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方法文章

测量自噬和蛋白酶体流的昼夜节律

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DOI：

10.3791/60133

⸱

2019年9月17日

 ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Washington University School of Medicine

本文内容

摘要

我们描述了通过自噬和蛋白酶体在小鼠肝脏中测量蛋白质分解代谢生物节律的实验方案。

摘要

细胞通过溶酶体和非溶酶体途径等多种方式回收不需要的蛋白质和其他物质。主要的依赖溶酶体的途径称为自噬，而蛋白质降解的主要非溶酶体途径则是泛素-蛋白酶体系统。在模式生物中的近期研究表明，自噬和泛素-蛋白酶体系统的活性在一天中并非恒定不变，而是遵循昼夜（生物钟）节律发生波动。能够测量蛋白质 turnover 的生物节律，对于理解细胞质量控制的实现机制以及特定目标蛋白质的动态变化具有重要意义。本文介绍了一种标准化的体内自噬和蛋白酶体 flux 定量检测方案，可捕捉蛋白质 turnover 中的昼夜节律成分。本方案包含小鼠操作、组织处理、组分分离以及利用小鼠肝脏作为起始材料进行自噬 flux 定量的详细步骤。

引言

昼夜节律是指自然界中普遍存在的每日可预测的生物学功能变化。这种节律存在于所有生物尺度上，从睡眠-觉醒周期等宏观行为，到生物分子丰度的节律性波动等分子层面现象。近年来，随着“时钟基因”的发现，昼夜节律研究发生了重大变革，这些基因对昼夜节律的产生至关重要。在时钟基因敲除小鼠中的研究表明，昼夜节律在时间上协调核心细胞过程（如代谢）方面发挥着关键作用1。昼夜节律实现这一调控的方式之一，是为蛋白质的分解代谢赋予时间结构。

包括我们团队在内的多个研究小组已证实，细胞蛋白质分解代谢的两条主要途径——自噬和泛素-蛋白酶体系统——均受昼夜节律调控2,3,4,5。自噬是依赖溶酶体的蛋白质分解途径，目标蛋白质通过形成新的囊泡（大自噬）或通过通道直接转位（分子伴侣介导的自噬）被递送至该降解性细胞器6。泛素-蛋白酶体系统则是主要的非溶酶体途径，蛋白质在此途径中被多聚泛素化，随后进入蛋白酶体——一种存在于细胞质和细胞核中的大分子降解机器7,8。自噬和蛋白酶体活性的节律性变化具有重要意义，因为它们可能在细胞自我维持过程中发挥关键作用。因此，建立一种标准化的实验流程以检测与临床前疾病模型相兼容的蛋白质分解代谢日间振荡，具有重要价值。

本文提供了我们实验室用于定量小鼠肝脏中自噬流昼夜变化的实验方案，该方案已作为我们实验室研究工作的基础3,9。我们的方法属于“周转率检测”（turnover assay）10，这是一种被多个研究团队用于测量蛋白水解活性（或通量）的常用方法。在该方法中，向小鼠注射特异性针对溶酶体或蛋白酶体的蛋白酶抑制剂，经过固定时间间隔后采集组织样本；同时，对接受假注射处理的小鼠平行采集组织样本。将所获组织样本匀浆后，通过生化方法分离出富含溶酶体和细胞质的组分。随后，利用针对巨自噬标志物（LC3b 和 p62）或蛋白酶体底物（多聚泛素化蛋白）的特异性抗体，对这些组分进行平行的蛋白质印迹（western blotting）分析。随着时间推移，注射蛋白酶抑制剂的小鼠体内会积累原本应被降解回收的蛋白质。因此，通过比较蛋白酶抑制剂处理组与假处理组中标志蛋白的丰度差异，可推断出自噬周转速率。通过在一天内以固定时间间隔重复该方法，即可重建蛋白水解过程的昼夜节律变化（图1A）。

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方案

本方案已获得圣路易斯华盛顿大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 小鼠饲养与实验设计

  1. 为检测蛋白质 turnover 的日节律，在标准 12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下饲养的实验小鼠（雄性或雌性 C57BL/6J，4−8 周龄，20−25 g），并提供食物 随意摄取为避免给动物带来应激，实验前应在实验设施中对小鼠进行至少一周的适应性饲养，并避免单笼饲养。为证明蛋白质分解代谢节律确为昼夜节律（即由动物自身的内在生物钟驱动），应将小鼠饲养在持续黑暗条件下，并注意避免使其暴露于外源性光照。
    注意： 有关昼夜节律实验中小鼠饲养的详细信息，请参见以下参考文献11.
  2. 每个时间点分别设置三只小鼠作为假手术对照组，并为每种蛋白酶抑制剂处理组（亮抑酶肽用于自噬流检测，硼替佐米用于蛋白酶体流检测）至少分配三只小鼠。在昼夜周期内均匀安排六个时间点，每隔4小时采集一次组织样本。
    注意： 一项持续24小时、包含6个时间点的实验，需使用磷酸盐缓冲液（PBS）、亮抑酶肽（leupeptin）和硼替佐米（bortezomib）处理，共需54只小鼠（每种处理3只小鼠 × 3种处理 × 6个时间点）。

2. 小鼠肝脏采集用匀浆液、抑制剂储备液及小瓶的制备

  1. 配制新鲜的匀浆缓冲液（HB），并置于冰上：10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、250 mM 蔗糖、5 mM EDTA（pH 8.0），每 100 mL 缓冲液中加入 1 片蛋白酶抑制剂。
    注意：每只小鼠约需 10 mL HB。
  2. 用于生物样本后续处理时，每个样本需准备 1 个 15 mL 圆锥形离心管用于盛装粗匀浆液，1 个 15 mL 离心管用于盛装去核上清液，2 个 1.5 mL 微量离心管分别用于收集 3,000 × g 和 20,000 × g 离心后的沉淀物，以及 1 个 1.5 mL 微量离心管用于保存胞质组分。向每个用于粗匀浆的离心管中加入 7 mL 冷 HB，并置于冰上。
  3. 用无菌 PBS 配制 2 mg/mL 的亮抑蛋白酶肽半硫酸盐储备液。同时用二甲基亚砜（DMSO）配制 50 mg/mL 的硼替佐米溶液。分装后于 -80 °C 保存。

3. 蛋白酶抑制剂给药

  1. 在每个时间点前15分钟，将亮肽素（2 mg/mL）和硼替佐米（50 mg/mL）储存液置于室温下解冻。亮肽素储存液可直接用于注射。将硼替佐米用无菌PBS稀释，配制成50 µg/mL的工作溶液。
    注意： 硼替佐米对光敏感，因此工作液在使用前需避光保存。
  2. 称重小鼠，并分别进行腹腔注射“假处理” PBS（0.5 mL）、亮抑酶肽（leupeptin，40 mg/kg）或硼替佐米（bortezomib，1.6 µg/kg）。将小鼠放回标记适当的笼子中，按所接受注射类型分组。在标准化表格中记录小鼠处理或操作的时间（参见 补充文件 “示例数据”).
    注意： 剂量计算器作为辅助工具包含在内 补充文件“样本数据”注射操作应迅速进行，并在各时间点保持相同的顺序，以尽量减少变异。

4. 组织获取与保存

  1. 注射后两小时，根据机构批准的IACUC方案依次处死小鼠。例如，先麻醉小鼠，然后通过颈椎脱位法处死。处死后立即进行解剖操作。
    注意：通过夹捏前肢足掌无可见反射反应，确认颈椎脱位前小鼠已完全麻醉。
  2. 使用梅岑鲍姆剪刀（Metzenbaum scissors）在小鼠腹侧腹部做1.5至2.0 cm的切口，取出肝脏左叶，并用手术剪将其切除。将肝脏组织样本浸入装有7 mL预冷HB缓冲液的适当标记的15 mL锥形管中。整个处理过程中保持样本置于冰上。
    注意：样本可在冰上或4 °C保存过夜后再继续操作。若仅检测巨自噬和蛋白酶体活性的标准标志物，可将肝脏样本在液氮中速冻后于-80 °C保存以备后续处理。若需分析其他降解靶标（例如通过蛋白质组学方法），则应避免冷冻，直接进行样本处理。
  3. 继续对下一只小鼠实施处死与解剖，直至获取所有样本。按照注射顺序处理同一组内的小鼠，并记录该步骤的持续时间（参见补充文件“Sample Data”）。每只小鼠的处理时间应控制在5分钟以内，以尽量减少注射抑制剂后暴露时间的差异。

5. 肝脏样本的生化分级分离

注意： 图1B 显示了分级分离方案。

  1. 将每个肝脏样本和7 mL HB转移至15 mL容量的Dounce匀浆器中。先用松动活塞匀浆10次，再用紧密活塞匀浆15次。将所得的粗匀浆液转移回其来源的15 mL离心管中。重复此操作，直至所有肝脏样本均完成匀浆。
  2. 在4 °C条件下，以700 × g离心粗匀浆液10分钟，以沉淀细胞核和碎片。将上清液顶部4 mL（即核后上清液，S1）转移至新的15 mL离心管中。
  3. 根据制造商说明书，使用Bradford法或二辛可宁酸 (BCA)法测定组分S1的蛋白浓度。随后，通过向S1中添加新鲜HB，将所有样本的浓度调整至2.1 mg/mL或所需浓度。经标准化处理的样本即为“总蛋白”（Tot）组分。为便于后续分析及提高样品质量，可将500 µL的Tot组分分装后于-80 °C保存。
  4. 取剩余的Tot组分1.5 mL转移至微量离心管中，在4 °C条件下以3,000 × g离心15分钟。将所得上清液1 mL（S2）转移至新的微量离心管中，并置于冰上。
  5. 吸除剩余上清液，用1.5 mL冷HB对3,000 × g沉淀（3KP）清洗两次。若计划进行后续蛋白质组学分析，可将3KP沉淀在-80 °C干燥保存。若仅计划进行Western blot检测，则将3KP沉淀重悬于200 µL十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品缓冲液（材料表）中，并在95 °C煮沸5分钟。
  6. 将S2组分在4 °C条件下以20,000 × g离心20分钟。将所得上清液（S3）转移至新的微量离心管中。S3即为胞质组分（Cyto）。进行SDS-PAGE时，取150 µL Cyto组分与50 µL 4× SDS-PAGE样品缓冲液混合，并在95 °C煮沸5分钟。
  7. 吸除20,000 × g沉淀（20KP）中的剩余上清液，用1.5 mL冷HB清洗两次。若计划进行后续蛋白质组学分析，可将20KP沉淀在-80 °C干燥保存。若仅计划进行Western blot检测，则将20KP沉淀重悬于100 µL SDS-PAGE样品缓冲液中，并在95 °C煮沸5分钟。

6. 蛋白质印迹检测结果

  1. 为了通过蛋白质印迹法量化巨自噬和蛋白酶体通量，用1× SDS-PAGE上样缓冲液配制纯化的GST-LC3b（2 µg/mL）、p62-His6（2 µg/mL）和Lys48连接的多聚泛素（K48-Ub，50 µg/mL）的储存液。在95 °C煮沸5分钟后，分装并储存于-80 °C以备后续使用。
  2. 进行SDS-PAGE时，将标准蛋白混合物用1× SDS-PAGE上样缓冲液按1:3比例进行连续稀释，制备6点标准曲线。将每种标准曲线样品各10 µL上样至26孔4−12% SDS-PAGE中型凝胶，随后加入预染蛋白质标准品（材料表），即商用分子量标准品。
  3. 在检测自噬通量时，将12 µL的3KP样品加入每个泳道。
    注意：假设已进行假手术、硼替佐米和亮抑酶肽处理，且每种处理使用3只小鼠，则每个时间点应包含9个样品。因此，每块中型凝胶可容纳2个时间点的样品以及标准曲线，典型的时程实验共需3块中型凝胶进行检测。
  4. 在检测蛋白酶体通量时，将12 µL的Cyto组分加入每个泳道。
  5. 采用标准方案通过SDS-PAGE分离蛋白质样品，并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。若计划进行LC3b的蛋白质印迹检测，请使用含20%甲醇的转膜缓冲液进行凝胶转膜；否则使用含10%甲醇的转膜缓冲液，以便更高效地转移高分子量蛋白质。
  6. 按照标准方案进行蛋白质印迹。在分析巨自噬通量时，将含有3KP样品的膜与抗p62或抗LC3b抗体（1:1,000）在4 °C孵育过夜；在分析蛋白酶体通量时，将含有Cyto样品的膜与抗Lys48特异性多聚泛素抗体（1:1,000）在4 °C孵育过夜。
  7. 使用标准的二抗和成像设备对蛋白质印迹结果进行成像。应将同一时程实验的所有膜一同成像。

7. 数据分析

注意：参见补充文件“样本数据”。

  1. 对 Western 印迹样品进行密度测定，可使用标准图形软件、Image Studio 或 ImageJ。
  2. 对标准曲线和实验样品中目标条带进行密度测定。以 p62 为例，在 Image Studio 中绘制一个长矩形，覆盖膜底部的蛋白单体并向上延伸至膜顶部。复制、粘贴并移动该矩形至其余样品。定量时应保持各样品间所用矩形的一致性。
  3. 在分析窗口右下角点击 Report 和 Launch Spreadsheet，将定量结果保存至电子表格。
  4. 利用系列稀释的标准样品在电子表格中生成密度测定标准曲线，并采用线性或多项式回归拟合获得最佳标准曲线方程。根据该方程推算实验样品中 p62、LC3b-II 或 Lys48-poly Ub 的含量。
  5. 为获得通量测量值，将每个抑制剂处理样品的推算蛋白量从同一时间点 PBS 样品的平均值中减去（参见 补充文件“Sample Data”）。
  6. 使用单因素方差分析（1-way ANOVA）评估蛋白周转随时间变化的统计学显著性。此分析可通过标准电子表格软件完成。

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结果

代表性数据见图2A,B，这些数据的定量分析结果见图2C,D（另见补充文件“样本数据”）。为简化起见，图2中未展示上样对照，但应平行获取。通常使用抗β-actin的Western印迹作为上样对照，但总蛋白染色（如Ponceau S）亦可满足要求。在任一时间点，自噬流的主要读数为溶酶体富集的3KP组分中，经亮抑酶肽处理组与假处理（sham）组之间大自噬特异性标志物（p62或LC3b-II）含量的差值除以2（蛋白酶抑制剂注射至组织收获之间的时间为2小时）。类似的数据也可从同样富集溶酶体的20KP组分中获得，但根据我们在小鼠肝脏中的经验，大部分信号集中在3KP组分中。通常将结果归一化至均值，以便于不同独立实验之间的比较（图2C,D）。蛋白酶体降解活性的主要读数为细胞质（“

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讨论

本方案介绍了一种利用常规分子生物学设备在小鼠中测量蛋白质 turnover 生物节律的技术上简便的方法。由于时间序列实验周期较长且涉及大量生物样本，因此在整个实验过程中保持小鼠注射方式、组织采集时间以及样本生化处理的一致性至关重要。注射、安乐死和颈椎脱位步骤可能需要操作者在开展大规模实验前进行练习。最好由同一名操作者完成所有组织解剖，因为不同个体的解剖速度存在差异；但如果无法实现，可考虑将蛋白酶抑制剂注射至组织采集之间的时间从2小时延长至3或4小时（前提是所有时间点均保持一致）。

常见的故障排除原因包括生物学重复样本之间通量的变异性以及蛋白质印迹质量不佳。关于样本变异性，其可能源于多名操作者之间解剖速度或经验水平的差异。可通过进行练习实验来缓解此问题，直至平均每只小鼠的解剖时间少于5分钟；或者由单一操作者完成所有解剖操作。蛋白质印迹中出现高背景信号可能由转膜不均、封闭不充分、一抗质量差或洗涤步骤不充分引起。最佳结果可通过以下方法实现：将SDS-PAGE分离的蛋白质样品在含有10−20%甲醇的转移缓冲液中，采用湿转法过夜转移至PVDF膜，使用10%脱脂奶粉进行封闭，并在各步骤之间进行...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 RO1HL135846 和儿童发展研究所资助项目（PD-II-2016-529）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4x SDS PAGE 样品缓冲液InvitrogenCat# NP0008
硼替佐米EMD MilliporeCat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image StudioLICORN/A
Immobilon-FL PVDF 膜，0.45 微米Merck Millipore LtdCat# IPFL00010
K48 连接特异性多聚泛素链抗体 (D9D5) 兔单克隆抗体Cell Signaling TechnologyCat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3aBoston BiochemCat# UL-430
LC3b 抗体NovusCat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b 抗体Cell Signaling TechnologyCat#2775; RRID:AB_915950
亮抑蛋白酶肽SigmaCat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi 蛋白凝胶Thermo Fisher ScientificCat# WG1403BOX
NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4x)Thermo Fisher ScientificCat# NP0007
P62-hisNovusCat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue 预染蛋白标准品Bio-RadCat# 1610373
兔抗 p62/SQSTM1 抗体Millipore-SigmaCat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)Boston BiochemCat# UC-230
SDS-PAGE Midi 尺寸凝胶InvitrogenCat# WG1403
SIGMAFAST 蛋白酶抑制剂片剂Millipore-SigmaCat# S8830

参考文献

  1. Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
  2. Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
  3. Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
  4. Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
  5. Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
  6. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
  7. Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
  8. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
  9. Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
  10. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  11. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping Circadian Rhythms in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).
  12. Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).

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