使用柔性金-钛反应池模拟地下生物采矿中压力依赖性微生物活性

摘要

本方案描述了在高压条件下研究原位生物浸矿过程的微生物实验。该实验方法采用配备有金-钛反应池的往复式高压反应器，反应池内含有在酸性富铁培养基中的微生物培养物。

摘要

研究地下微生物过程的实验室工作，例如深部矿床中的金属浸出（生物采矿），面临着一些共同且具有挑战性的障碍，包括需要模拟特殊的环境条件，如高压以及在某些情况下存在的酸性溶液。前者要求实验装置能够耐受高达100 bar的压力，而后者则需要一个具有高耐化学腐蚀性的流体容器，并能防止容器壁与溶液之间发生不必要的化学反应。为满足原位生物采矿研究的应用需求，本研究采用了一种特殊的柔性金-钛反应池，置于摇动式高压反应器内部。该系统可在无氧、压力可控且高度化学惰性的实验环境中，模拟以硫驱动的微生物铁还原为基础的原位生物采矿过程。该柔性金-钛反应池最多可容纳100 mL样品溶液，并可在系统维持设定压力的同时，在任意时间点进行取样。实验时间尺度可从数小时至数月不等。高压反应系统组装过程较为耗时。然而，当需要在实验室中研究地球深部地下环境中、在化学性质剧烈的流体中发生的复杂且具有挑战性的（微生物学）过程时，该系统的优点远大于其缺点。研究结果表明，即使在高压条件下，微生物群落仍具有活性，但其代谢速率显著降低。

引言

在过去十年中，减少采矿对环境影响的努力不断加强。露天开采用于提取矿石原料（例如，富铜硫化矿），其挖掘活动以及提取铜等贵金属后残留的大量废石和尾矿，会对周边地貌造成影响。若能直接从地下矿体中提取铜，将显著减少这些影响。原位生物采矿技术是实现这一过程的有前景的候选方案¹。本文介绍利用刺激微生物活性，将矿石中的贵金属溶入地下水中形成溶液的方法。由此产生的富铜溶液可被轻松泵送至地表，以便进一步浓缩金属，例如进行后续处理。

许多实验室已针对多种参数对浸矿嗜酸性微生物的活性进行了研究^2,3,4,5,6。然而，由于地表实验室环境（接近1 bar）与地下1,000 m深度处的静水条件（约100 bar）之间存在压力差异，压力对微生物活性的影响尚未得到充分记录。因此，研究人员已通过不同的实验途径探讨了压力对微生物铁还原作用的影响⁷。本文详细描述了其中最适宜的技术方法。

高压反应器已被广泛用于研究地球地下环境中高温高压条件下的化学反应。这类反应器通常在底部设有一个反应釜，可用于容纳含有微生物培养物的流体样品。反应釜上方的反应头则提供了多种连接口和接口，用于安装安全装置和监测传感器（例如温度或压力传感器）。大多数高压反应器由不锈钢制成。这种材料具有高强度和良好的加工性能，但其表面的耐腐蚀性并不适用于所有实验条件。例如，在研究强酸性或强还原性水溶液时，目标化合物可能与反应器壁发生显著反应。一种避免该问题的方法是在反应釜内插入内衬，例如由硼硅酸盐玻璃制成的内衬⁷。这种内衬易于清洗，并可通过高压灭菌进行消毒，且不会被酸性或还原性水溶液侵蚀。尽管使用内衬有助于防止溶液或其中微生物与不锈钢反应器壁之间发生人为反应，但仍存在若干问题。其一，若反应过程中生成了腐蚀性气体（如硫酸盐还原菌产生的硫化氢），该气体可能与内衬上方未受保护的反应头表面发生反应。另一个缺点是无法在维持反应器内部压力的同时从中取出样品。

为了克服这些局限性，已开发出多种用于高压反应器内部的专用柔性反应容器，适用于不同应用场景。一种柔性聚四氟乙烯（PTFE）容器⁸被设计用于研究盐类在高盐卤水中的溶解度。然而，该系统的局限性在于某些气体容易渗透PTFE材料。此外，该材料的热稳定性仍然相对较低。因此，通过设计一种带有钛质端头的柔性金袋系统对该装置进行了改进⁹，将其置于不锈钢高压反应器内部。金表面对于酸性或还原性溶液及气体具有良好的抗腐蚀性能。钛表面在充分钝化形成连续的二氧化钛层后也表现出高度的化学惰性。在通过连接的钛质取样管从此反应容器中取样时，金袋体积会随之收缩。系统内部压力通过向容纳反应容器的不锈钢高压反应器中注入与取样体积相等的水来维持。在实验过程中，通过使高压反应器摆动或倾斜超过90°，使反应容器内的样品保持运动状态。

反应池由图1所示的部件组成：金袋、钛制卡环、钛制端盖、不锈钢垫圈、钛制压缩螺栓环、带不锈钢压紧接头和卡环的钛制取样管（用于两侧高压锥形螺纹连接），以及钛制阀门。金袋是一个圆柱形的金质（Au 99.99）容器，壁厚为0.2 mm，外径为48 mm，长度为120 mm。

所有钛制部件均由车间使用2级钛棒定制加工而成。衬套、头部、垫圈和压缩螺栓环的尺寸如图2所示。钛取样管为一段钛质毛细管，外径为6.25 mm，壁厚为1.8 mm，内径为2.65 mm。该取样管通过高压锥形螺纹连接固定在钛制头部和钛制阀门上，确保钛与钛接触面之间的密封性。高压钛阀配备有慢开式阀杆，即使在高压条件下也能实现非常可控的开启或取样操作。该系统已在多项研究中得到应用^10,11,12。

方案

1. 培养基的制备与微生物培养物的接种

1. 根据已发表的技术¹³配制用于自养型原核生物的基础盐培养基。将以下化学物质溶解并混匀于蒸馏水中（mg/L）：Na₂SO₄·10H₂O (150)、(NH₄)₂SO₄ (450)、KCl (50)、MgSO₄·7H₂O (500)、KH₂PO₄ (50) 和 Ca(NO₃)₂·4H₂O (7)。
2. 加入 1 mL/L 的 1000 倍浓缩微量元素溶液，其中包含（g/L）：ZnSO₄·7H₂O (10)、CuSO₄·5H₂O (1)、MnSO₄·H₂O (0.76)、CoSO₄·7H₂O (1)、CrK(SO₄)₂·12H₂O (0.4)、H₃BO₃ (0.6)、NaMoO₄·2H₂O (0.5)、NiSO₄·6H₂O (1)、Na₂SeO₄ (0.51)、Na₂WO₄·2H₂O (0.1) 和 NaVO₃ (0.1)。通过加入 5 M 硫酸将 pH 调至 1.8。
3. 在 121 °C 和 1.2 bar 条件下，将培养基于高压灭菌器中灭菌 20 分钟，并通过 0.22 µm 孔径的一次性注射器滤器过滤灭菌三价铁溶液。
4. 将 50 mL 灭菌后的基础盐培养基转移至血清瓶中，并加入三价铁溶液和单质硫，使其终浓度分别为 50 mM 和 10 g/L。
5. 用包含多种嗜中性嗜酸性铁氧化原核生物的混合培养物接种该培养基¹⁴。
6. 用已灭菌的丁基橡胶塞密封血清瓶，并用铝盖压紧封口。
7. 用氮气（N₂）剧烈吹扫培养基 25 分钟以去除溶解氧。使用两根针头，一根插入瓶内较深处，另一根靠近瓶盖位置。
8. 注入 CO₂，使血清瓶顶空形成 90% N₂ 和 10% CO₂ 的气体环境。将培养物置于 30 °C 黑暗条件下静置培养。

2. 金-钛反应池和高压反应器的制备

1. 清洗金-钛反应池。
   1. 将反应池拆解为各个独立部件，以避免酸与不锈钢部件接触，或使具有不同热膨胀系数的组装部件受热。
   2. 清洗实验过程中将与样品接触的表面（即金袋、钛头、钛取样管和钛阀）。
      1. 将金袋和钛头放入玻璃烧杯中。
      2. 加入足量10% HCl，确保完全浸没所有部件。
      3. 在加热板上将酸液加热至50 °C，持续搅拌3小时。
      4. 使用聚四氟乙烯（PTFE）镊子将部件从酸液中取出，并用去离子水冲洗。
      5. 用65% HNO₃充分冲洗金袋和钛头的内表面，然后再用去离子水冲洗。
      6. 用10% HCl冲洗钛取样管和钛阀的内表面，随后依次用去离子水、65% HNO₃和去离子水再次冲洗。
      7. 用丙酮冲洗所有部件，以去除有机污染物。
      8. 将所有部件在105 °C的烘箱中干燥至少1小时。
   3. 在空气气氛下，将金袋、钛头和钛取样管的表面置于马弗炉中，于450 °C加热4小时。
      注：该步骤可对表面进行灭菌，并在所有钛表面形成一层钝化的二氧化钛保护层。热处理后，钛部件表面应呈现由黄至蓝的颜色变化。
   4. 对金反应池进行退火处理，通过丙烷喷灯加热使金的小晶域重置，从而提高金的柔韧性。应均匀加热金表面，以消除在上一次实验中因金袋体积收缩可能形成的褶皱。注意避免局部过热导致金熔化。
      注：当金表面呈现暗红色辉光时，表明加热充分。
   5. 将金袋安装至钛环内，并将钛取样管安装至钛头中，压盖的拧紧扭矩应为10 Nm。
2. 检查高压反应釜。
   1. 目视检查反应釜是否存在可能的损伤、腐蚀或松动部件。
      注：应特别注意密封面及密封槽口。若此前使用石墨垫片进行密封，则可能有残留物残留在槽口中，应在下次实验前用塑料针将其清除。
   2. 在高压反应釜头的推力螺栓上涂抹硫化铜润滑膏，并确保润滑脂均匀覆盖整个螺纹部分。
   3. 检查螺纹连接式压缩密封装置中剩余石墨填料的长度。

3. 在无氧条件下填充和组装金-钛反应池

1. 装载手套箱。
   1. 根据第1节所述，用血清瓶准备培养基。
   2. 用铝箔包裹金钛反应池中后续将与样品接触的部件，以尽量减少潜在污染。
   3. 打开并解锁手套箱的前室，将所有待进入的物料放置在可移动托盘上，然后关闭并锁紧前盖。
   4. 对前室抽真空3次，并用高纯度氮气冲洗。
   5. 戴上一副手套，尽量靠近内盖。解锁并打开内盖，从可移动托盘上取出待进入的物料。
   6. 关闭并锁紧内盖。
2. 填充金袋。
   1. 打开洁净的金袋，用玻璃烧杯等支撑使其直立。打开含有100 mL细菌培养物和单质硫的血清瓶。
   2. 轻轻摇动血清瓶，将细菌培养物转移至金袋中。
3. 组装反应池。
   1. 将带有钛质取样管的钛头插入包围金袋上缘的钛环中。
      注意：通过前后来回旋转90°，确保钛头锥形下部的密封面平稳贴合。
   2. 将垫圈和压紧螺栓环沿钛质取样管滑动，套在钛头上。
      注意：将压紧螺栓环在钛环中旋转30°，使钛环与推力螺栓环的法兰对齐。
   3. 将六个内六角螺钉均匀拧紧，以确保钛头在钛环内的金袋最上缘（即反应池的密封面）受力均匀。
      注意：将内六角螺钉在压紧螺栓环上手动拧紧，先对角增加扭矩（交叉顺序），再顺时针依次拧紧。
4. 重新安装钛管顶部的取样阀。手动拧紧连接处，并确保阀门处于关闭状态。
5. 将所有部件从手套箱中取出。

4. 用反应池组装高压反应器

1. 将反应池组装到反应釜头中。
   注意：安装高压反应釜时，取样管的开口端会短暂暴露于周围大气中，因为在将取样管穿过反应釜头的螺纹密封件时，必须先拆下取样阀。安装时，应先将反应釜头放入台虎钳中。保持45°角有助于操作。用于固定取样管的压缩密封接头（位于反应釜头压力表组件的中心位置）必须处于打开状态。
   1. 拆下钛制取样阀、顶部的螺钉和取样管上的卡环。
   2. 将连接有反应池的取样管穿过反应釜头的中心孔，直至约有5 cm的管段穿过。将大螺母套在取样管上，并固定小卡环。
      注意：此时反应池组件无法从反应釜头中滑出，双手可自由操作以重新安装取样阀。
   3. 重新安装钛制阀门。
   4. 拧紧压缩密封接头。
   5. 将反应釜头从台虎钳中取出，准备安装至反应釜本体上。
2. 准备密封反应釜。
   1. 将石墨密封圈安装在反应釜本体的凹槽内。
   2. 小心地将带有反应池的反应釜头放置到反应釜本体上。
      注意：必须小心地将反应釜头（包括热电偶）放置在反应釜本体上，以避免损坏金袋或热电偶。
3. 向反应釜本体内加入去离子水与自来水的混合液（比例约为1:1）。
4. 密封反应釜。
   1. 检查卡箍，确保压缩螺栓的下端未超出螺纹部分，否则压力容器将无法正确安装。
   2. 提起卡箍并将其套在反应釜头与釜体接口的突出边缘上。轻轻移动卡箍使其就位，并闭合卡扣以固定卡箍。
   3. 按照对角交叉顺序拧紧压缩螺栓，并分步适度增加扭矩，直至达到制造商推荐的最终扭矩值。
      注意：不同高压反应釜系统的扭矩值可能不同。
   4. 最后，按顺时针方向再次紧固压缩螺栓。
5. 将高压反应釜安装至摇动装置中。
   注意：此处描述的高压反应釜在摇动装置中的安装方法适用于德国汉诺威联邦地球科学与自然资源研究所自制的型号。因此，所述安装步骤可作为类似设计设备的一般性指导。
   1. 小心地将反应釜安装到摇动装置中。
      注意：在将高压反应釜放入摇动装置时，最好握住压力表组件部分（如压力表或取样管的螺钉）进行操作。
   2. 使用一对长螺钉和两个夹具固定反应釜。
   3. 在每根螺钉上安装垫圈，并用螺母拧紧夹具。
   4. 连接热电偶、压力传感器和加热元件的控制单元。
      注意：必须确保所有导线长度足够，以适应摇动过程中的运动，并防止与加热表面接触。
   5. 将加热元件套在反应釜本体上，并拧紧其锁紧螺钉。
      注意：用于加压系统的水由高压泵从储水罐中抽取，通过不锈钢毛细管输送至高压反应釜。
      注意：高压反应釜的摇动可确保反应池内各组分（即气体、液体及所有固相）充分混合。缓慢的摇动速度至关重要，以防止固体快速移动或高温下柔性金袋因重力作用变形而造成损坏。摇动系统可实现接近180°的旋转。

5. 开始实验

1. 检查监控软件中的温度和压力限值是否已设置为所需数值。
   注：本实验中设置为 70 °C 和 25 MPa。
2. 进行泄漏检查。
   1. 将压力管道（一根不锈钢毛细管）连接至反应釜头。
   2. 以明确的间隔逐步升压至目标压力，同时持续检查是否存在泄漏。
   3. 保持压力恒定，直至泵的流速接近零。
      注：注意水中可压缩的溶解空气在微小流量读数中会持续显示较长时间。
3. 泄漏检查通过后，启动加热。
   1. 启动增压泵的数据记录功能。
   2. 将加热设定值调整至所需数值，并通过软件启动加热。
   3. 定期检查所有参数及系统状态。
   4. 达到目标温度后，松开压力管道。
   5. 启动摇动装置。

6. 在运行模式下对高压反应器进行取样

1. 取样时，将一个5 mL注射器连接到高压反应器顶部取样阀的鲁尔锁接头上。
2. 小心打开阀门，使高压反应器内部压力将流体样品推入注射器中。当取样体积达到1 mL时，关闭阀门，并取下注射器。
3. 立即将注射器中的样品转移至通风橱内的2 mL离心管中，进行后续处理。

7 . 流体样本分析

注意：此处仅详细描述并提及视频中较少见的光度法亚铁嗪检测步骤（即第7.1节），因为其他步骤属于微生物学中的标准操作程序。

1. 采用菲啰嗪（ferrozine）比色法光度测定溶解态亚铁离子（Fe²⁺_(aq)）和总铁（Fe_tot）的浓度¹⁵。
   1. 通过将已知量的FeSO₄·7 H₂O溶于水中，配制一系列亚铁离子标准溶液。
   2. 将50 µL上述各标准溶液与1 mL 1 M菲啰嗪溶液混合。
      注意：菲啰嗪与溶解态亚铁离子反应生成紫色络合物，颜色强度与亚铁离子浓度成正比。
   3. 建立亚铁离子浓度与铁-菲啰嗪络合物吸光度之间的校准曲线。
   4. 根据已建立的标准曲线，通过两个平行样品的测量值计算样品中亚铁离子的浓度。
2. 使用数字pH/氧化还原电位（ORP）计，分别配合半微量pH电极和氯化银电极，测定溶液的pH值和氧化还原电位（ORP）。
3. 使用带Thoma计数室的光学显微镜直接计数浮游细胞。
4. 利用扫描电子显微镜（SEM）观察细胞形态。
   1. 将在不同条件下培养的浮游细胞通过孔径为0.1−0.2 µm的滤膜进行过滤。
   2. 用丙酮对样品进行脱水处理，并在4 °C条件下于90%丙酮中保存过夜。
   3. 采用临界点干燥法干燥样品，随后镀上石墨或金膜。
   4. 使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）在10 kV条件下观察样品。

结果

使用特殊金-钛反应池的高压反应器实验结果表明，嗜酸微生物混合培养物能够氧化硫并还原三价铁为二价铁（图3）。

在1 bar和100 bar压力条件下，微生物在金-钛反应池中培养时均表现出滞后期。滞后期之后，在1 bar条件下培养的微生物体系中，亚铁离子浓度迅速从约9 mM升高至31 mM。在22天的培养期间，分别在1 bar和100 bar条件下检测到约31 mM和13 mM的亚铁离子。这明确表明，微生物细胞在100 bar压力下仍具有活性，但在高压条件下其三价铁还原活性显著降低。在亨盖特管和血清瓶中进行的非生物对照实验均未显示在1 bar和100 bar条件下发生三价铁还原。

扫描电子显微镜图像（图4）显示了在低压和高压条件下培养的杆状细胞。在1 bar与100 bar条件下，细胞形态未见显著变化。然而，升高的压力明显抑制了细胞生长，1 bar时细胞数量为1.3 × 10⁸ 个细胞/mL，而100 bar时为4.5 × 10⁷ 个细胞/mL⁷。这些数据与在亨盖特管中进行的实验结果相当⁷。因此，柔性金-钛反应池本身对细胞生长无影响，适用于微生物生长测试。

结果表明，即使在100 bar的高压条件下，生物浸出微生物仍然具有活性，这一发现对于原位生物采矿具有重要意义，因为深度超过1,000 m的深部矿床中正是存在此类环境条件⁷。

图1：反应池各部件示意图。 自下而上：金袋、钛套环、钛头部、垫圈、钛压缩螺栓环、带不锈钢压紧接头和套环的钛采样管（用于两侧高压锥形螺纹连接），以及配有适配器的钛阀，可用于连接鲁尔锁式注射器。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2：由2级钛棒材加工而成的钛合金部件的尺寸图纸。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：在含亚铁氧化培养物的金-钛反应池中亚铁离子浓度的变化。 细胞在30 °C下进行厌氧培养。请点击此处查看此图的放大版本。

图4：在1 bar和100 bar压力下培养的嗜铁亚铁氧化菌群的形态学特征。 细胞在30 °C下进行厌氧培养。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

本文所述的在酸性溶液中进行微生物反应高压实验的方法，是一种在实验室环境中模拟深部地下地球微生物过程的有力工具。

涉及多个手动操作步骤，其中某些步骤需要特别注意。一般而言，在组装柔性金-钛反应池和反应器头（第3和第4节）的各个部件时，不得施加过大的力。如果忽略制造商的规格说明（如最大压力、温度、扭矩等），可能导致泄漏和/或材料失效。

金和钛部件的清洗（第2.2节）是一项不可或缺的操作步骤，不仅对本实验如此，尤其对于涉及有机或无机反应的实验更是至关重要。金池中残留的先前实验物质可能引发非预期的反应，从而导致结果偏差。当组装好的金-钛反应池安装到反应器头部时，最好快速而精确地操作，因为此时可能有少量氧气进入金池。在离开手套箱前关闭取样阀，是减少金池内部与外界大气交换的有效初步措施。

将反应器放入摇动装置后，必须将摇动速度设置为约170°/min。如果高压反应器运动过快，由于重力作用或所用沉积物或岩石样品的尖锐边缘，可能导致金池破裂。

该方法可用于其他研究领域。这种柔性的金-钛反应池有望用于多种科学研究⁹，以研究在高温高压以及强腐蚀性流体或气体中的反应。

在存在矿物表面且温度高于70 °C的深部地下环境中，微生物可能在高压条件下促进分子氢或乙酸等有机酸的生成¹⁶。除本研究中所探讨的硫化物外，这些产物及其他化合物可能在原位生物浸出过程中诱导微生物活性升高。

应用包括测定气体和离子在水溶液中的溶解度、热液喷口系统条件下的地球化学反应¹⁷、同位素分馏的量化¹⁸、CO₂ 封存过程中的地球化学反应¹⁹、源岩中油气形成过程中的非生物过程²⁰，以及如本研究所述的地下高压环境中的微生物反应²¹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Merck	100013
CaN2O6	Fluka	31218
Conax 压缩密封接头	Conax Technologies	PG2-250-B-G	可根据实验温度选择相应的密封剂
导热硅脂	Caramba	691301
导热硅脂	CRC	41520
CoSO4x7H2O	Sigma	10026-24-1
CrKO8S2x12H2O	Roth	3535.3
CuSO4x5H2O	Riedel de Haen	31293
一次性比色皿	Sigma	z330388
无水乙醇	Roth	9065.3
场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）	JEOL	型号 JSM-6330F
菲罗嗪（Ferrozine）	Aldrich	180017
Fe2(SO4)3x7H2O	Alfa Aesar	33316
FeSO4x7H2O	Merck	103965
金制反应池	Hereaus GmbH		根据客户提供尺寸定制生产
高压反应釜	PARR Instruments	型号 4650 系列	也可使用其他厂商的反应釜
高压注射泵	Teledyne ISCO	DM-100
HCl	Roth	6331.3
HNO3	Fluka	7006
H3BO3	Sigma	B6768
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4	Merck	104873
L-(+)-抗坏血酸/维生素C	Applichem	A1052
光学显微镜	Leica DM3000
MgSO4x7H2O	Merck	105886
(NH4)2SO4	Sigma	A4418
NaMoO4x2H2O	Sigma	331058
NaO3Sex5H2O	Sigma	00163
NaO3V	Sigma	590088
Na2SO4	Merck	106649
Na2WO4x2H2O	Sigma	72069
NiSO4x6H2O	Sigma	31483
Omnifix Luer 注射器	BRAUN	4616057V
pH 计	Mettler Toledo
氧化还原电位计	WTW	ORP 便携式电位计
Safe-Lock 管，2 mL	Eppendorf	0030120094
血清瓶	Sigma	33110-U
分光光度计	Thermo Scientific	型号 GENESYS 10S
Sterican 皮下注射针头	BRAUN	4657519
瓶塞	Sigma	27234
硫磺粉末	Roth	9304
血球计数板（Thoma Chamber）	Hecht-Assistent
反应池的钛制部件	Titan-Halbzeug GmbH	121-238	由中国台湾BGR车间根据提供的尺寸，使用 Titan-Halbzeug GmbH 提供的 2 级钛棒加工制造
钛制阀门	Nova Swiss Technologies	ND-5002
Whatman 尼龙膜滤器	Sigma	WHA7402004
ZnSO4x7H2O	Sigma	Z4750