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方法文章

一种炎症敏感化的晚产前缺氧缺血性脑损伤雪貂模型

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DOI：

10.3791/60131

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2019年11月19日

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1Division of Neonatology, Department of Pediatrics, University of Washington, 2Department of Comparative Medicine, University of Washington

本文内容

摘要

该方法描述了在P17雪貂中建立炎症敏感的缺氧缺血性及高氧性脑损伤，以模拟多种晚期早产儿所经历的持续性炎症与氧化性脑损伤之间的复杂相互作用。

摘要

目前仍需要建立具有临床相关性的围产期感染和缺氧缺血（HI）模型，以测试针对早产所致神经系统后遗症婴儿的治疗干预措施。雪貂是模拟早产儿人脑的理想候选动物，因为它们出生时为平滑脑，出生后则发育为具有脑回的脑结构。雪貂出生时的脑发育水平相当于人类13周的胎儿，而出生后第17天（P17）的幼崽则被认为相当于妊娠32至36周的婴儿。本文描述了一种P17雪貂的脑损伤模型，先给予脂多糖（lipopolysaccharide）处理，随后诱导双侧脑缺血、缺氧和高氧暴露。该模型模拟了多种发生脑损伤的新生儿所经历的长期炎症、缺血、缺氧和氧化应激之间的复杂相互作用。受损动物表现出不同程度的宏观损伤严重性，脑部出现多种形态学改变，包括多个大脑皮层脑回及其相应脑沟的变窄。受损动物还表现出反射发育迟缓、在自动化步道测试中行走速度更慢且变异性更大，以及在开放旷场实验中探索行为减少。该模型为测试针对与炎症和缺氧缺血相关的新生儿脑病婴儿的潜在疗法、研究影响皮层发育的损伤机制，以及探索未受损动物中具有保护作用的通路提供了平台。

引言

目前仍需要能够反映早产和围产期缺氧-缺血病理生理学的大动物模型，以用于测试针对婴儿的治疗干预措施。2017年，在美国出生的382,726名婴儿中，有9.93%为早产儿，其中84%的早产儿出生孕周在32至36周之间1。在早产儿中，围产期暴露于感染或炎症的情况较为常见，母体因病毒或细菌病原体引发的免疫激活可诱发早产。出生后，早产儿发生早发性或晚发性败血症的风险较高2。此外，由于早产儿心肺系统发育不成熟、出生后环境氧张力相对于宫内显著升高以及医源性因素暴露，他们还常经历缺氧、低血压和高氧血症。同时，早产儿的抗氧化防御系统尚未发育成熟3，促凋亡因子则自然上调4。氧化应激和细胞死亡可导致免疫系统激活及神经炎症。这些因素共同作用，被认为会导致大脑在发育和生理上的易损性，进而引发或加重与早产儿不良发育结局相关的脑病5,6,7。

由于雪貂大脑在结构和发育方面与人类大脑具有相似性，因此雪貂是模拟脑损伤的理想物种8,9,10,11,12。雪貂也是模拟早产人类大脑的理想模型，因为它们出生时为平滑脑（无脑回），并在出生后发育出具有脑回的脑结构，这一发育窗口使得研究人员能够对发育中的大脑施加损伤，以模拟早产儿所经历的病理过程。出生时，雪貂的大脑发育水平相当于人类13周的胎儿，出生后第17天（P17）的幼崽则被认为相当于妊娠32–36周的婴儿13。

我们课题组近期发表了一种在P10雪貂中建立极早产（<28周孕龄）脑损伤的模型，该模型通过大肠杆菌脂多糖（Escherichia coli lipopolysaccharide, LPS）诱导炎症致敏，随后暴露于低氧和高氧环境12。在本实验方案中，我们描述了一种在P17雪貂中建立晚期早产脑损伤模型的方法，即在LPS致敏后实施双侧脑缺血、低氧和高氧处理。该方法在部分动物中可导致更严重的脑损伤，更接近于临床上部分发生脑损伤的早产儿所经历的持续性炎症、缺血、低氧和氧化应激之间复杂的相互作用过程。

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方案

实验操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的规定，并作为华盛顿大学机构动物护理与使用委员会批准方案的一部分进行。

1. 准备与LPS给药

注意：有关实验步骤的时间线，请参见图1。

  1. 开始操作前，密封、灭菌并高压灭菌所有外科器械和手术巾。在无菌小瓶中准备术前用药。计算所需的流速，以便在8–10分钟内用实验气体完全置换缺氧/高氧舱内的空气。
  2. 将脂多糖（来自E. coli 055:B5的LPS）用无菌生理盐水配制成1 mg/mL的浓度。将P17雪貂幼崽从母貂中取出，称重并编号。根据窝别和性别将动物随机分配至对照组或损伤组（或治疗组）。
  3. 使用300 µL胰岛素注射器，向损伤组幼崽腹腔注射3 mg/kg的LPS，对照组动物则注射等体积的无菌生理盐水载体（3 µL/g）。
  4. 将动物置于水浴中的密闭舱内，水浴温度维持在37–40 °C，以确保在整个手术过程中动物直肠温度保持在36–37 °C的目标范围内。

2. 麻醉

  1. 在操作过程中，持续监测动物的体温、呼吸频率和心率。
  2. 术前30分钟，皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）。使用3%异氟烷与100%氧气混合气体诱导麻醉。将动物从诱导舱中取出，仰卧置于设定为37 °C的无菌手术加热毯上。通过鼻罩维持麻醉，并将异氟烷浓度降低至2–3%。

3. 手术准备

  1. 使用小型动物电推剪去除颈部腹侧区域的所有毛发。以矩形方式剃毛，注意避免划伤皮肤或引起剃刀性皮炎。在剃毛区域通过皮内注射利多卡因（4 mg/kg）和布比卡因（2.5 mg/kg）实施局部麻醉。
  2. 使用无菌棉签交替涂抹聚维酮碘和70%乙醇进行颈部消毒。重复擦洗过程，使聚维酮碘和70%乙醇各自交替使用3次。
  3. 通过检测脚趾夹捏反射是否消失来确认麻醉深度。维持异氟烷浓度在达到外科麻醉平面所需的最低百分比。使用仅暴露颈部区域的无菌一次性开孔洞巾，对动物进行铺巾。

4. 双侧颈动脉结扎

  1. 使用一次性#11手术刀片，在颈部中央做一条1.5 cm的正中切口。利用精细止血钳和弯头镊子钝性分离至左侧颈总动脉，将该动脉从伴行的神经血管束中仔细游离出来。
  2. 用一对弯头精细镊子，将一段10 cm长的无菌5-0丝线从动脉下方穿过并形成环状。将丝线剪成两段，分别牢固结扎，两结之间至少保留2 mm间距，以结扎动脉。在两结之间横断左侧颈总动脉，注意保留神经完整。
  3. 在右侧重复上述解剖操作。使用一根无菌1/8英寸脐带夹线对右侧颈总动脉进行可逆性结扎。用外科皮夹关闭切口。
  4. 将动物置于温度可控的水浴中恢复至少30分钟，然后再进行低氧处理。
    注意：若动脉未完全从神经血管束中分离，可能在后续低氧前或期间出现死亡率升高。

5. 顺序性低氧、高氧与低氧

  1. 在低氧和高氧期间，根据需要调节水浴温度，以维持哨兵动物在低氧期间的直肠温度为 37 °C。
  2. 将损伤组动物放入置于水浴中的密闭舱室内。持续监测舱室内的氧气浓度以及至少一只哨兵动物的直肠温度。用加湿的 9% 氧气（91% 氮气）冲洗舱室，然后根据舱室大小维持 3–5 L/min 的流速。当舱室内氧气浓度达到 9% 后，持续 30 分钟。
  3. 30 分钟后，切换气源为 80% 加湿氧气（20% 氮气），并根据流速和舱室大小使舱室达到目标浓度。继续维持 30 分钟高氧状态。打开舱室，使其通过与室内空气平衡而更快地恢复至常氧状态。
  4. 密封舱室，并用 9% 加湿氧气进行冲洗。持续目视监测所有动物，注意观察是否出现呼吸过缓的动物。当舱室内氧气浓度达到 9% 后，继续维持 30 分钟。若在 30 分钟结束前任何动物出现低氧期间死亡（呼吸停止），应立即终止低氧处理。

6. 解除右侧颈动脉结扎

  1. 将动物送回手术区域，使用3%异氟烷与100%氧气混合气体诱导麻醉。通过鼻罩给予麻醉气体，并将异氟烷浓度降至2–3%。拆除手术伤口夹，用聚维碘酮碘对伤口区域重新进行消毒。通过夹捏脚趾无反应确认麻醉深度。维持异氟烷浓度在能够达到手术麻醉平面所需的最低水平。使用无菌一次性开孔洞巾，暴露颈部区域，覆盖动物身体。
  2. 使用弯头镊子识别并松解颈总动脉右侧的脐带结扎线。用外科皮夹关闭切口。

7. 恢复与体温管理

  1. 将所有仔兔放回母兔身边60分钟，以进行哺乳和恢复。60分钟后，将受伤的动物重新放入37–40 °C的水浴中持续6小时，根据需要调节水温，以维持直肠温度在36–37 °C。之后再次将仔兔放回母兔身边。
  2. 术后10–14天（P27–P31）拆除手术夹。

8. 反射测试

  1. 从出生后第21天至第28天（P21–P28）每天进行所有反射测试，从第28天至第42天（P28–P42）每周至少进行3次，测试过程中需对暴露（或处理）分组保持盲法。在进行反射测试前，将幼崽置于带有加热装置的环境中（如37 °C水浴、加热垫等）1小时。每次测试时，需完成每只幼崽的所有试验后，再开始下一只幼崽的测试。
  2. 负向趋地性（25°）
    1. 将一块平板（16½英寸×12英寸）包裹吸水性实验台保护垫，靠在物体上，使平板与桌面形成25°倾角。将一只幼崽以俯卧姿势、面朝下坡方向放置在平板上，位置约为平板长度的75%处。
    2. 确保幼崽身体伸直，四肢均紧贴平板后再释放。幼崽放置后立即开始计时评估。
    3. 记录幼崽身体相对于起始位置旋转90°所需的时间。记录幼崽身体旋转180°并朝向板顶迈出完整一步的时间。在25°倾斜角度下完成3次试验后，再进行下一项测试。
  3. 负向趋地性（45°）
    1. 重复进行3次上述负向趋地性测试，此次将平板调整为45°倾角。
  4. 悬崖回避
    1. 在实验台边缘下方约1英尺处放置一个带缓冲垫的平台，以尽量减少幼崽跌落时的伤害。
    2. 将一只幼崽面朝实验台边缘、身体与边缘垂直放置。确保幼崽身体伸直，前肢与台面边缘齐平。从放置幼崽的瞬间开始计时。注意区分幼崽有意识地远离悬崖的运动与其他不涉及协调行走的自发性动作。
    3. 记录幼崽身体远离边缘的时间（定义为幼崽后退、转身或将前肢移离边缘）。记录幼崽完成朝远离边缘方向迈出第一步的时间（定义为相对于起始时面朝边缘的方向旋转超过90°后的任意方向移动）。
    4. 每只幼崽完成3次悬崖回避试验后，再进行下一项测试。
  5. 翻正反射
    1. 将幼崽仰卧放置在实验台上，轻轻固定其在此位置，然后释放并同时启动秒表。记录幼崽四肢同时平稳接触实验台并承重至静止状态的时间。记录幼崽向任意方向迈出完整一步的时间（定义为四肢均着地并实现某一方向上的前进，无身体旋转或拖拽）。
    2. 每只动物进行5次翻正反射试验。
    3. 所有幼崽完成5次翻正反射试验后，将整窝幼崽归还母鼠。

9. Catwalk 测试

  1. 在出生后第42天（P42），将幼崽从母貂身上取出。在测试前约10分钟将幼崽放入塑料笼中，使其适应环境。关闭测试室的灯光，以确保环境光不会影响CatWalk系统的正常功能。
  2. 在相关软件中创建新实验。调整实验参数，使单次运行最长时间不超过10.00秒，最短时间不少于1.50秒。将最大速度变化率设置为不超过60%。为每只动物设定至少获得三次有效运行数据的最低要求。
  3. 根据动物体型调整步道宽度，使其能够自由行走而不触碰侧壁，同时保持足够狭窄以防止动物转身。在检测设置配置文件选项卡中使用自动检测功能添加新的检测设置。同一日龄的所有窝别和动物均使用相同的检测设置。
  4. 每次测试前后，均需使用低绒纸巾和70%乙醇彻底清洁步道。定期清洁雪貂的足底，以提高足印检测与分类的准确性。待步道和动物准备就绪后，开始采集试验数据。
  5. 若玻璃表面足印积累过多，或动物排尿、排粪，应暂停采集并清洁CatWalk系统。当CatWalk软件根据预设的实验参数识别出三次有效运行后，停止数据采集。

10. 开放旷场测试（P42）

  1. 使用一个非多孔的亚克力箱（55 cm × 55 cm × 40 cm 高），内壁涂成哑光白色。将摄像头置于箱子正上方中央位置，确保能完整捕捉四面箱壁。在首次使用前及每次测试不同动物之间，用70%乙醇清洁测试区域。
  2. 在相应软件中，选择 从模板新建 并 应用预定义模板。依次选择以下设置以继续配置：受试对象类型：其他；测试区域模板：开放场，方形；区域模板：中心、边缘、角落；追踪特征：中心点。
  3. 打开 区域设置，从摄像头输入中获取背景图像，确保箱体四壁的顶部可见。使用标尺工具校准测试区域的尺寸。
  4. 通过调整轮廓大小，修改预定义的区域划分，使其匹配墙壁区域（西北、东北、西南、东南）和地面区域（左上、中上、右上、左中、中心、右中、左下、中下、右下）。验证设置，确保各区域之间无重叠。
  5. 打开 采集窗口，点击 开始采集。将雪貂放置于测试区域中心，并确保每次实验对象的朝向保持一致。让雪貂在区域内自由活动5分钟。测试结束后，点击 停止采集。随后对下一只雪貂重复该流程。
    注意： 实验过程中，所有实验人员应处于雪貂无法察觉的位置，并保持安静。

11. 固定灌注

  1. 在出生后第42天（P42），使用5%异氟烷对幼鼠进行深度麻醉，并腹腔注射过量戊巴比妥钠（120–150 mg/kg）。通过脚趾夹捏无反应及呼吸运动消失确认深度麻醉状态。
  2. 将动物转移至通风橱中，打开胸腔，使用精细止血钳夹闭降主动脉，剪开右心房。利用灌注泵以30 mL/min的速度经左心室灌注60 mL无菌生理盐水，随后以相同速度灌注60 mL福尔马林（10%甲醛）。
  3. 剪下尸体头部，使用剪刀、镊子、咬骨钳和刮匙从颅骨中取出脑组织。对每只脑组织的背侧、腹侧和侧面进行高分辨率拍照。将脑组织在福尔马林中后固定至少48小时。

12. 离体脑组织测量

  1. 将脑组织从福尔马林中取出（步骤 11.3），置于纸巾上以吸去多余液体。
  2. 使用电子卡尺测量脑的高度，将卡尺的两个尖端分别置于脑的背侧和腹侧表面；测量脑的长度，将卡尺的两个尖端分别置于嗅球和枕叶最尾端的边界；测量脑的宽度，将卡尺的两个尖端分别置于颞叶最外侧的部分。称量脑的重量。
  3. 测量纵裂（冠状沟前后部分）、外侧裂、脑上外侧裂、冠状沟、假外侧裂、钩状沟、冠状沟、前外侧裂、外侧回、脑上外侧回、乙状回（前后部分）、冠状回、外侧外侧回（前后部分）以及眶回。所有沟的测量均从相应沟最明显部分的起始点至终点进行；所有回的测量均从相应回最宽处进行。
  4. 测量小脑暴露的范围：将卡尺的一个尖端置于纵裂最尾端的点，另一个尖端置于小脑最尾端的部分。
    注意： 离体雪貂脑部测量方法的建立参考了《雪貂的生物学与疾病》（Biology and Diseases of the Ferret）14 中提供的雪貂脑图谱。

13. 大体损伤评分

  1. 根据步骤 11.3 中拍摄的照片，采用步骤 13.2–13.4 中的评分标准评估脑组织大体损伤（0–9 分制），同时保持对暴露（或处理）分组的盲法状态。
  2. 评估纵裂。若其外观正常，记为 0 分。若其轻度增宽（约正常宽度的 2 倍），但增宽未沿纵裂全长持续存在，记为 1 分。若其中度增宽（约正常宽度的 2–3 倍），记为 2 分。若其显著增宽，在纵裂大部分长度上可见明显间隙，宽度 >3 倍于正常，记为 3 分。
  3. 评估外侧沟。若其轮廓清晰，外侧回与大脑外侧回之间界限分明，记为 0 分。若单侧或双侧外侧沟轮廓轻度模糊，尤其在尾部区域，且额叶和颞叶相对于枕叶轻微变窄，记为 1 分。
    1. 若外侧沟轮廓中度模糊，伴大脑外侧回下陷，冠状回与外侧沟回变窄，且额叶和颞叶相对于枕叶轻度变窄，记为 2 分。若出现单侧囊性变性，对侧半球改变轻微，记为 3 分。若外侧沟轮廓不清，伴双侧枕叶和颞叶囊性或严重变性，记为 4 分。
  4. 评估小脑可见部分。若其外观正常，且可见的蚓部 <75%，半球 <66%，记为 0 分。若可见蚓部占 75–90%，半球 ≥66%，记为 1 分。若小脑大部分可见，包括全部蚓部及 ≥66% 的半球，记为 2 分。

14. 数据分析

  1. 对于反射测试数据，将失败结果记为61秒，以便在时间终点（60秒）与成功结果进行比较，同时在统计分析中获得较低的排序。针对每只动物在各项反射测试中的时间过程，计算曲线下面积。
  2. 根据动物体重对涉及足印压力大小的CatWalk数据进行校正。
  3. 采用非参数统计方法分析数据，使用中位数和四分位距（IQR）描述数据。

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结果

在来自六窝接受损伤处理的34只动物（n = 18只雄性，n = 16只雌性）中，损伤组有8只动物（24%；n = 4只雄性，n = 4只雌性）在第二次缺氧期（n = 5）、体温管理期间（n = 2）或损伤后过夜期间（n = 1）死亡。在损伤组中，26只存活动物中有9只（35%）出现可见的大体损伤。其中5只动物（n = 5只雄性）表现为中度损伤，4只动物（n = 2只雄性，n = 2只雌性）表现为重度损伤，分别定义为大体病理学评分为2–5分和6–9分（图2A）。因此，接受损伤处理的动物出现死亡或显著大体损伤的风险为50%。随着损伤程度加重，可见颞叶和/或枕叶脑回变窄，伴随脑沟缩短、大脑纵裂增宽，以及在损伤最严重的动物中出现大范围囊性组织缺失（图2B）。在存活的损伤动物中（n = 26；n = 14只雄性，n = 12只雌性），小脑暴露面积显著增大（图3A），同时...

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讨论

由于雪貂大脑与人类大脑在结构和发育上具有相似性，雪貂正越来越多地被用于建立成年及发育期脑损伤的动物模型8,9,10,11,12。然而，迄今为止的研究表明，雪貂大脑对初始损伤具有较强的耐受性，且具备高度可塑性，即使存在明显的病理损伤，其行为缺陷也会随时间推移而逐渐减轻10,12。本文中，我们描述了首例针对接近早产儿发育阶段的雪貂建立的炎症致敏性缺氧缺血（HI）脑损伤模型，该模型可导致显著的双侧脑损伤，并在存活个体中引发持续性的行为功能障碍。与所有临床前模型一样，本研究的目的并非精确复制早产儿在临床环境中所经历的各种暴露因素，而是整合目前认为参与早产儿脑损伤发生的关键机制因素，包括炎症、缺氧和氧化应激<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

该模型的开发由比尔和梅琳达·盖茨基金会以及美国国立卫生研究院资助（资助号：5R21NS093154-02，NICHD）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
80% 氧气Praxair
9% 氧气Praxair
吸水性台面防护垫Kimtech7546
自动步道系统Noldus
聚维酮碘外科洗手液
布比卡因Patterson Veterinary07-888-9382
丁丙诺啡
游标卡尺SRA Measurement ProductsME-CAL-FP-200量程 200 mm，分辨率 0.01 mm
棉质纱布海绵Fisher Scientific22028556
弯头精细止血钳RobozRS-7101
弯头镊子World Precision Instruments501215
弯头缝合打结止血钳RobozRS-7111
Ethovision 跟踪软件Noldus
眼用润滑剂RugbyNDC 0536-1970-72
雪貂（Mustela putorius furo）Marshall Biosciences非近交系（无特定品系）
福尔马林Fisher ScientificSF100-410%（磷酸盐缓冲液/认证）
毛发修剪器ConairGMT175N
胰岛素注射器BD3294610.3 cc 3 mm 31 G
异氟烷Piramal66794-017-25
利多卡因Patterson Veterinary07-808-8202
LPSList BiologicalLPS Ultrapure #423
氧气传感器BW Gas AlertGAXT-X-DL-2
戊巴比妥
塑料舱室Tellfresh196010 L；373 x 270 x 135 mm3
生理盐水溶液，0.9%HospiraRL-4492
手术刀片Integra Miltex297
手术刀柄World Precision Instruments500236#3，13 cm
无菌缝合线Fine Science Tools18020-50编织丝线，5/0
手术夹施加器Fine Science Tools12020-09
手术夹移除器Fine Science Tools12023-00
手术单Medline UnidrapeVET3000
外科手套Ansell Perry Inc5785004
手术夹Fine Science Tools12022-09
体温计（直肠用）YSIPrecision 4000A
水温计Fisher Scientific14-648-26
脐带绳Grafco3031无菌
水浴锅Thermo ScientificTSCOL1919 L

参考文献

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一种炎症敏感化的晚产前缺氧缺血性脑损伤雪貂模型
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