使用压力肌动描记仪对小鼠生殖系统进行双轴向基础张力与被动测试

摘要

本方案采用市售的压力肌动图系统，对小鼠阴道和宫颈进行压力肌动图检测。通过使用含钙和不含钙的培养基，在模拟生理条件下分别分离出平滑肌细胞（SMC）的基础张力和被动细胞外基质（ECM）对器官的贡献。

摘要

女性生殖器官，特别是阴道和宫颈，由多种细胞成分和独特的细胞外基质（ECM）构成。平滑肌细胞在阴道和宫颈壁内发挥收缩功能。根据生化环境以及器官壁的机械性扩张程度，平滑肌细胞会改变其收缩状态。在基础生理条件下，平滑肌细胞的贡献被归类为基础张力。更具体地说，基础张力是指在无激素和神经刺激的情况下，平滑肌细胞所维持的基础性部分收缩状态。此外，细胞外基质为器官壁提供结构支持，并作为生化信号分子的储存库。这些生化信号对多种器官功能至关重要，例如促进组织生长和维持稳态。每个器官的细胞外基质主要由胶原纤维（主要是I型、III型和V型胶原）、弹性纤维以及糖胺聚糖/蛋白聚糖组成。细胞外基质的组成和结构决定了各器官的力学特性。细胞外基质组成的改变可能导致生殖系统病理状态的发生，例如盆腔器官脱垂或宫颈过早重塑。此外，细胞外基质微观结构和刚度的变化可能改变平滑肌细胞的活性和表型，从而导致收缩力的丧失。

本研究中，所报道的实验方案用于评估4至6月龄非妊娠小鼠在动情期时阴道和宫颈的基底张力及被动力学特性。将器官组织安装于商用压力肌动描记仪中，进行压力-直径和力-长度测试。文中包含了生殖器官力学表征的示例数据及数据分析方法。这些信息可能有助于构建数学模型，并为女性健康相关疾病的治疗干预提供理性设计依据。

引言

阴道壁由四层组成，分别为上皮层、固有层、肌层和外膜。上皮层主要由上皮细胞构成。固有层含有大量弹力纤维和纤维状胶原纤维。肌层也包含弹力蛋白和胶原纤维，但平滑肌细胞的数量有所增加。外膜由弹力蛋白、胶原蛋白和成纤维细胞组成，但其浓度较前几层有所降低。由于平滑肌细胞在器官收缩功能中发挥重要作用，因此它们成为生物力学相关研究团队关注的重点。因此，量化平滑肌细胞的面积分数及其排列方式对于理解其力学功能至关重要。先前的研究表明，阴道壁内的平滑肌成分主要沿环向和纵向轴向排列。组织学分析显示，阴道壁近端和远端区域的平滑肌面积分数均约为35%¹。

宫颈是一种富含胶原的结构，直到最近，人们一直认为其平滑肌细胞含量极少^2,3。然而，近期研究表明，平滑肌细胞在宫颈中可能具有更高的丰度并发挥更重要的作用^4,5。宫颈表现出平滑肌细胞的梯度分布：内口处平滑肌细胞占50–60%，而外口处仅占10%。然而，小鼠研究报道，宫颈由10–15%的平滑肌细胞和85–90%的纤维结缔组织构成，且未提及区域差异^6,7,....

方案

选用处于动情期的初产雌性C57BL6J小鼠（4-6个月龄，体重29.4 ± 6.8克）进行本研究。所有实验程序均经杜兰大学机构动物护理和使用委员会批准。小鼠在分娩后适应环境一周，随后实施安乐死，饲养条件为标准环境（12小时光照/12小时黑暗循环）。

1. 在动情期处死小鼠

1. 确定动情周期：根据以往研究，通过肉眼观察来监测动情周期^15,33,34。动情周期包括四个阶段：动情前期、动情期、动情后期和动情间期。在动情前期，外生殖器肿胀、呈粉红色、湿润且有皱褶。动情期时，外生殖器仍有皱褶，但肿胀程度减轻，颜色较粉且湿润度降低。动情后期和动情间期均表现为无肿胀和皱褶，缺乏粉红色调，且干燥^34,35。
2. 在动情期进行实验：所有机械测试均在小鼠处于动情期时进行，因为此阶段最容易识别，并能提供一致且可重复的实验时间点。
3. 对于接受基础张力测试的小鼠，采用断头法处死；对于仅在被动条件下测试的小鼠，采用二氧化碳（CO₂）吸入法处死。使用断头法有助于保持生殖道平滑肌细胞的功能，因为CO₂气体会影响....

结果

成功分析女性生殖器官的力学特性取决于适当的器官解剖、插管和测试。必须将子宫角完整地剥离至阴道，且不能有任何缺损图1）。根据器官类型的不同，导管的尺寸也会有所变化（图2). 插管操作必须确保器官在实验过程中不会移动，同时在操作过程中不能损伤器官壁（图3）。任一步骤失败都将导致血管无法承受压力。为了获得一致且可重复的结果，测试流程的标准化对本方案的成功至关重要。

器官正确解剖并插管后，启动压力肌动图系统。压力肌动图系统的装置包括控制器单元、流量计和载物台（图4）。该系统用于在器官进行力学测试时监测其多个方面（图5）。使用超声系统或等效设备测量器官在无载荷状态下有无基础张力时的厚度（图6）。力学测试完成后，可计算周向和轴向的切线模量（表2）。

基础张力测试和平行被动.......

讨论

本文提供的实验方案介绍了一种测定小鼠阴道和宫颈机械性能的方法。本方案所分析的机械性能包括器官在被动状态和基础张力状态下的表现。通过改变器官所处的生化环境，可诱导出被动状态与基础张力状态。在本方案中，用于基础张力测试的培养液含有钙离子。对基础张力状态进行测试，可分离出女性生殖器官中平滑肌细胞对机械性能的贡献^54,55。在进行被动机械测试时，培养液中不含钙离子。缺乏钙离子会抑制平滑肌细胞的收缩，从而有助于揭示其他细胞外基质（ECM）成分（如胶原纤维和弹性纤维）的作用，这些成分主要决定了组织的被动机械性能。结合生化分析与组织学分析，这些结果有助于阐明细胞外基质微观结构组成与机械功能之间的关系，进而揭示与女性生殖健康相关疾病的结构与机械机制。

此前，阴道和宫颈的测试主要采用单轴拉伸方法^27,28。然而，阴道和宫颈具有各向异性的特性，并在体内承受多轴方向的力学.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2F 导管	Millar	SPR-320	用于测量宫颈压力的导管
6-0 缝合线	精细科学工具	18020-60	较大的缝合线结
CaCl2（无水）	VWR	97062-590	HBSS 浓度：140 mg/mL
CaCl₂·2H₂O	Fischer Chemical	BDH9224-1KG	KRB 浓度：3.68 g/L
葡萄糖（D-葡萄糖）	VWR	101172-434	HBSS 浓度：1000 毫克/毫升 KRB 浓度：19.8 g/L
Dumont #5/45 镊子	Fine Science Tools	11251-35	弯头镊
杜蒙特 SS 镊子	精细科学工具	11203-25	直头镊子
Eclipse	尼康	E200	用于成像的显微镜
流量计	Danish MyoTechnologies	161FM	测试装置内的流量计
力传感器 - 110P	Danish MyoTechnologies	100079	力传感器
ImageJ	SciJava	ImageJ1	用于测量体积
仪器箱	Fine Science Tools	20830-00	用于存放解剖工具的外壳
KCl	Fisher Chemical	97061-566	HBSS 浓度：400 mg/mL KRB 浓度：3.5 g/L
KH2PO4	G-Biosciences	71003-454	HBSS 浓度：60 mg/mL
MgCl2	VWR	97064-150	KRB 浓度：1.14 g/L
MgCl2-6H2O	VWR	BDH9244-500G	HBSS 浓度：100 mg/mL
MgSO₄·7H₂O	VWR	97062-134	HBSS 浓度：48 mg/mL
Microsoft Excel	微软	6278402	用于电子表格的程序
Na2HPO4（无水二碱）	VWR	97061-588	HBSS 浓度：48 mg/mL KRB 浓度：1.44 g/L
NaCl	VWR	97061-274	HBSS 浓度：8000 毫克/毫升 KRB 浓度：70.1 g/L
NaHCO₃	VWR	97062-460	HBSS 浓度：350 mg/mL KRB 浓度：21.0 g/L
压力肌动图系统	Danish MyoTechnologies	110P 和 120CP	压力肌动图系统： 程序，套管装置 和控制器单元
压力传感器	Danish MyoTechnologies	100106	压力传感器
学生杜蒙特#5镊子	Fine Science Tools	91150-20	直头镊子
学生用瓦纳斯弹簧剪	Fine Science Tools	91500-09	显微剪刀
组织染料	Bradley Products	1101-3	测量体内拉伸的链接
超声换能器	FujiFilm Visual Sonics	LZ-550	使用的超声换能器：256 个阵元，中心频率 40 MHz
VEVO2100	FujiFilm Visual Sonics	VS-20035	用于成像的超声
瓦格纳剪刀	精细科学工具	14069-12	较大的剪刀