原代巨噬细胞的高效转染使用体外转录mRNA

摘要

巨噬细胞，尤其是原代巨噬细胞，因其专长于识别非自身来源的分子，转染难度较高。本文介绍一种可实现高效转染原代巨噬细胞的方案，所用mRNA由质粒等DNA模板体外转录生成。

摘要

巨噬细胞是一类专门用于识别非自身来源分子的吞噬性细胞。为此，它们表达多种模式识别受体（PRRs）。然而，这也使得巨噬细胞的转染尤为困难，因为转染试剂和被导入的核酸分子常被PRRs识别为外源物质。因此，转染往往导致巨噬细胞活化、导入的核酸被降解，甚至引发巨噬细胞自我毁灭。本文介绍一种可实现小鼠原代巨噬细胞（如腹腔巨噬细胞（PM）和骨髓来源巨噬细胞（BMDM））高效转染的方案，所用mRNA由质粒等DNA模板体外转录而来。采用这一简单方案，可在无细胞毒性或免疫原性的情况下，实现约50–65%的PM转染效率和约85%的BMDM转染效率。本文详细描述了从质粒等DNA构建体生成用于转染的mRNA的方法以及转染操作流程。

引言

巨噬细胞是一类吞噬细胞，专门负责识别、摄取和降解微生物、凋亡细胞及细胞碎片。此外，它们通过分泌细胞因子和趋化因子，并向T细胞和B细胞呈递抗原，参与调控免疫应答。巨噬细胞还在伤口愈合、动脉粥样硬化、肿瘤发生和肥胖等多种其他生理与病理过程中发挥重要作用。

为了能够识别病原体相关分子模式（PAMPs）等非自身分子以及损伤相关分子模式（DAMPs）等错位分子，巨噬细胞配备了多种模式识别受体（PRR）¹。然而，这也使得巨噬细胞的转染尤为困难²，因为转染试剂³和转入的核酸^4,5,6,7常被PRR识别为非自身物质。因此，使用化学或物理方法转染巨噬细胞⁸通常会导致巨噬细胞活化，转入的核酸被降解，甚至通过焦亡（pyroptosis）引发巨噬细胞自我毁灭；焦亡是一种在识别胞质内PAMPs/DAMPs（如DNA或外源RNA）后触发的程序性裂解性细胞死亡形式⁹。利用病毒（如腺病毒或慢病毒）作为载体对巨噬细胞进行....

方案

小鼠巨噬细胞的分离操作严格遵循德国动物保护法，并符合科隆大学伦理委员会的规定。

注意：所有操作步骤均需佩戴手套。所有转染步骤均须在层流罩内进行，以防止细胞污染。在使用 mRNA 前，须用 70% 乙醇和/或可降解 RNA 酶的表面活性剂清洁所有仪器（如移液器）及工作台面（材料表）。确保所有反应管无 RNA 酶且无菌。稀释时仅使用无菌、无 RNA 酶的水。移液枪头必须使用带滤芯的类型，并且每次移液后均需更换新枪头。

1. DNA 模板的制备

注意： 使用本方案进行体外 mRNA 转录时，DNA 模板必须包含 T7 启动子序列，以允许 RNA 聚合酶结合。如果含有目标蛋白 DNA 序列的质粒已在目标序列的正上游位置包含正确方向的 T7 启动子序列，则需对质粒进行线性化处理（见步骤 1.1）。否则，需通过聚合酶链式反应（PCR，见步骤 1.2）将 T7 启动子连接至目标序列。

1. 含有T7启动子的质粒线性化
   1. 使用限制性内切酶对已含有正确方向T7启动子序列的质粒进行消化，酶切位点应位于目的序列下游的终止密码子之后。否则，转录将无法在目的序列后正确终止。
      注意：

结果

我们已成功应用该方案生成编码FLAG标签NEMO和IKKβ变异体的mRNA，用于原代巨噬细胞的转染¹⁶。编码FLAG标签野生型（NEMO^WT）和C54/347A突变型NEMO（NEMO^C54/374A）的质粒（见材料表）已包含正确方向的T7启动子（图1A）。因此，我们仅需将质粒线性化，以获得体外转录所需的DNA模板。为此，使用5 µL XbaI酶切10 µg质粒DNA，通过在终止密码子3'端的单一位点切割实现质粒线性化。通过琼脂糖凝胶电泳验证质粒DNA的完全线性化（图1B）。

编码FLAG标签的野生型（IKKβ^WT）和S1.......

讨论

本文介绍一种高效转染通常难以转染的原代巨噬细胞的方案，所用材料为体外转录的mRNA。重要的是，采用本方案转染巨噬细胞不会引起细胞死亡，也不会激活促炎信号通路，表明转染试剂和转染的mRNA均未被识别为非自身物质。

mRNA的质量对于使用本方案成功转染巨噬细胞至关重要。因此，必须格外注意避免mRNA与RNase接触（例如，通过被污染的缓冲液或小瓶）。如有疑问，应检测mRNA是否发生降解（例如，通过琼脂糖凝胶电泳）。转染率和表达水平在转染后6 h时已达到最大值。因此，目的蛋白可能在转染后更早的时间点即已表达至足以进行分析的水平，但我们尚未对此进行测试。此外，转染更高量的mRNA可能会进一步提高转染率和/或表达水平。然而，转染较大量mRNA也可能导致一定程度的免疫原性甚至细胞毒性。而完全缺乏此类反应正是本方案的主要优势之一。因此，若需转染较大量mRNA，则必须仔细评估其免疫原性和细胞毒性。

表达水平与转染的mRNA量明显相关。然而，在NEMO缺陷型BMDM中重新表达NEMO后，其NEMO蛋白表达水平与野生型BMDM相当

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-甲基-CTP（100 mM）	Jena Biosience	NU-1138S	保存于 -20 °C
南极磷酸酶	New England BioLabs	M0289	保存于 -20 °C
南极磷酸酶反应缓冲液（10×）	New England BioLabs	B0289	保存于 -20 °C
抗-NEMO/IKKγ 抗体	Invitrogen	MA1-41046	保存于 -20 °C
抗-β-肌动蛋白抗体	Sigma-Aldrich	A2228	保存于 -20 °C
带凸缘的 92.16 mm 培养皿	Sarstedt	821,473	室温保存
CD11b 微珠（小鼠和人）	Miltenyi Biotec	130-049-601	保存于 4 °C
Cre 重组酶 + T7 启动子正向引物	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´，保存于 -20 °C
Cre 重组酶 + T7 启动子反向引物	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′，保存于 -20 °C
DNA 纯化试剂盒：QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104	室温保存
eGFP + T7 启动子正向引物	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´，保存于 -20 °C
eGFP + T7 启动子反向引物	Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´，保存于 -20 °C
Fast Digest 缓冲液（10×）	Thermo Scientific	B64	保存于 -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	保存于 -20 °C
高保真具有校对功能的聚合酶：Q5 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs Inc	M0491S	保存于 -20 °C
IKKβ + T7 启动子正向引物	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′，保存于 -20 °C
IKKβ + T7 启动子反向引物	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′，保存于 -20 °C
体外 mRNA 转录试剂盒：HiScribe T7 ARCA mRNA 试剂盒（含 polyA 加尾）	New England BioLabs	E2060	保存于 -20 °C
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	室温保存
MACS 多功能支架	Miltenyi Biotec	130-042-303	室温保存
mRNA 转染缓冲液与试剂：jetMESSENGER	Polyplus transfection	409-0001DE	保存于 4 °C
突变型 IKKβ IKK-2S177/181E 质粒	Addgene	11105	保存于 -20 °C
突变型 NEMOC54/347A 质粒	Addgene	27268	保存于 -20 °C
pEGFP-N3 质粒	Addgene	62043	保存于 -20 °C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	保存于 -20 °C
pPGK-Cre 质粒			F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, 新型可诱导 Cre 重组酶：Cre-PR 融合蛋白的新突变体表现出更高的敏感性和更广的可诱导范围。Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001)。保存于 -20 °C
假-UTP（100 mM）	Jena Biosience	NU-1139S	保存于 -20 °C
QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-090-976	室温保存
大鼠抗小鼠 CD11b 抗体，APC 标记	BioLegend	101212	保存于 4 °C
大鼠抗小鼠 F4/80 抗体，PE 标记	eBioscience	12-4801-82	保存于 4 °C
重组 M-CSF	Peprotech	315-02	保存于 -20 °C
RNA 纯化试剂盒：MEGAclear 转录纯化试剂盒	ThermoFisher Scientific	AM1908	保存于 4 °C
RNA酶降解型表面活性剂：RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	室温保存
大肠杆菌 O111:B4 超纯 LPS	Invivogen		保存于 -20 °C
野生型 IKKβ 质粒	Addgene	11103	保存于 -20 °C
野生型 NEMO 质粒	Addgene	27268	保存于 -20 °C