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方法文章

利用红外纳米光谱与原子力显微镜表征单个蛋白质聚集体

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DOI：

10.3791/60108

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2019年9月12日

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

本文内容

摘要

我们描述了红外纳米光谱学和高分辨率原子力显微镜在可视化蛋白质自组装形成寡聚体聚集体和淀粉样纤维过程中的应用，该过程与多种人类神经退行性疾病的发病和发展密切相关。

摘要

蛋白质错误折叠和聚集现象会导致形成高度异质性的蛋白质聚集体，这些聚集体与阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病相关。特别是低分子量聚集体——淀粉样寡聚体，已被证明具有普遍的细胞毒性，并被认为是多种痴呆症中的神经毒素。本文阐述了基于原子力显微镜（AFM）的方法在表征这些聚集体的形貌、结构和化学性质方面的应用，由于这些聚集体具有异质性和瞬时性，使用传统的结构方法或整体生物物理方法难以对其进行研究。扫描探针显微技术现已能够以亚纳米分辨率研究淀粉样聚集体的形貌。本文表明，红外纳米光谱技术（AFM-IR）可同时利用AFM的高分辨率和红外光谱的化学识别能力，进一步实现对单个蛋白质聚集体结构特性的表征，从而为聚集机制提供深入见解。由于本文所述方法还可用于研究蛋白质组装体与小分子及抗体之间的相互作用，因此可为开发用于诊断或治疗神经退行性疾病的新型治疗化合物提供基础性信息。

引言

目前全球有超过 4000 万人受到神经退行性疾病的影响，例如阿尔茨海默病（AD）1 和帕金森病（PD）2。更广泛地说，已有超过五十种病理在分子水平上与蛋白质错误折叠和聚集相关，这一过程导致不溶性纤维状蛋白质聚集体（即淀粉样沉积物）的增殖3,4。然而，神经退行性变的分子起源及其与导致淀粉样物质形成的蛋白质构象变化之间的关联仍不明确，这很大程度上是由于致病性聚集体具有高度异质性、瞬时特性和纳米级尺寸4,5。

近几十年来，蛋白质结构的深入研究在很大程度上依赖于多种体相（bulk）方法，包括X射线晶体学、冷冻电子显微镜和核磁共振波谱法5,6,7,8,9。在这一类技术中，红外（IR）光谱已成为解析蛋白质等生物体系化学特性的灵敏分析工具8。IR方法能够量化蛋白质在错误折叠和聚集过程中其二级和四级结构的变化。此外，为了在微观层面进一步解析蛋白质聚集过程中复杂自由能景观所涉及的机制细节，一个重大进展是化学动力学工具的发展，使其可拓展至包括淀粉样纤维形成在内的复杂自组装路径5,6,7,10,11,12。然而，体相光谱方法仅能提供溶液中异质物种集合或特定微观步骤的平均信息，因此在纳米尺度上研究单个聚集物种的生物物理特性仍具挑战性13,14。

近几十年来，出现了多种能够在小于光衍射极限的尺度上运行的显微技术。这类方法包括电子显微镜（EM）和原子力显微镜（AFM）。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）可提供样品的二维（2D）图像，而原子力显微镜（AFM）在过去几十年中已成为一种强大且多功能的技术，可用于研究三维（3D）形貌以及样品的纳米力学性质，其分辨率可达亚纳米级别13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27。利用原子力显微镜（AFM）研究蛋白质聚集的原理在于，该方法能够对溶液中单个物种的形貌进行表征13,14,16,17,19,20,21,25,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37。特别是通过随时间监测样品，AFM 可用于研究样品中物种形貌的动态演变过程，从而实现对淀粉样蛋白形成路径的追踪与可视化23,25,38,39,40,41,42。此外，AFM 还能够量化溶液中单个物种的结构参数，例如截面高度和长度13,19,30,31,32,33,34,35,36,37,40,43,44,45,46,47,48。然而，在研究异质且复杂的生物系统时，仅研究单一的生物物理性质（如形貌）往往并不充分。单独使用 AFM、SEM 或 TEM 成像方法难以在纳米尺度上直接揭示淀粉样蛋白聚集体中不同物种的化学特性。

最近，随着红外纳米光谱技术（AFM-IR）在蛋白质聚集研究领域的开发与应用，对这一尺度下异质性生物样品的分析取得了重大进展24,26,38,42,49,50,51,52。这一创新方法结合了原子力显微镜（AFM）的空间分辨率（约1−10 nm）与红外光谱（IR）的化学分析能力。AFM-IR技术基于测量由红外激光驱动的光热诱导共振效应，并利用AFM探针检测样品的热膨胀。样品可由红外激光从上方直接照射，或通过全内反射从底部照射，方式类似于传统的红外光谱技术24,42,52,53。红外激光可采用脉冲模式，典型频率在数百千赫兹范围内（1−1000 kHz），并可在宽光谱范围（通常为1000−3300 cm-1）内调谐。尽管激光光源覆盖的区域直径约为30 µm，AFM-IR技术的空间分辨率主要由AFM探针尖端的直径决定，该探针用于检测样品局部的热膨胀。AFM-IR非常适合研究生物样品，因为其红外信号在样品厚度达1−1.5 µm范围内与厚度成正比，且所得红外光谱通常与相应的傅里叶变换红外透射光谱（FTIR）一致13,54,55。因此，光谱学中已建立的分析方法可直接应用于AFM-IR数据，例如化学位移分析、谱带形状变化分析以及通过二阶导数去卷积分析52。总体而言，AFM-IR将AFM的空间分辨率与红外光谱的化学识别能力相结合，能够在纳米尺度上同时获取样品的多种形貌、力学和化学性质。

本文介绍了一种表征蛋白质聚集过程的实验方案，该方案结合了体外荧光检测、高分辨率原子力显微镜（AFM）成像以及纳米级AFM-IR技术。这种联合方法已在多个研究领域中展现出卓越能力，包括对蛋白质聚集体形成的单个微滴的化学与结构特性进行详细分析、研究蛋白质液-液相分离过程，以及在纳米尺度上探究单个聚集物的异质性与生物物理特性23,26,38,45,50,53,56,57。

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方案

1. 荧光酶标仪上的聚集实验

注意：此处描述的实验方案是通过化学动力学研究任何蛋白质或肽聚集过程的一个示例。特别是，本文介绍了一种优化后的方案，用于研究与阿尔茨海默病发病及进展相关的 Aβ42 肽的聚集行为58,59。类似方案可经适当调整后应用于研究其他任何蛋白质或肽的聚集过程。

  1. 通过离子交换层析和尺寸排阻层析技术获得高纯度的Aβ42单体溶液，以区分含有Aβ42的蛋白组分，并从所获得的其他Aβ42聚集态形式中分离出单体组分58,59.
  2. 将Aβ42肽溶于pH 8.0的20 mM磷酸钠缓冲液（含200 µM EDTA）中58 在1.5 mL低吸附离心管中，将样品稀释至终浓度为1−5 µM。用于原子力显微镜（AFM）检测的样品不应含有聚集分析中使用的荧光染料（硫黄素T，ThT），因为该染料可能在AFM样品沉积过程中引入伪影。因此，需制备两组相同的样品，每组设三个重复：i）第一组仅含Aβ42单体，用于通过AFM监测聚集过程；ii）第二组在Aβ42单体中添加20 µM ThT作为示踪剂，用于监测聚集动力学。
    注意：步骤 1.1 和 1.2 必须在冰上操作。此步骤的目的是确保单体 Aβ42 溶液在被放入酶标仪之前不会发生聚集。处理样品时，应小心移液，避免引入气泡，以免影响蛋白样品。
  3. 将每种样品各80 µL加入96孔黑色聚苯乙烯半面积板的每个孔中，该板具透明底和非结合表面。
  4. 用铝箔密封反应板，以尽量减少聚集过程中样品的蒸发。
  5. 将酶标仪温度平衡至 37 °C。
  6. 建立聚集实验方案，以440 nm为激发波长、480 nm为发射波长，在固定时间间隔读取荧光信号。聚集反应应在静止条件下启动。
  7. 将培养板放入酶标仪中。
    注意：操作酶标板时需格外小心，以确保在启动酶标仪之前不会提前引发聚集反应。使用增益调节设置，以确保每份样品荧光信号读数的最佳效果。
  8. 开始测量。
    注意：当 ThT 荧光 S 形曲线达到平台期时，聚集实验即告结束58.

2. 原子力显微镜与纳米红外测量的样品制备

  1. 使用胶带或双面胶将最高等级V1的云母片粘附到高质量的磁性不锈钢片上。
  2. 通过将一片胶带贴在云母表面并撕去云母的顶层来进行云母刻蚀。此操作可获得清洁且原子级平整的表面，适用于样品沉积。
    注意：刻蚀后的表面必须均匀且光滑。
    警告：切勿触摸或直接对着新刻蚀的云母表面呼吸，以免引入人为假象。
  3. 暂停或停止酶标仪测量，以在蛋白质聚集过程中采集感兴趣的时间点数据。
  4. 移除密封箔膜，从孔中取出不含ThT的10 µL样品，转移至1.5 mL低吸附离心管中。
  5. 将10 µL样品滴加到新刻蚀的云母表面。进行AFM-IR测量时，样品必须沉积在新剥离的金基底上。
  6. 让溶液在云母表面孵育1分钟，以实现物理吸附。
    注意：延长孵育时间可增强样品在表面的吸附，但可能引发人为的自组织和自组装现象25。为避免这些效应，可采用喷雾沉积法25。
  7. 用1 mL超纯水冲洗三次。
  8. 在温和的氮气气流下吹干，以便在空气环境中对样品进行测量。

3. 蛋白质聚集体形态的原子力显微镜成像

注意：形貌测量既可以在接触模式下进行，也可以在轻敲模式下进行。以下步骤描述的是后者，因为该模式可减小侧向力，从而以高分辨率测量样品的三维形貌。AFM-IR 测量将在接触模式下进行，以提高 AFM-IR 的信噪比。

  1. 在开始测量前至少30分钟开启原子力显微镜（AFM）系统，以确保系统达到热稳定状态。点击Setup，然后点击Probe。在Probe Change窗口中点击Next，以准备Z, Focus Stage。
  2. 关闭AFM光束开关（如果处于开启状态）。解锁燕尾锁，将探头从系统上断开，并在Probe Change窗口中点击Next。
  3. 将AFM悬臂安装到探头支架上。将探头重新连接至系统并锁紧燕尾锁。
    注意：在动态模式AFM中用于研究生物样品的最佳悬臂，其弹簧常数范围为2−40 N m-1，尖端半径范围为2−8 nm14。
  4. 打开AFM激光束开关，并在Probe Change窗口中点击Next。
  5. 在弹出窗口中，如果悬臂类型未改变，则点击No。调节光学对准旋钮以找到悬臂。将焦点对准悬臂，然后点击Next。
  6. 在弹出窗口中，如果焦点已对准悬臂，则点击Yes。
  7. 使用控制检测激光位置的旋钮，将激光束对准悬臂末端。通过调节控制反射激光束在位置敏感光电二极管（PSPD）上位置的旋钮，使四象限光电二极管测得的总信号最大化，至少达到>1 V。在Probe Change窗口中点击Next，然后点击Close。
  8. 等待15分钟，使悬臂达到热稳定状态。如有必要，重新调节反射激光束在PSPD上的位置。
  9. 点击NCM SWEEP，选择所需的振荡振幅，点击Use Phase，点击auto，并将悬臂调谐至其第一自由共振峰附近，对于弹簧常数为40 N m-1的悬臂，该共振频率约为300 kHz。
    注意：将悬臂调谐偏离其自由共振峰值可确保更高的测量稳定性14。
  10. 将样品放置在样品台上。选择合适的成像参数。对于1 × 1 µm2至5 × 5 µm2的扫描区域，典型的扫描速率为0.3−1.0 Hz。通常所需的分辨率为256 × 256至1024 × 1024像素。点击Scan Area以选择扫描尺寸和像素数量。
  11. 将光学视图对焦于样品上。点击Approach以接近样品表面。接近完成后，点击Lift 100 µm，使AFM针尖上升至样品表面以上100 µm处。点击样品光学图像上的Expand。点击Focus Stage栏，将视图对焦于样品表面。
  12. 使用箭头键移动至感兴趣的样品区域。按下Approach按钮使针尖接触表面。点击Line Scan按钮，检查针尖是否良好跟踪表面，如有必要，调节Set Point。
  13. 按下Scan按钮开始对样品表面进行成像。在成像过程中，为避免过大的成像力并保持不同样品间的一致性，应维持相位变化恒定，且不超过Δ20°42。
  14. 输入文件名，并选择保存所获取图像的基本目录。

4. 蛋白质聚集体的红外纳米光谱测量

  1. 在测量前 30−60 分钟开启原子力显微-红外（AFM-IR）系统和红外（IR）激光器60，以实现热稳定。AFM-IR 仪器常用的激光器包括光参量振荡器（OPO）和量子级联激光器（QCL）。
  2. 打开仪器控制用的内置软件。点击 文件，然后点击 新建，以创建一个新的 nanoIR 文件。按下 初始化 按钮以启动 AFM-IR 系统。
  3. 打开仪器盖板，将一支镀金硅探针安装到 AFM-IR 系统上，该探针标称半径为 30 nm，弹簧常数为 0.2 N/m，用于在接触模式下测量样品。
  4. 在 AFM 探针 部分点击 加载，然后点击 下一步。在 聚焦探针 部分，点击箭头将摄像头对焦于悬臂末端。在 样品 XY 移动 部分，使用箭头将十字准线移至悬臂末端。
  5. 旋转控制检测激光位置的旋钮，使激光对准悬臂末端。旋转 激光 旋钮，使四象限光电二极管测得的总信号最大化至大于 >3 V 的值。旋转 偏转 旋钮，将悬臂偏转调节至 -1 V，然后点击 下一步。关闭仪器盖板。
  6. 在 聚焦样品 部分，使用箭头将摄像头对焦于样品。随后在 样品 XY 移动 部分，使用箭头将样品移动至感兴趣区域，并点击 接近并接触。
  7. 在 显微镜 窗口中，选择用于映射样品生物物理特性的目标通道。具体而言，选择 高度 用于形貌，振幅 2 用于红外吸收，PLL 频率 用于映射针尖-样品接触共振。
  8. 在 控制 窗口的 AFM 扫描 部分，使用与第 3 节类似的参数（例如，扫描速率 0.1−1.0 Hz，像素数介于 256 × 256 至 1024 × 1024 之间）。根据样品粗糙度选择增益值：积分增益 I = 1−10，比例增益 P = 10−30。然后点击 扫描 以获取形貌图。
    注意：形貌也可在动态轻敲模式下进行测量，但此处 AFM-IR 测量采用接触模式，以获得更高的信噪比。
  9. 完成形貌映射后，在 显微镜 窗口中点击高度图，将探针定位在一个聚集体的顶部。然后在 控制 窗口的 nanoIR 部分，点击 启动 IR，以用红外激光照射样品。
  10. 为将红外激光聚焦于悬臂上，点击 优化。在此窗口中，输入样品预期具有高吸收的波数，并点击 添加。对于蛋白质，典型值为 1655 cm-1。点击 扫描 以确定红外激光位置，再点击 更新 以将其位置与悬臂对齐。关闭窗口。
  11. 在 nanoIR 设置的 通用 部分，输入预期在相关区域具有高吸收的波数。随后关闭 带通滤波器 选项，观察 表头 读数及悬臂响应的快速傅里叶变换（FFT）。在 FFT 窗口中移动绿色光标，读取悬臂的共振频率。悬臂共振 FFT 的典型值约为 300 kHz。将此共振频率值填入 通用 部分的 中心频率 字段，并设置 频率窗口 为 50 kHz。
    注意：选择足够低的激光功率，以避免 表头 读数饱和、悬臂响应失真或样品过热。
  12. 点击 激光脉冲调谐窗口 以启用共振增强模式。选择中心频率为 300 kHz，调谐范围为 50 kHz，激光占空比为 5%。点击 采集 以扫描激光脉冲频率。利用图中光标，将激光脉冲频率调谐至样品吸收红外光后热膨胀的机械响应频率。然后选择 PLL 选项以监测样品与针尖之间的接触共振。在 PLL 窗口中按下 归零 按钮并勾选 启用，以跟踪样品-针尖接触共振。选择积分增益 I = 0.5，比例增益 P = 10。关闭窗口。
  13. 再次打开 优化 窗口，针对样品的主要吸收带（酰胺 I-II-III 带）至少选择 3 个波数，同时针对激光器的每个芯片至少选择一个波数，以确定红外激光的对应位置。
  14. 点击 工具 | 红外背景校准 | 新建。在窗口中选择感兴趣的光谱区域（研究蛋白质样品时通常为 1800−1200 cm-1）；选择与步骤 4.12 相同的脉冲频率和 5% 的占空比；点击 快速 采集，并选择激光扫描速度，量子级联激光器的典型范围为 20−500 cm-1。点击 采集 以测量红外激光背景。该背景光谱将用于归一化所测得的纳米级局域光谱。关闭窗口。
    注意：若无快速激光或共振增强模式，可跳过步骤 4.12，并在 背景 和 红外光谱 采集窗口中选择 步进 光谱而非 快速 光谱。但此时无法达到单个聚集体的检测灵敏度。
  15. 在 红外光谱 设置中，选择 1−4 cm-1 的光谱分辨率，并设置至少 64 次累加平均。点击 采集，在蛋白质范围（1800−1200 cm-1）内测量纳米级局域红外光谱。
  16. 为获取纳米级分辨的化学图谱，选择 红外成像 选项，设定感兴趣的波数（例如，酰胺 I 带为 1655 cm-1），然后在 AFM 扫描 窗口中点击 扫描。
  17. 完成映射后，进入 文件 并 保存 测量数据。使用内置的 AFM 图像处理软件分析所获得的形貌、接触共振和化学图谱，以及纳米级局域光谱。光谱和图像可保存为 .csv 或 .axz 文件，以便使用商业软件进行进一步详细分析。

5. 横截面尺寸的图像处理与分析

  1. 展平原始图像14,17,19,41,42,59 使用内置的原子力显微镜图像处理软件或商业软件。
    注意：应将聚集体从计算中排除，以避免分析产生伪影并防止对其测量高度的低估。
  2. 通过零阶平面拟合减法对图像进行平整化处理。
  3. 将图像按平面展平，然后逐行以1为单位进行展平st 回归阶数，重复第二步直至图像线轮廓达到平坦基线。
  4. 如果样品过于密集、含有异常高比例的聚集体或存在扫描仪弓形伪影，请使用 2 扁平化图像nd 回归阶数拟合
  5. 从垂直于原纤维轴的线轮廓测量聚集体的高度和宽度14,17,19,41,42,59.
  6. 沿纤维轴方向测量纤维长度14,17,19,41,42,59.

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结果

通过ThT荧光检测法测得的Aβ42聚集的代表性时间过程如图1所示。该聚集过程通常表现为S形曲线，初始阶段出现滞后期，随后进入快速生长期，最终曲线达到平台期，此时系统达到平衡稳态6,7,58。为研究与聚集过程相关的分子机制，必须采用优化的聚集实验方案，以获得高质量的数据58。

原子力显微镜（AFM）的高分辨率能够用于研究聚集过程中不同时间点聚集物的形态和异质性。在通过ThT检测监测聚集过程的同时，将样品板中的等分试样制备用于AFM和纳米红外（nano-IR）对单个聚集体的分析（图1）。手动样品制备的典型流程如图2所示。在利用高分辨率和相位控制AFM完成对样品三维形态的测量后，...

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讨论

本方案中的第一个关键步骤是制备单体蛋白，例如步骤1.1和1.2中所述的Aβ42溶液。必须从高纯度的单体溶液开始聚集过程，因为若存在寡聚体或已聚集的物种，可能导致聚集动力学的重复性差58，并在原子力显微镜（AFM）测量中引入伪影（例如，在聚集初始阶段即可观察到纤维状物种），从而导致对数据的误读。基于硫磺素T（ThT）荧光检测法获得的高度可重复的淀粉样蛋白形成动力学数据，结合化学动力学的主方程形式化方法5,6,7，已能够从分子事件层面定义Aβ42的聚集机制。化学动力学通过考虑新聚集体形成和生长的不同途径（例如在聚集体末端的延伸或在聚集体表面的二次成核），将淀粉样蛋白形成的微观步骤与其宏观表现联系起来。然而，仅靠化学动力学本身无法直接实现对纳米尺度上可能成核现象的可视化，因此需要与单分子方法相结合。

本方案中的第二个关键步骤是步骤 2.2 和 2.6−2....

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢瑞士国家科学基金会（SNF）提供的资金支持（项目编号 P2ELP2_162116 和 P300P2_171219）、达尔文学院、伊拉斯谟+项目提供的资金支持（项目编号 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3），以及欧洲研究理事会根据欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）通过 ERC 资助项目 PhysProt（协议编号 337969）、纽曼基金会（T.P.J.K.）和剑桥蛋白质错误折叠疾病研究中心（C.G.、M.V. 和 T.P.J.K.）为本研究所提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AFM-IR 系统Anasys InstrumentsnanoIR 2 或 3用于测量接触模式和共振模式下热膨胀的系统
Corning 96 孔半面积黑色/透明底部聚苯乙烯 NBS 微孔板Corning3881
Corning 微孔板铝密封膜Corning6570
双面粘性圆盘AGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar OmegaBMG Labtech415-101微孔板读数仪
云母圆盘 10 mm V1AGAR ScientificAGF7013
Park NX10 AFM 系统Park SystemsN/A原子力显微镜
Platypus 超平整金芯片Platypus TechnologiesAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 悬臂梁Park SystemsPPP-NCHR-10
蛋白质低吸附管，2.0 mLEppendorf30108132
硅基镀金悬臂梁Anasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM 样品圆盘 12 mmAGAR ScientificAGF7001

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