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小鼠筑巢行为作为行为缺陷的早期指标

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DOI：

10.3791/60139

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2019年10月19日

 ,  ,  , 
1Department of Psychology, Cognitive Behavioral Neuroscience, George Mason University

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于量化小鼠筑巢行为的实验方案，该行为已知在多种神经系统疾病和障碍中会受到损害。本方案评估了四种材料的适用性，并提供了量化评分者间一致性的机会，从而提高该检测方法的有效性和可靠性。

摘要

筑巢是雄性和雌性啮齿类动物的一种先天行为，即使在实验室环境中饲养的个体也具备这种行为。因此，许多研究人员会为啮齿类动物提供合成材料和/或天然材料（如麻绳、纸巾、棉花、纸张和干草），以评估其整体健康状况，并作为预测认知功能可能下降的辅助指标。通常，筑巢行为的改变（例如无法形成正常巢穴）提示动物健康或福利状况发生了变化。此外，筑巢行为对多种环境和生理挑战以及多种与病理疾病状态相关的遗传突变均具有敏感性。以下实验方案描述了一种研究筑巢行为的范式，该范式考察了四种不同类型筑巢材料的使用情况。此外，该方案采用组内相关系数分析表明，当使用碎纸作为筑巢材料时，不同评分者之间的一致性高于使用其他常见筑巢材料（如棉垫、卷纸和软玉米芯垫料）的情况。本实验所选用的方法学及统计学考量（即组内相关系数）对于开展小鼠生活质量评估研究的研究人员可能具有参考价值。 

引言

筑巢是许多动物（如鸟类、鱼类、啮齿类和类人猿）的一种先天行为，因其在研究以幸福感下降和日常生活活动能力受损为特征的神经系统疾病和障碍方面的潜在用途而受到越来越多的关注1。雄性和雌性小鼠均会建造大小相似的巢穴，用于繁殖、保温和庇护；更重要的是，即使在实验室环境中饲养，它们仍会持续表现出这种行为2。Hess、Petrovich 和 Goodwin3认为，诱导筑巢等生物学上适当的行为，关键在于提供生物学上适宜的刺激；然而，已有多种天然和人工材料被用于评估筑巢行为，例如干草、大麻纤维、棉线、纸条、棉制牙科球以及压制成型的棉垫2。筑巢行为的改变（即无法利用所提供的材料筑成巢）通常提示健康状况或福利水平发生了变化。大多数情况下，缺乏筑巢行为可归因于多种对福利产生负面影响的因素。已知可有效降低小鼠筑巢质量的因素包括极端温度、疼痛刺激、诱导性疾病与感染、基因突变，以及内侧视前区、隔区和海马体的脑损伤4,5,6。

阿尔茨海默病是一种进行性神经退行性疾病，其特征是脑组织丧失、细胞外淀粉样β斑块积聚，以及由过度磷酸化的微管相关蛋白tau组成的细胞内神经原纤维缠结7。此外，阿尔茨海默病最显著的特征是学习与记忆功能缺陷，以及日常生活活动能力受损。在小鼠中，日常生活活动能力通常通过昼夜节律跑轮行为进行评估8,9,10,11，尽管一些新的替代方法（如筑巢行为）正变得越来越受欢迎。研究表明，筑巢行为对已被确认为阿尔茨海默病风险因素和/或致病因素的操作（例如基因突变、环境应激）具有敏感性。因此，筑巢行为可作为多种模拟阿尔茨海默病特征的小鼠品系中的一项附加或互补性检测手段。例如，Deacon及其同事12检测了携带瑞典型淀粉样前体蛋白（APPswe）和早老素1（PS1）基因突变的Tg2576小鼠的筑巢行为。群养的Tg2576小鼠在3月龄和12月龄时所建巢穴的质量均显著差于野生型对照组。与这些发现一致，Filali等人13报道，单只饲养的APPswe/PS1雄性小鼠在给予两块5 × 5 cm棉絮后，其筑巢质量在1–5分评分标准上显著较低（1分=棉絮未被触碰，5分=近乎完美的巢）。转基因小鼠在6、9和12月龄时所建巢穴质量始终差于野生型对照小鼠，某些情况下，APPswe/PS1小鼠甚至完全未能利用所提供的棉絮筑巢。

本实验室先前的研究表明，与CRND8和CRND8/E4小鼠相比，野生型C57BL/6J小鼠使用棉垫构建的巢穴显著更完善9。然而，大多数使用压制棉垫的实验结果表现出较大变异性，野生型小鼠未能表现出预期的高评分，而本应表现出极低筑巢能力的转基因小鼠也未达到预期低分2，这可能部分导致估计参数（即均值差异）缺乏差异性和统计学显著性。这种无显著差异的现象可能部分归因于小鼠年龄不足或筑巢时间分配不够。此外，筑巢材料本身可能构成额外变量，由于研究人员在材料种类和用量上的方法学偏好不同，可能导致实验结果变异性增加，甚至与小鼠品系产生交互作用。例如，Robinson-Junker及其同事14向C3H/HeNCrl小鼠和BALB/cAnNCrl小鼠分别提供了经过处理或未经处理、不同尺寸（即小片或大片）的垫料材料，这两种小鼠通常分别被认为是筑巢能力较差和较强的品系。当提供未经处理的垫料时，C3H小鼠构建的巢穴结构较简单，但质量与BALB/c小鼠的巢穴相似。  同样，Martin及其同事15比较了不同筑巢材料对鹿鼠筑巢复杂性的影响，鹿鼠是Mus musculus物种的远亲，具有明显的进化差异（例如更倾向于在树上和灌木下挖掘洞穴，在圈养条件下活动性更强），但其饲养管理方式与普通实验小鼠相似，且会利用任何可获得的柔软纤维材料筑巢16,17,18。  携带幼崽的雌性及繁殖期个体在家中笼舍内构建的巢穴比雄性更复杂，作者认为这些行为差异可能与鹿鼠体内孕酮浓度的变化有关15。更重要的是，小鼠使用棕色纸张构建的巢穴最为复杂，其次是棉垫和棉条，而使用白色纸张和分散的小型棉球构建的巢穴复杂性最低。

尽管筑巢实验的应用日益广泛，但关于其科学有效性、成本效益和时间敏感性方面的考量却鲜有讨论。鉴于上述方法学和经济性方面的挑战，本方案探讨了不同筑巢材料——棉垫、纸条、碎纸和加工过的垫料——在筑巢行为中的应用价值。具体而言，我们将所有这些筑巢材料分别提供给老龄化的C57BL/6J野生型对照小鼠和阿尔茨海默病APOE e4小鼠，以探究基因型与材料之间在筑巢质量上可能存在的交互作用。此外，本实验还旨在评估由不同材料构建的巢穴在评分者之间的可靠性。综合来看，本方案表明，在本研究样本中，碎纸作为筑巢材料在巢穴质量和评分者一致性方面均表现出优越性，旨在提高筑巢实验的有效性和可靠性。

方案

所有实验程序均经乔治梅森大学机构动物照护与使用委员会批准，并符合实验室动物照护评估与认证协会所制定的指南。

1. 实验动物及评估前的注意事项

  1. 本方案使用成年、9至12月龄的C57BL/6J（n = 10）（货号 # 000664）野生型小鼠，以及由半合子J20（货号 #006293）与纯合子APOE e4（货号 #012307）杂交获得的APOE e4小鼠（n = 11）。
  2. 在饲养室内，将同性别同胞小鼠分组饲养，并提供适当的环境丰富化设施（例如，本方案中为小鼠提供跑轮、冰屋和小型尼龙咀嚼玩具）。在尺寸为356 mm 长 × 485 mm 宽 × 218 mm 高的饲养笼中，每笼饲养4至6只雌性小鼠或4只雄性小鼠。
    注意：研究人员可考虑在筑巢实验前和/或后采取相应策略，以避免小鼠在筑巢试验后重新合笼时发生同笼攻击行为。此类策略包括但不限于：在行为学测试前每日进行抓取操作，使小鼠更好地适应测试过程中的抓取操作、研究人员及饲养人员19；将具有攻击性的小鼠分离并单独饲养；或根据笼内打斗的严重程度、观察到的伤口情况21等，减少每笼饲养数量20。

2. 实验室与巢穴设置

  1. 确保每只小鼠完成四次试验（每次试验使用一种材料）。为避免顺序效应，需对每只小鼠的筑巢材料使用顺序进行随机化。
  2. 在独立的测试室内准备笼具。记录环境条件（例如，22.2 – 22.3°C，45-47% 湿度，光照时间 9:00 AM – 9:00 PM）以确保各次实验条件一致，并与动物饲养室环境相同。提供食物和水 随意摄取.
    1. 为每只小鼠分配一个随机的编号或字母作为识别号。将写有随机识别号的卡片贴在29.2 x 18.4 cm的笼具上。
    2. 记录原始动物编号/标签及其他必要信息于品系记录中，以确保助手和动物饲养人员对实验分组情况保持盲态。
  3. 随机安排测试房间内笼具的位置，确保野生型小鼠与转基因小鼠不会被不当分隔（例如位于房间两侧、不同架子等）。
  4. 通过在笼子底部铺上足够的垫料来准备筑巢材料。在方形、扭绞和碎纸试验中，使用约100克干重的玉米芯垫料；在软质玉米芯试验中，使用约100克软质玉米芯垫料。
  5. 若使用烧杯分散垫料，则烧杯中的玉米芯垫料或软质玉米芯垫料体积不得超过100 mL。
  6. 在将小鼠放入笼子之前，先按顺序放置第一种筑巢材料。本实验方案使用了以下材料：（1）一个压缩棉垫，（2）一根纸质扭条，（3）仅100 g软玉米芯垫料（即不添加其他垫料或筑巢材料），以及（4）2.5 g洁净（无油墨）的白色打印纸，剪成5–7 cm长的条状。筑巢材料的分布方式如图所示 图1 （基线）

分解实验装置；纸卷、棉片、碎纸、玉米芯垫料置于托盘中
图1：每种材料的笼具设置。 每只小鼠均对每种材料完成一次试验，共进行四次试验。装有纸卷、压缩棉片和碎纸的笼具底部全部铺满玉米芯垫料。软质玉米芯垫料均匀分布在笼具内，以促使小鼠将小棉片从玉米芯中分离出来。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 巢穴实验

  1. 在光照周期开始时的同一时间（例如上午9:00）启动第一次筑巢实验。
  2. 将装有小鼠的饲养笼带入测试房间。将每只小鼠从饲养笼中取出，并放入其指定的筑巢笼中，笼内已预先放置好筑巢材料。将饲养笼送回饲养室。
  3. 让小鼠在24小时内不受干扰地完成一次实验。
  4. 在第一次实验开始24小时后，返回测试房间。
  5. 小心取下笼盖，拍摄每只小鼠的巢穴照片，确保照片中包含对应的编号，并尽量避免拍摄到笼外的材料。
    注意：在尝试将小鼠从笼中取出前，请等待小鼠离开巢穴。强烈建议在小鼠仍在笼内但未处于巢上时拍摄巢穴照片。若在拍照前试图移出小鼠，可能导致小鼠受惊，从而爬上巢并散落筑巢材料。
  6. 轻柔地将小鼠从筑巢笼中取出，并放入临时暂养笼中。丢弃垫料和所有筑巢材料，更换新的垫料，按顺序提供下一种筑巢材料，然后将小鼠放回筑巢笼。
  7. 根据需要重复上述步骤，以获得全部4次实验的评分。建议使用碎纸材料及配套的评分标准，尽管研究人员可能希望使用本方案中讨论的其他替代材料。
  8. 所有实验完成后，将小鼠放回其饲养笼。观察小鼠是否存在潜在的攻击性行为。老年野生型雄性小鼠可能出现攻击行为。
    注意：在本方案中，小鼠在约9至12月龄时进行一次测试。为记录筑巢能力随时间下降的情况，并证明神经退行性变的可能因果作用，建议在多个年龄段（即在较早年龄，根据所选品系，在表型特征出现之前）进行筑巢实验。

4. 评分与评估评分者间信度

  1. 为每种筑巢材料提供基线图像，至少由2名对研究不知情的人员进行评估。尽管非强制要求，应确保评分者熟悉筑巢的概念。在培训评分者时，提供一系列示例巢穴（例如，图2 中的碎纸材料），以帮助评分者熟悉每种材料类型（如适用）及评分标准。
    1. 根据以下评分标准（改编自Deacon, 2006）2，对每个巢穴按1–5分进行评分。参见 图2 中使用碎纸材料的示例评分。
    2. 当碎纸或小纸片在整个笼内散落，或棉垫或棉条未被触碰时，评分为1分；
    3. 当部分材料被用于筑巢，但超过50%的材料未被使用（即仍散落在各处，或大部分原始材料保持未动）时，评分为2分；
    4. 当已形成可辨识的巢穴结构，但仍有多处材料散落时，评分为3分；
    5. 当几乎所有材料均已被用于筑巢，仅有少量材料散落或位于巢穴附近时，评分为4分；
    6. 当所有材料均被用于构建出一个可明确识别的巢穴时，评分为5分。
      注意：评分者应在评分过程中适时休息，并重新查看基线照片，以避免疲劳和偏倚。评分者之间不应在评分过程中讨论评分结果，以防产生偏倚。评分完成后，或在需要进一步讨论以调整评分时，可进行讨论，这有助于解决组内相关系数（ICC）方面可能存在的问题。组内相关系数分析将按照第4.2节列出的步骤进行。

啮齿类动物行为观察装置；装有垫料的容器中依次出现的小鼠行为。
图 2：使用首选材料（碎纸）评分标准的示例。 从左到右：1 —— 碎纸未被触碰；2 —— 部分纸张被筑成巢穴，但大部分纸片仍散落在周围；3 —— 已形成明显的巢穴，但仍有多块纸片散落；4 —— 大部分纸片已用于筑巢，但仍有少量纸片散落在巢穴附近；5 —— 所有纸片均被用于筑巢。请注意，照片中显示了动物的编号，以避免破盲。卡片颜色为随机选择。研究人员应让小鼠留在笼内，以避免惊扰动物，否则可能造成巢穴散开。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 收集并输入评分数据，将数据文件格式化，使每位评分者的每种材料评分分别位于不同的列中。
    注意：如果使用补充文件1，请注意该分析的编码脚本需要使用免费的开源软件（例如 RStudio 中的 irr 包）22,23。该脚本会移除表头和受试变量（即第一行和动物编号），以进行组内相关系数（ICC）分析。通过选中代码中标记的区域并按下 Ctrl+Enter 或 Command+Enter 来运行脚本，执行双向、一致性、平均值测量的 ICC 分析。
  2. 将 ICC 结果与现有标准进行比较24,25,26。通常，ICC 值高于 0.80 表示评分者间信度良好，可支持在特定时间点对评分进行平均处理（补充文件2）。
  3. 使用相同的 ICC 标准评估评分者内部信度，这对于首次进行评分的人员尤其具有参考意义。
    警告：评分者应在初次评估后的一周内对相同的巢穴照片进行再次评分。当 ICC 值较低时，应谨慎进行数据平均化处理，因为这可能导致数据偏倚或得出无效结果。若 ICC 值较低，则可能需要：(1) 对评分者进行额外培训；(2) 评分者之间需讨论其巢穴评分的依据；(3) 引入另一位独立评审者对评分做出最终判断；或 (4) 重新评估评分者内部信度。若评分者内部信度较差，则可能需要进一步培训或更换评分者。

5. 统计学考虑

  1. 根据具体情况开展统计分析。对于符合正态性假设但每只小鼠使用多种材料的数据（即存在组内效应），应采用混合设计方差分析（mixed ANOVA）。
    1. 若使用作为补充文件提供的代码，请下载脚本中指定的额外附加软件包27,28,29,30。
    2. 若使用所提供的脚本进行混合设计方差分析，请运行该脚本，将任何宽格式数据文件转换为长格式（即，将变量在列中重复的格式，转换为数据单元格在行中重复的格式）。本文提供了一个示例数据文件，用于演示如何将数据文件从宽格式转换为长格式。
    3. 按照脚本中的说明进行混合设计方差分析。请注意，若Mauchly球形检验结果显著（即违反球形假设），则需采用校正方法，例如Greenhouse-Geisser校正。
    4. 根据编码脚本中的说明，进行必要的事后检验，以分析具有两个以上水平的因素之间的差异。在本示例中，采用Bonferroni事后检验来比较不同类型的筑巢材料。
      注意：如果仅使用一种筑巢材料，则不应引入组内因素。然而，如果在多个时间点收集数据，则应将这些重复测量视为组内因素的不同水平进行分析。
      ​注意：在某些情况下，野生型小鼠可能获得满分，从而出现天花板效应，导致数据分布非正态2。在分析数据时，应考虑采用适当的统计检验方法（例如，使用非参数检验以及替代的集中趋势和离散度度量）、数据标准化方法或稳健分析方法（如针对重复测量的混合效应模型）。

结果

野生型小鼠与 APOE e4 小鼠在四种不同筑巢材料下的实验结果解释如下。根据现有标准，三位编码者对所有四种筑巢材料的评分均表现出高度一致性（碎纸材料 ICC = 0.94；方块材料 ICC = 0.91；垫料材料 ICC = 0.87；扭条材料 ICC = 0.87）；因此，将三位编码者的评分取平均值，为每种提供的材料生成一个单一评分。采用 2 × 4 混合设计方差分析（ANOVA）发现，基因型的主效应显著，F(1, 19) = 31.30，p < 0.01，ηp2 = 0.62。在所有四种提供的材料中，野生型小鼠的筑巢质量评分（3.18 ± 0.20）显著高于 APOE e4 小鼠（1.98 ± 0.16）。此外，混合方差分析结果显示材料类型的主效应也显著，F(3, 57) = 57.48，p < 0.01，ηp2 = 0.75。经 Bonferroni 校正的成对比较表明，碎纸材料的评分（4.11 ± 0.20）在质量上显著高于方块材料（1.95 ± 0.21）、垫料材料（2.21 ± 0.21）和扭条材料（1.94 ± 0.20）（p < 0.05），而方块、垫料与扭条材料之间的评分差异无统计学意义（所有 p > 0.99）。基因型与材料类型之间无显著交互作用。数据见图 3。

本实验室的其他实验在早发性阿尔茨海默病模型中也获得了类似结果。例如，如图4所示，5.5月龄的P301L rTg4510（htau）小鼠使用碎纸筑巢的能力显著差于同龄的野生型对照小鼠31。同样，双转基因J20（hAPP）/htau小鼠和单转基因htau小鼠在3.5月龄和7月龄时，使用碎纸筑巢的能力均差于野生型对照小鼠及仅携带CAMKIIa启动子的小鼠32（数据未显示）。

野生型与 APOE e4 小鼠使用不同材料筑巢的平均评分柱状图。
图 3：野生型与 APOE e4 小鼠使用不同材料筑成的巢穴质量评分。 基因型的主效应（*p < 0.01）表明，与 APOE e4 小鼠相比，野生型小鼠使用碎纸、压缩棉块、纸绳和软玉米芯垫料所筑的巢质量始终更高。材料的主效应（**p < 0.01）也显示，使用碎纸所筑的巢质量评分显著高于其他三种材料。根据组内相关系数（ICC）评估，碎纸材料的评分者间信度最高。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠筑巢行为；对比图表；野生型与htau小鼠在含锌水处理下的分析。
图4：野生型和htau小鼠在含锌水或不含锌水条件下构建的碎纸巢穴。（A）5.5月龄野生型和htau小鼠在对照（自来水）或添加10 ppm锌（一种与阿尔茨海默病相关的生物金属）的水中构建的代表性巢穴。巢穴质量根据指定标准采用1–5分制进行评分。从左至右依次为：野生型+含锌水（4.54±0.52）；野生型+对照水（4.15±0.80）；htau+对照水（3.08±0.64）；htau+含锌水（2.46±0.97）。（B）基因型*水处理的交互作用显示，饮用含锌水的htau小鼠所构建的巢穴质量显著差于其他各组（*）；此外，简单效应分析表明，饮用含锌水的htau小鼠比饮用对照水的htau小鼠筑巢能力更差。相比之下，饮用对照水或含锌水的野生型小鼠所构建的巢穴质量更高，且两者之间无明显差异。改编自《阿尔茨海默病杂志》第64卷，Craven KM, Kochen WR, Hernandez CM, Flinn JM，《锌加重Tau小鼠模型中的Tau病理》，第671–630页，版权所有（2018），经IOS Press许可转载31。该出版物可通过http://dx.doi.org/10.3233/JAD-180151在IOS Press获取。请点击此处查看此图的放大版本。

用于统计分析的 Python 脚本；包含变量声明、文件导入和统计方法。
补充文件 1：补充代码文件——nesting.R 请点击此处下载该文件。

显示动物编号数据及数值评分的基因型分类表。
补充文件 2：AD 研究筑巢评分.csv 请点击此处下载该文件。

讨论

筑巢是一种在进化上具有重要意义的啮齿类动物行为，已被用于评估小鼠的日常生活活动能力及总体健康状况2操作简便、结果可靠以及表面效度高使其成为 筑巢行为是许多行为学实验（如挖掘、昼夜节律和理毛行为）的实用补充。然而，随着筑巢实验在实验室中的应用日益广泛，其实施、量化和解读方法的组合也愈加多样。因此，有必要进一步研究以探索在方法学和实际操作上均科学可靠的筑巢实验流程，确保在降低测试成本、缩短测试时间及其他减轻测试负担的操作过程中，不牺牲该检测方法的有效性和可重复性。

筑巢质量确实对所提供的垫料类型和基因型敏感。总体而言，无论使用何种筑巢材料，野生型小鼠的筑巢质量均显著优于APOE e4小鼠；然而，与其余三种筑巢材料相比，野生型和APOE e4小鼠均能利用碎纸片构建出显著更高品质的巢穴。其他研究也支持碎纸片的优势：小鼠使用碎纸条构建的巢穴比使用压缩棉垫、纸巾和白杨木屑时更为复杂33。此外，使用碎纸条构建的巢穴在定性评估中被认为比其他材料更具有"自然性"，其特征表现为巢穴本身的形状以及巢腔周围墙壁的高度，从而形成穹顶状结构6,33。因此，在该实验中选择合适的材料至关重要，以便在相对受控的环境（即实验室条件）下更好地观察自然行为。更重要的是，尽管本方案仅在9–12月龄时进行了一次筑巢评估，但我们强调应在多个年龄阶段进行筑巢测试。由于该方案操作简便，可多次实施，理想情况下应在神经退行性病变相关功能缺陷出现之前进行。通过重复测量，可有机会记录神经退行性病变在筑巢能力下降中可能起的因果作用。 

不同遗传背景品系小鼠的自然筑巢行为存在差异34，因此，巢穴的整体质量和形状差异可能并非由目标转基因引起，而是由背景品系导致。例如，C57BL/6小鼠的祖先被认为 "“洞巢”型，而BALB/C小鼠的祖先是被认为 "表面“筑巢者”35C3H 背景的小鼠或与此品系的杂交小鼠，例如 Graybeal 等人研究中使用的 E4 小鼠（C3H/He-C57BL/6 杂交种）9 也被认为是较差的筑巢者；因此，研究人员应强烈考虑使用与转基因小鼠相同遗传背景的对照小鼠，这将有助于更准确地评估转基因本身而非遗传背景在神经退行性变及随后筑巢行为缺陷中的直接因果作用。

某些实验通常采用单名评分者对巢穴复杂性进行定性判断；然而，我们主张应纳入更多评分者，更重要的是，这些评分者应对实验条件设盲。通过该方法，我们采用了三名独立且对实验条件设盲的评分者，并使用组内相关系数评估评分者之间的一致性。这些评分者在经过基本培训后，获得了较高的组内相关系数，表明评分者间具有较高的信度以及对巢穴质量判断的高度一致性。此外，由碎纸和棉片构成的巢穴评分具有最高的组内相关系数，说明评分者之间的判断一致性更强、更稳定。高度一致的结果也为将多个评分取平均值提供了合理依据，而这一策略在行为学研究中以往常被随意使用。尽管该策略需要更多人员，并可能耗费更多评分时间，但它能有效降低筑巢等定性评估中的偏倚。

本实验所用筑巢材料的价格大致相当，但软玉米芯垫料除外。对于某些实验人员而言，商用筑巢垫料可能具有较好的经济性；然而，Martin 等人15指出，与皱纹纸等其他材料相比，棉片是市售筑巢材料中最昂贵的之一。这可能归因于其易于获取、储存和使用，但在面对设施内动物数量庞大、筑巢试验次数多、评分时间受限以及笼具成本较高的情况下，其他研究人员可能会选择同样有效且可靠的替代材料。因此，碎纸可能是一种更可行且合适的选择。此外，本方法的数据采集可立即进行（即现场评分），但强烈建议拍摄照片，以便记录、保存并在需要时对巢穴进行重新量化，用于后续评估评分者间和评分者内的一致性。如前所述，我们特别强调应纳入多名评分者进行"测试-重测”操作，以评估评分一致性，因为这些方法学上严谨的步骤常常被忽视。

综上所述，我们认为本实验的方法学和统计学考量（即组内相关系数）可能对评估小鼠生存质量、总体健康状况以及日常活动能力的实验具有参考价值。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Kevin Quant、Mario Martinez 和 Edwin Portillo 在巢穴评分方面的帮助，感谢 Rachel Barkey 在拍摄准备过程中的协助，以及 Stephen Lippi 和 Deborah Neely 对本稿件的校对。我们还要感谢心理学系为本实验承担了笼具费用，以及 Krasnow 研究所动物设施的饲养人员所提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
玉米芯垫料Envigo70921/8 英寸垫料，用于棉垫、碎纸和纸条实验
棉垫EnvigoIso-Blox
钻石状纸条Envigo7979C.CS实验方案中使用的纸条
小鼠 - APOE4 e4Jackson Laboratories#012307纯合 APOE4 e4 小鼠与半合子 J20 小鼠杂交
小鼠 - C57BL/6JJackson Laboratories#000664作为对照的野生型小鼠
小鼠 - J20Jackson Laboratories#006293半合子小鼠与纯合 APOE e4 小鼠杂交以产生后代
RstudioR Core TeamV1.1.463运行环境为 R 版本 3.5.3 (2019-03-11) — "Great Truth"。注意：提供的代码中包含额外的 R 软件包，可从 CRAN 安装
Soft CobEnvigo7087C

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小鼠筑巢行为作为行为缺陷的早期指标
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