本方案旨在演示如何将DNA/DOTAP混合物显微注射到一天龄Xenopus laevis胚胎的眼芽中，以及如何对完整、活体的Xenopus蝌蚪中表达绿色荧光蛋白（GFP）的视神经轴突在视顶盖中脑区域进行成像与单根轴突结构重建。
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摘要
摘要
水生蛙类Xenopus laevis的蝌蚪视觉投射系统是研究调控神经元连接发育机制的理想模型。在视网膜-视顶盖投射建立过程中，视神经轴突从眼睛延伸，并穿过大脑的不同区域，最终到达其靶组织——视顶盖。当视轴突进入视顶盖后，会形成终末分支，以增加其与视顶盖内靶向中间神经元之间形成的突触连接数量。本文介绍一种在Xenopus胚胎的视神经元（视网膜神经节细胞）中表达绿色荧光蛋白（GFP）编码DNA以及基因功能获得性和功能缺失性构建体的方法。我们阐述了如何将DNA与脂质体转染试剂的混合物显微注射至一天龄胚胎的眼芽中，从而使外源基因在单个或少量视神经元中表达。通过将目标基因与GFP标记或共注射GFP质粒，可在数天后直接在完整、活体的Xenopus蝌蚪脑内成像分子信号通路发生改变的单个视神经元的轴突终末分支，并可对其形态进行定量分析。该实验方案可用于确定体内视轴突分支发育过程中细胞自主性分子机制。
引言
在神经系统发育过程中，突触前神经元的轴突穿过大脑的不同区域，以到达其靶向区域。当轴突侵入靶组织时，会与突触后靶神经元建立突触连接。在多种类型的神经元中，轴突通过形成复杂的终末分支网络或树突状结构，增加其可形成的突触连接数量和空间范围1。非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪的视网膜-顶盖投射是研究终末轴突分支化及突触连接机制的一个强有力的脊椎动物模型2,3,4。在完整、活体的Xenopus蝌蚪中，可直接观察表达GFP的单个视轴突树突结构，包括分子信号正常或发生改变的情况5,6,7,8。为了在少量视神经元中单独表达GFP，或与全长或截短形式的基因共同表达，我们采用一种技术，即将DNA微量注射/脂质体转染至出生一天的Xenopus胚胎的眼芽中9,10。该技术最初开发用于研究幼年Xenopus蝌蚪视轴突导向的机制，此后已被我们及其他研究者应用于揭示Xenopus蝌蚪视轴突分支化过程中细胞自主性的分子机制5,6,7,8,9,10。
在其他模式物种以及X. laevis中，已开发出多种替代技术用于在少量视神经元中表达外源基因。然而，与将DNA/脂质体转染试剂显微注射至Xenopus胚胎眼芽的方法相比，这些方法各自均存在挑战和局限性。在小鼠中，可利用转基因技术在少量视神经元中表达基因，但转基因小鼠的制备成本高且耗时较长，且常伴随不良副作用11。通过将质粒注射到早期卵裂期胚胎中，也可建立在视神经元中表达外源基因的转基因斑马鱼模型12。然而，该方法需要克隆特定启动子，以在斑马鱼幼体的视神经元中实现嵌合式基因表达12。此外，转基因斑马鱼视神经元中外源DNA的表达频率相对较低（<30%），而显微注射DNA/脂质体试剂的Xenopus蝌蚪中该频率为30−60%12。在鸡胚中，体内电穿孔技术也被用于在少量视神经元中表达基因13。然而，由于无法在完整、活体的鸡胚中成像视轴突的分支结构，该方法未能充分解析建立视觉投射的机制。最后，已有多个实验室采用电穿孔技术将基因转染至Xenopus蝌蚪的少量视神经元中14,15。但电穿孔需要对设备和实验方案（刺激器、电极、电脉冲的时空模式等）进行额外优化，其复杂程度高于向Xenopus胚胎眼芽显微注射DNA/脂质体转染试剂的操作。
我们及其他研究者此前曾采用显微注射/脂质体转染技术将DNA注入眼芽 非洲爪蟾 胚胎以确定建立视轴突分支的细胞自主性信号机制5,6,7,8我们最初采用该方法来解析钙黏蛋白和Wnt衔接蛋白β-catenin在视神经轴突分支中的功能 非洲爪蟾 蝌蚪5,6. 在一项研究中，我们发现β-catenin分别与α-catenin和PDZ结合，对于在体内启动和塑造视神经轴突树突具有必要性5在第二篇报告中，我们证明了α-连环蛋白和GSK-3β的β-连环蛋白结合结构域对腹侧视神经轴突树突的投射模式具有相反的调节作用6。最近，我们发现Wnt因子腺瘤性息肉病蛋白（APC）在调控视神经轴突树突形态特征中具有作用 非洲爪蟾 蝌蚪7通过在单个视神经元中共同表达调控β-catenin稳定性和微管组织的APC的N端和中央结构域以及GFP，我们确定了这些APC相互作用结构域在活体视轴突分支的分支数量、长度和角度方面的共有和不同作用7另一个实验室利用显微注射/脂质体转染技术，研究了BDNF受体TrkB在视神经轴突分支中信号传导的细胞自主性作用 非洲爪蟾 蝌蚪8该研究小组发现，在体内表达显性失活型 TrkB 会干扰单个视神经轴突树突的分支及突触成熟过程8总体而言，脂质体转染技术在 非洲爪蟾 已在原生环境中阐明了不同基因在视神经轴突分支中的特定作用。
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方案
本文所述所有方法均已获得美国图罗大学加州分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（方案编号 # TUCA003TE01X）。
1. 获取X. laevis 胚胎
- 获取 X. laevis 通过人绒毛膜促性腺激素（HCG）处理的成年雌雄青蛙自然交配获得胚胎，通过HCG处理的成年雌性青蛙体外排卵后进行体外受精获得胚胎，或通过直接订购获得胚胎材料清单).
- 使用2%半胱氨酸溶液在室温下对胚胎进行脱胶处理（见材料表）16.
- 在大型培养皿中收集50−100个胚胎。通过倾倒或使用塑料移液管去除胚胎所处的溶液。加入25 mL 2%半胱氨酸溶液（0.5 g半胱氨酸溶于25 mL ddH₂O）2O，将pH调至8.0）加入含有胚胎的培养皿中。
- 轻轻晃动含有胚胎的培养皿，使其在半胱氨酸溶液中缓慢旋转，直至胚胎的胶状外层脱落，胚胎聚集于培养皿中央（5−10 分钟）。此时，缓慢而轻柔地将半胱氨酸溶液倒入废液杯中。注意避免将过多胚胎随溶液倒出。
- 在培养皿中用10%改良Mark’s Ringer溶液（MMR）或其他合适溶液（如改良Barth溶液，MBS）冲洗胚胎6次，每次更换溶液后轻轻旋转培养皿。
- 在10% MMR中培养胚胎，直至其发育至22−24期17. 非洲爪蟾 胚胎可在15−之间的温度下孵育25 °C胚胎的发育速度取决于其孵化时的温度17.
注意： 非洲爪蟾 从目录订购的胚胎通常在发育阶段20−24到达实验室，因此可立即进行去胶膜和显微注射。
2. 准备DNA质粒并制备DNA/DOTAP混合物
- 将DNA表达载体亚克隆至Xenopus表达载体pCS2+、pCS2+MT或其衍生载体中（最初由D. Turner和R. Rupp构建）5,6,7。pCS2+载体包含经修饰的巨细胞病毒（CMV）启动子，可在青蛙中促进基因表达。
- 使用质粒小提试剂盒（材料表）按照标准操作程序扩增含有GFP和/或目的基因的pCS2质粒。在质粒小提纯化方案的最后洗脱步骤中，将DNA依次洗脱至ddH2O中，以获得最终浓度 >1 µg/µL。
- 将所有pCS2质粒保存于-80 °C，待进行显微注射或脂转染实验时使用，即胚胎发育至22–24期时。
- 将用于脂转染的DNA质粒在室温下解冻。在脂转染前立即短暂离心DNA质粒，以防止DNA/DOTAP混合物中形成沉淀，避免堵塞微毛细移液管的尖端。
- 按照1:3（w/v）的比例将DNA质粒与DOTAP脂质体转染试剂（材料表）混合9,10。例如，将2 µg DNA转移至1.5 mL微量离心管中，加入6 µL DOTAP；或将3 µg DNA转移至微量离心管中，加入9 µL DOTAP。
- DNA与DOTAP混合后，轻轻弹击微量离心管以混匀溶液。混合后，DNA/DOTAP溶液应略显浑浊。
- 若需在视神经元中共转染两个质粒（例如，pCS2-GFP与另一个含有基因截短型或全长形式的pCS2质粒），应先将两个质粒（分别短暂离心后）按1:1比例混合，再按1:3（w/v）比例加入DOTAP。例如，将1 µg pCS2-GFP与1 µg另一pCS2质粒混合，然后加入6 µL DOTAP。
注意：研究表明，在胚胎发育的这些阶段，将两个质粒脂转染至Xenopus胚胎的眼芽中，可在单个视神经元中实现其共表达9,10。
3. 用 DNA/DOTAP 装载显微注射针
- 使用精细镊子（材料表）轻轻夹断拉制的玻璃微量毛细移液管尖端。
- 使用微填充器将矿物油注入已夹断尖端的玻璃微量毛细移液管中，使微量矿物油在毛细管尖端形成一小滴。将毛细移液管约一半体积填充矿物油。
- 将已装入矿物油的玻璃微量毛细移液管装入与显微注射仪相连的合适注射持针器中。若使用显微注射仪（材料表），在安装毛细管前先将活塞推出至一半位置。一旦毛细移液管牢固安装到注射仪上，将活塞完全推出，以确认毛细管已稳固连接，且在活塞伸出时不会发生移动。
- 将3 μL DNA/DOTAP混合液滴加到一块裁剪成方形（1英寸见方）的石蜡纸片上。
- 在体视解剖显微镜下，将玻璃微量毛细移液管的尖端移入DNA/DOTAP液滴中。
- 使用注射装置的填充功能缓慢将DNA/DOTAP液滴吸入玻璃微量毛细移液管中。随着液体进入毛细管，液滴会逐渐缩小。由于DNA/DOTAP溶液具有轻微不透明性，在玻璃微量毛细移液管中应可观察到矿物油与DNA/DOTAP溶液之间的界面（图1）。如有需要，可周期性暂停填充，以使毛细管内压力重新平衡。
图1：微毛细移液管图像。图像显示了注射装置上的微毛细移液管，分别为填充DNA/DOTAP前（A）和填充后（B）。开放箭头：微毛细移液管中活塞尖端的位置（A,B）。闭合箭头：填充后的微毛细移液管中矿物油与DNA/DOTAP之间的界面线（B）。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看此图的放大版本。
4. 对1日龄Xenopus胚胎的眼芽进行DNA/DOTAP显微注射
- 在盛有 0.1x MMR 的 10 mm 培养皿中，使用精细镊子手动去除十个 20−24 期的 Xenopus 胚胎的卵胶膜。用镊子夹住胚胎腰部位置的卵胶膜，以避免损伤胚胎。实验者左右手各持一把镊子，撑破卵胶膜的气泡结构，使胚胎从卵胶膜中释放出来。在去除卵胶膜时需注意不要损伤胚胎。
注意：从 20 期开始，Xenopus 胚胎在前半部与后半部之间会形成一个凹陷或“腰部”结构。该腰部结构可在卵胶膜与胚胎之间形成一个间隙。 - 使用尖端剪开的塑料移液管，将 5−10 个已去卵胶膜的 22−24 期胚胎转移至盛有 1x MMR 的 10 mm 培养皿中。
注意：1x MMR 中较高的盐浓度有助于修复显微注射所造成的穿刺伤口。 - 在体视显微镜下，用双手各持一把镊子夹住培养皿中的去卵胶膜胚胎，并调整胚胎方向，使其前极朝上位于视野中。将胚胎调整为侧卧位，使其一侧的眼芽（左侧或右侧）朝上。
- 在体视显微镜下，用非优势手持镊子固定胚胎，用优势手将玻璃微量移液管的尖端从胚胎腹侧或背侧（根据当前注射的胚胎半侧）插入眼芽，位置位于表皮下方（图 2）。注射 70−210 nL 的 DNA/DOTAP 溶液。可根据注射器设定的单次脉冲体积（通常为 70 nL）分多次完成注射。
注意：注射深度对于视神经元的脂质体转染至关重要。若微毛细管尖端插入位置非常表浅且正确，则显微注射后覆盖眼芽的灰色表皮会出现肿胀。若插入过深，灰色眼芽将无明显变化，且 DNA 在视神经元中的表达频率会降低。 - 将胚胎翻转，对胚胎对侧的眼芽进行相同的显微注射。
- 每次实验对 6−10 个（或更多）胚胎的双侧眼芽进行注射。
- 显微注射后，将胚胎置于含 1x MMR 的培养皿中静置约 30 分钟，以促进伤口愈合。
- 30 分钟后，将注射后的胚胎转移至含 0.001% 脱色剂（苯硫脲）的 0.1x MMR 溶液中，以减少色素沉着。将胚胎在避光条件下培养约五天，直至其发育至 46−47 期的蝌蚪阶段16。
图 2：眼泡区域的界定，用于显微注射。 发育阶段为 22/23 期的 X. laevis 胚胎示意图（A）和显微照片（B）显示了显微注射应靶向的眼泡区域（红色高亮部分）。比例尺 = 1 mm。图 A 已根据 Zahn 等人18 的研究修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
5. 在完整活体蝌蚪中对表达GFP的视神经轴突分支进行成像
注意：当通过脂质体转染法转染了DNA的蝌蚪发育至46−47期时，即可进行成像。
- 成像前必须对蝌蚪进行麻醉。将转染脂质体的蝌蚪转移至含有0.02%三卡因（tricaine）溶液的去离子水（ddH2O）中，置于直径10 mm的培养皿内，静置5−10分钟，直至蝌蚪完全不动。使用体视解剖显微镜观察其心跳，以确认蝌蚪仍存活。
- 将一只已麻醉的蝌蚪放入玻璃载片上的定制硅胶腔室中，并加盖盖玻片密封。应使蝌蚪略微倾斜，使其头部一侧（左侧或右侧）向上倾斜，并刚好轻微接触盖玻片。
- 在低倍镜下观察向上倾斜的蝌蚪中脑视顶盖背侧半区，筛选表达GFP的视轴突树突结构。
注意：可使用配备落射荧光照明系统和复消色差物镜的宽场直立显微镜（材料表）来筛查荧光树突结构。 - 若视顶盖半球内存在1至3个表达GFP的视轴突树突结构，则使用高对比度、长工作距离的40倍空气物镜（材料表）采集这些树突的z轴层扫图像序列。对每个轴突树突结构，以1.5 µm为间隔采集10−20个z轴层面图像。
- 为观察中脑视顶盖另一侧的轴突树突结构，需将蝌蚪重新装入硅胶腔室，使其向另一侧倾斜，并加盖盖玻片密封，然后重复步骤5.3和5.4。
6. 视神经轴突分支形态的重建与定量分析
- 选择包含一至三条表达GFP的视神经轴突分支的图像堆栈。
- 使用图形编辑软件（材料表）中的自由手绘工具，勾勒出每张z切片中可见的各视神经轴突分支部分。通过逐层勾勒每条分支在各z切片中的可见片段，可生成该分支结构精确的二维投影。可使用不同颜色分别勾勒不同的表达GFP的视神经轴突分支。
- 在轴突分支的二维重建图像上进行所有形态计量学测量，必要时可参考原始的z序列图像7。使用Image J软件（材料表），测量诸如分支数量（即分支末端或分支点的数量）、总分支长度、单个分支长度、分支结构的长度与宽度、整体形态特征（长宽比、圆度）以及分支角度等形态学参数7。
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结果
本文所述方案在显微注射的Xenopus胚胎中获得30−60%的成功率，这些胚胎在一条至十条视神经轴突树突中表达GFP（单独表达或与其他DNA构建体共表达）。在图3中，我们展示了来自近期已发表研究7的完整Xenopus蝌蚪中GFP表达的对照组与突变组视神经轴突树突的代表性共聚焦图像。在该研究中，我们将APC的两个结构域突变体（APCNTERM和APCβ-cat）克隆至pCS2质粒中，并将这些质粒与pCS2-GFP标记质粒共同注射至一天龄Xenopus胚胎的眼芽中。图4展示了我们对对照组和APC突变组轴突树突三维重建所进行的多项定量测量结果，包括分支数量、树突总分支长度以及分支的平均长度。
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讨论
本文中，我们演示了如何在单个或少量视神经元中表达外源性DNA构建体，以及如何在完整的活体非洲爪蟾（X. laevis）蝌蚪中对表达GFP的视神经轴突分支进行成像，以研究正常和改变的分子信号通路。我们还解释了如何从活体成像获得的图像中重建并量化表达GFP的视神经轴突分支的形态。为了在少量视神经元中表达外源性DNA质粒，我们采用Christine Holt实验室首创的一种技术，将DNA与脂质转染试剂的混合物微量注射到一天龄Xenopus胚胎的眼泡原基中，该技术最初用于研究幼年蝌蚪的视神经轴突导向9,10,19,20,21。我们及其他研究者也已将这种DNA显微注射/脂质转染技术应用于研究分子机制对较年长、完整活体X. laevis蝌蚪中视神经轴突分支形成过程的调控
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢加州图罗大学骨科医学院对本研究的支持。感谢实验室先前的学生（Esther Wu、Gregory Peng、Taegun Jin、John Lim）在本实验室建立显微注射技术过程中提供的帮助。我们衷心感谢Christine Holt博士，本DNA显微注射/脂质体转染技术即是在其实验室中发展完善的。 非洲爪蟾 胚胎的培养方法首次被建立。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3.5" 微量移液器 | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager 软件（版本 1.4） | Vale 实验室 | www.micro-manager.org | |
| CCD 相机 | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon（人绒毛膜促性腺激素） | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| 半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont 镊子 #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 正置荧光显微镜 | Nikon | 物镜：Nikon Plan Apo 20x/0.75，Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU 图像处理程序（版本 2.10.10） | GIMP | ||
| Illustrator（2017 Creative Cloud） | Adobe | ||
| ImageJ（版本 1.46r） | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| 带通用适配器和支持底座的显微操作仪 | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument | P-30 | |
| 质粒小提试剂盒 | Qiagen | 27104 | |
| 电动 Z 轴载物台 | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II 显微注射仪 | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| PowerPoint（版本 15.31） | Microsoft | ||
| Xenopus laevis 胚胎 | Nasco | LM00490 |
参考文献
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