
3. 打开仪器盖板，将一支镀金硅探针安装至 AFM-IR 系统，探针标称半径为 30 nm，弹簧常数为 0.2 N/m，用于在接触模式下测量样品。
4. 在 AFM probe 区域点击 Load，然后点击 next。在 focus on probe 区域，使用箭头按钮将摄像头对焦于悬臂末端。在 sample XY movement 区域，使用箭头将十字准线移至悬臂末端位置。
5. 旋转调节检测激光位置的旋钮，使激光对准悬臂末端。旋转 laser 旋钮，使四象限光电二极管测得的信号总和达到并最大化至大于>3 V 的值。旋转 deflection 旋钮，将悬臂偏转调节至 -1 V，然后点击 next。关闭仪器盖板。
6. 在 focus on sample 区域，使用箭头将摄像头对焦于样品表面。随后在 sample XY movement 区域，使用箭头将样品移动至目标区域，然后点击 approach and engage。
7. 在 microscope 窗口中，选择所需通道以映射样品的生物物理特性。具体而言，选择 height 用于形貌，Amplitude 2 用于红外吸收，PLL frequency 用于映射针尖-样品接触共振。
8. 在 controls 窗口的 AFM scan 区域，使用与第 3 节类似的参数（例如，扫描速率 0.1−1.0 Hz，像素数介于 256 × 256 至 1024 × 1024 之间）。根据样品粗糙度选择增益值：积分增益 I = 1−10，比例增益 P = 10−30。然后点击 scan 以获取形貌图。
   注：形貌也可在动态轻敲模式下测量，但本实验采用接触模式进行 AFM-IR 测量，以获得更高的信噪比。
9. 完成形貌成像后，在 microscope 窗口中点击高度图，将探针定位至某一聚集体顶部。随后在 controls 窗口的 nanoIR 区域，点击 start IR，以用红外激光照射样品。
10. 为将红外激光聚焦于悬臂，点击 optimisation。在该窗口中输入样品预期具有高吸收的波数，并点击 add。对于蛋白质，典型值为 1655 cm^-1。点击 scan 以确定红外激光位置，再点击 update 将其与悬臂对齐。关闭该窗口。
11. 在 nanoIR 设置的 general 区域，输入样品在相应波段预期具有高吸收的波数。随后关闭 Band Pass Filter 选项，观察 meter 读数及悬臂响应的快速傅里叶变换（FFT）。在 FFT 窗口中移动绿色光标，读取悬臂的共振频率。悬臂共振的典型 FFT 值约为 300 kHz。将该共振频率值填入 general 区域的 freq. centre 字段，并设置 freq. window 为 50 kHz。
    注：选择足够低的激光功率，以避免 meter 读数饱和、悬臂响应失真或样品过热。
12. 点击 laser pulse tune window 以启用共振增强模式。设置中心频率为 300 kHz，调谐范围为 50 kHz，激光占空比为 5%。点击 acquire 以扫描激光脉冲频率。利用图中光标，将激光脉冲频率调谐至样品吸收红外光后热膨胀的机械响应频率。随后选择 PLL 模式，以监测样品与针尖之间的接触共振。在 PLL 窗口中按下 zero 按钮，并勾选 enable 以跟踪样品-针尖接触共振。设置积分增益 I = 0.5，比例增益 P = 10。关闭该窗口。
13. 再次打开 optimisation 窗口，针对样品的主要吸收峰（酰胺 I-II-III 带）至少选择 3 个波数，并针对激光器的每个芯片至少选择一个波数，以确定红外激光的对应位置。
14. 点击 Tools | IR Background Calibration | New。在窗口中选择目标光谱区域（研究蛋白质样品时通常为 1800−1200 cm^-1）；选择与步骤 4.12 相同的脉冲频率和 5% 的占空比；点击 fast 采集模式，并选择激光扫描速度，量子级联激光器的典型范围为 20−500 cm^-1。点击 acquire 以测量红外激光背景。该背景光谱将用于归一化所测得的纳米级局域光谱。关闭该窗口。
    注：若无快速激光或共振增强模式，可跳过步骤 4.12，并在 background 和 IR spectra 采集窗口中选择 stepped 光谱而非 fast 模式。但此时无法实现单个聚集体的灵敏度。
15. 在 IR spectra 设置中，选择 1−4 cm^-1 的红外光谱分辨率，并设置至少 64 次累加平均。点击 acquire，在蛋白质特征波段（1800−1200 cm^-1）内测量纳米级局域红外光谱。
16. 为获取纳米级分辨的化学分布图，选择 IR imaging 模式，设定目标波数（例如，酰胺 I 带对应的 1655 cm^-1），然后在 AFM scan 窗口中点击 scan。
17. 完成成像后，进入 file 菜单并 save 保存测量数据。使用内置的 AFM 图像处理软件分析所获得的形貌、接触共振和化学分布图，以及纳米级局域光谱。光谱和图像可另存为 .csv 或 .axz 文件，以便使用商业软件进行进一步详细分析。

5. 横截面尺寸的图像处理与分析

1. 展平原始图像^{14,17,19,41,42,59} 使用内置的原子力显微镜图像处理软件或商业软件。
   注意：应将聚集体从计算中屏蔽，以避免分析产生伪影及对其测量高度的低估。
2. 通过零阶平面拟合减法展平图像。
3. 将图像按平面展平，然后逐行在1处展平^st 回归顺序中，重复第二步直至图像线轮廓达到平坦基线。
4. 如果样品过于密集、含有异常高量的聚集体或存在扫描仪弓形伪影，请使用 2 扁平化图像^nd 回归阶数拟合。
5. 从垂直于原纤维轴的线轮廓测量聚集体的高度和宽度^{14,17,19,41,42,59}.
6. 沿纤维轴方向测量纤维长度^{14,17,19,41,42,59}.

结果

通过ThT荧光检测法测定的Aβ42聚集的代表性时间过程如图1所示。该聚集过程通常表现为S形曲线，初始阶段出现滞后相，随后进入快速生长相，最终曲线达到平台期，此时系统达到平衡稳态^6,7,58。为研究与聚集过程相关的分子细节，必须采用优化的聚集实验方案，以获得高质量的数据⁵⁸。

原子力显微镜（AFM）的高分辨率能够用于研究聚集过程中不同时间点的聚集体形态及其异质性。在通过ThT检测监测聚集过程的同时，从孔板中取出样品等分试样，用于后续的AFM和纳米红外（nano-IR）单个聚集体分析（图1）。手动样品制备的典型流程如图2所示。在利用高分辨率和相位控制AFM完成对样品三维形态的测...

讨论

本方案中的第一个关键步骤是制备单体蛋白，例如步骤 1.1 和 1.2 中所述的 Aβ42 溶液。必须从高度纯净的单体溶液开始聚集过程，因为若存在寡聚体或聚集态物质，可能导致聚集动力学的重复性差⁵⁸，并在原子力显微镜（AFM）测量中引入假象（例如，在聚集初始阶段即出现纤维状物质），从而导致对数据的误读。基于硫磺素 T（ThT）荧光检测法获得的高度可重复的淀粉样蛋白形成动力学数据，结合化学动力学的主方程形式化方法^5,6,7，已能够将 Aβ42 的聚集机制定义为其基本的分子事件。化学动力学通过考虑新聚集体形成和生长的不同途径（例如聚集体末端的延伸或聚集体表面的二次成核），将淀粉样蛋白形成的微观步骤与其宏观表现联系起来。然而，仅靠化学动力学本身无法直接实现对纳米尺度可能成核现象的可视化，因此需要与单分子方法相结合。

本方案中的第二个关键步骤是步骤 2.2 和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AFM-IR 系统	Anasys Instruments	nanoIR 2 或 3	用于测量接触模式和共振模式下热膨胀的系统
康宁 96 孔半面积黑色/透明底部聚苯乙烯 NBS 微孔板	Corning	3881
康宁微孔板铝密封膜	Corning	6570
双面粘附圆盘	AGAR Scientific	AGG3347N
FLUOstar Omega	BMG Labtech	415-101	微孔板读数仪
云母圆盘 10 mm V1	AGAR Scientific	AGF7013
Park NX10 原子力显微镜系统	Park Systems	N/A	原子力显微镜
Platypus 超平整金芯片	Platypus Technologies	AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 悬臂梁	Park Systems	PPP-NCHR-10
蛋白质低吸附管，2.0 mL	Eppendorf	30108132
硅基镀金悬臂梁	Anasys Instruments	PR-EX-nIR2
SPM 样品圆盘 12 mm	AGAR Scientific	AGF7001