提出了一种无血人工饲料的配制方案，用于饲养 按蚊属 在人工饲养条件下的蚊子。该饮食方案的效果与脊椎动物血液相似，可触发卵子发生和卵子成熟，并产生可存活的成年子代。
本文内容
摘要
摘要
疟疾研究需要在人工饲养条件下大规模繁殖和生产蚊子（Anopheles spp.）。目前，新鲜脊椎动物血液的供应限制了蚊子的可持续和稳定生产。为了推动对疟疾及其他通过吸血昆虫传播的媒介传染病的有效防控策略，亟需寻找血液的替代品。基于这一目标，研究人员配制了可替代新鲜脊椎动物血液的人工液体饲料。本文报道了一种无血的人工液体饲料，其摄食率与血液相当，并能模拟新鲜脊椎动物血液餐后的生理效应。该饲料可诱导Anopheles蚊子的卵巢和卵子成熟，同时支持幼虫的良好存活以及功能性成蚊的正常发育。这种配制的无血液体饲料是实现人工饲养蚊子可持续繁殖的重要进展，将降低蚊群维持成本，并消除对新鲜脊椎动物血液的需求。
引言
虫媒疾病影响全球数以百万计的人类，每年导致数百万人死亡。这些疾病通过感染了致病微生物（如原生动物、病毒）的昆虫传播，这些昆虫在吸食受感染宿主的血液时获得病原体。随后，受感染的媒介会在下一次吸血时将病原体传播给新的宿主。疟疾是最致命的虫媒疾病，由多种按蚊（Anopheles）传播，影响全球40%的人口1。每年，疟原虫寄生虫导致超过40万例死亡，其中大多数为5岁以下儿童（世界卫生组织）。雌性按蚊（Anopheles）在吸食脊椎动物血液时，将疟原虫属（Plasmodium）的疟疾寄生虫在人类与其他动物之间传播，而吸血是其产卵和发育的必要步骤2。
目前根除疟疾及其他新发致命蚊媒疾病的战略依赖于开发创新的蚊虫控制策略3,4,5，其中包括将大量在昆虫饲养室中培育的蚊虫释放到野外。然而，一个关键的限制因素是蚊虫有效饲养和繁殖对新鲜血液供应的依赖。脊椎动物血液成分的变异性可能对蚊虫的生育力和后代适应性产生负面影响，从而限制人工饲养种群的可靠性和可持续性。蚊虫释放与控制项目需要大规模的蚊虫生产系统以及持续大量供应的脊椎动物血液。这为蚊虫生产带来了重大障碍，同时也引发了一系列与使用活体动物相关的伦理问题，以及因严格的安全法规所带来的后勤限制。这导致蚊虫种群的维护和安全成本高昂，尤其在疟疾威胁更为严重的低收入国家，当前蚊虫饲养实践的可持续性面临严峻挑战。
近年来，研究重点集中在开发能够模拟脊椎动物血液餐的血液替代物上，但迄今为止，仅取得了有限的进展。6,7,8,9一种成功的人工饲料需要能够：（1）引发雌性蚊虫充分吸血，（2）触发卵黄原蛋白的产生，（3）产生大量可存活的卵，以及（4）孵化出健康的子代10此外，人工饲料具有标准的成分组成，因此在用于科研和防控目的的蚊虫饲养中更为可靠。目前已成功开发出无需血液的饲料配方，用于 伊蚊 蚊子（由 Gonzales 和 Hansen 综述）11）但不适用于 按蚊属 spp. 现有的人工饲料中含有摄食刺激剂（例如 ATP）10），卵子成熟所需的蛋白质来源6,12，碳水化合物作为能量来源，以及氨基酸（aa）13 对卵子产生至关重要，且是蚊虫生育力的主要限制因素14一种无血人工饲料还需要提供胆固醇15，可提高产卵量。本文介绍一种适用于雌性昆虫的人工无血饲料 按蚊属 蚊虫，并证明其表现与高质量的脊椎动物血液餐相当。
方案
小鼠来自 IHMT 动物房。动物实验严格遵循葡萄牙关于实验动物使用法律和指南进行。所有研究方案均获得葡萄牙农业、农村发展与渔业部兽医总署批准（批准编号：023351 和 023355）。
注意：所有喂养实验均在约 26 °C 下进行。
1. 蚊子
- 在 26 °C、75% 湿度、12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下饲养Anopheles coluzzii（原Anopheles gambiae M 型）Yaoundé 品系蚊虫。采用标准昆虫饲养条件饲养蚊虫，以确保其交配。
- 将蚊蛹收集至小容器的水中，将容器放入蚊笼中，使成蚊羽化并交配。提供 10% 葡萄糖喂养液。羽化后第三天，使用吸蚊器从种群蚊笼中收集所需数量的蚊虫。
- 在喂食试验前一天，移除 10% 葡萄糖喂养液。
注意：实验全程使用羽化后第三天的蚊虫。
2. 蚊虫喂养
- 人工液体饲料的制备
- 在超净工作台中以无菌条件制备人工液体饲料。通过向基础液体饲料（i-liq_diet；DMEM高糖培养基[含L-谷氨酰胺]，见表1）中添加以下成分来配制富营养液体饲料（r-liq_diet）：0.55 g/L ATP、1 g/L 胆固醇和200 g/L 牛血清白蛋白（BSA）。充分混匀所有组分，并使用0.45 µm微孔滤膜过滤。
注意：请勿储存饲料，每次实验均需使用储备液新鲜配制，因储存会导致饲料质量下降。饲料各组分详见表1。
- 在超净工作台中以无菌条件制备人工液体饲料。通过向基础液体饲料（i-liq_diet；DMEM高糖培养基[含L-谷氨酰胺]，见表1）中添加以下成分来配制富营养液体饲料（r-liq_diet）：0.55 g/L ATP、1 g/L 胆固醇和200 g/L 牛血清白蛋白（BSA）。充分混匀所有组分，并使用0.45 µm微孔滤膜过滤。
- 小鼠血液采集
- 采用腹腔注射方式，以氯胺酮（120 mg/kg）和赛拉嗪（16 mg/kg）对6−8周龄CD1雌性小鼠（Mus musculus）进行麻醉。
- 当小鼠对不同物理刺激（如脚趾和尾部夹捏）无肌肉反应时，进行心脏穿刺（图1）。
- 使用含100 µL 1 mg/mL肝素钠盐的无菌1 mL注射器（配27 G x ½͂ [0.4 x 12 mm2]针头）采集血液，以防止血液凝固。将血液置于水浴中维持在37 °C。
- 人工饲喂
- 使用吸虫器从种群饲养笼中收集约30只雌蚊。
- 将雌蚊转移至500 mL纸杯中，并用细密的蚊网覆盖，防止逃逸。将连接塑料管路的玻璃饲喂器置于每个纸杯顶部，以维持持续的水流（图2）。向圆柱形管路和饲喂器提供持续水流，使内部温度保持在约37.5 °C。
注意：采用标准玻璃钟形人工饲喂装置16向雌蚊提供配制好的饲料。 - 在玻璃饲喂器口部拉伸石蜡膜作为餐膜，以容纳饲料。
- 将i-liq_diet和r-liq_diet在水浴中预热至37 °C，各取1 mL加入玻璃饲喂器中。在黑暗条件下饲喂蚊虫60分钟，饲喂物为i-liq_diet、r-liq_diet或新鲜小鼠血液。实验在26 °C下进行。
- 摄食率评估
- 人工饲喂后，将蚊虫置于-20 °C环境中冷麻醉30秒，随后放置于冷藏的培养皿中。
- 记录完全吸血（图3）的雌蚊数量。
注意：摄食蚊虫的百分比被用作摄食成功率的替代指标。
3. 生活史特征
- 产卵量与生育力
- 使用毛刷将完全吸血的雌蚊转移至独立的笼子（20 cm × 20 cm × 20 cm）中。
- 将蚊虫置于 26 ± 1 °C、75% 湿度、12 h:12 h 光照:黑暗循环条件下，并持续提供 10% 葡萄糖溶液自由摄食。
- 吸血后 48 小时，在笼底放入湿润的滤纸以供产卵（图 4）。在放置产卵滤纸后的 48 小时和 72 小时，使用手持放大镜计数卵的数量。用蒸馏水淹没滤纸以收集卵。
- 幼虫死亡率
- 将卵收集至盛有蒸馏水的托盘（23 cm × 15 cm × 6 cm）中（图 5）。实验期间保持托盘内水位恒定。
- 每天向每盘幼虫投喂约 13 mg 磨碎的鱼饲料。所有重复组托盘采用相同的喂养方案。
- 每天清除死亡的蛹和幼虫。当所有蛹均发育为成虫后结束实验，并统计成年雄蚊和雌蚊的数量。
- 记录孵化与死亡日期，并计算死亡率。
- 寿命
- 从每组饮食处理的 F1 代中分别收集 15 只成年雄蚊和 15 只成年雌蚊。将雄蚊和雌蚊置于同一笼中饲养。
- 成蚊提供 10% 葡萄糖溶液自由摄食。每天清除死亡个体。
- 蚊虫的饲养温度、湿度、光照周期条件及糖类喂养方案均与上述一致。
- 记录死亡日期，并计算寿命。
- 翅长测量
- 将每组饮食处理的 F1 代 5 日龄成蚊（雄性和雌性）在 -20 °C 条件下冷麻醉 90 秒。
- 在体视显微镜下，用镊子轻轻夹住每只蚊子的胸部，将其腹面朝上放置。
- 使用解剖刀取下双翅，并将其置于干净的载玻片上，载玻片上含有已干燥的一滴封片介质。借助 20 G 针头在盖玻片边缘添加额外封片介质，然后缓慢将盖玻片覆盖在翅上。
- 使用体视显微镜配合微尺测量翅长（图 6）。
结果
下文所述结果比较了女性的表现 按蚊属 以配制的富营养人工液体饲料（r-liq_diet）饲喂的蚊虫、以初始液体饲料（i-liq_diet）饲喂的蚊虫以及以新鲜血液饲喂的蚊虫。该饲料的测试按照图示方案进行 图7. 本文所述的r-liq_diet是专利（PCT/IB2019/052967）的一部分。
完全吸血雌虫百分比
以r-liq_diet饮食饲喂的吸血雌蚊数量（89%）显著高于以血液饲喂的吸血雌蚊数量（56%）（图8）。
繁殖力与生育力
利用雌性个体在首个生殖营养周期中的繁殖力和生育力来评估 i-liq_diet 和 r-liq_diet 的营养质量。以新鲜脊椎动物血液饲喂的雌性平均产卵量为 24 ± 11 枚，而以 r-liq_diet 饲喂的雌性平均产卵量为 25 ± 5 枚（表 2）。饲喂 i-liq_diet 的雌性未观察到产卵。
F1 代死亡率
通过比较以脊椎动物血液或r-liq_diet饲养的蚊虫种群，评估F1代蚊虫的适应性。记录幼虫、蛹和成虫的死亡率。与食用r-liq_diet的蚊虫相比，食用血液的蚊虫变异性（平均值的标准误[SEM]）更高（图9 和 表2）。以血液或r-liq_diet饲养的蚊虫F1代在死亡率和存活率方面具有可比性。
F1 代预期寿命
美国疾病控制与预防中心估计，野生雌性成蚊的寿命最长可达一个月，但通常存活不超过1−2周，而雄性成蚊寿命约为一周，且仅以花蜜和其他糖类物质为食。有研究指出，亲代摄食情况的差异可能影响蚊子后代的存活率17。在本实验中，血液组（雌性：24.5 ± 6.8天；雄性：18.5 ± 6.9天）和r-liq_diet组（雌性：22.5 ± 8.1天；雄性：11.9 ± 6.9天）的雌、雄成蚊平均寿命相近（表3），且雌性寿命均长于雄性。
F1 代体型大小
翅长被用作成虫体型大小的指标。与其他物种相比，Anopheles 成虫属于小型至中型蚊子，翅长为 2.8 至 4.4 mm18。以 r-liq_diet 饲喂的 F1 代 Anopheles 蚊虫的成虫体型大小在预期范围内，且与饲喂血液的实验室蚊虫相似（图 10）。
统计学分析
数据表示至少三次独立实验的平均值（除非另有说明）。误差线代表标准误（SEM）。当数据符合正态分布时，采用Student t检验比较独立组间差异；否则采用Mann-Whitney检验。人工饲料喂养组之间的差异采用Fisher确切概率法进行分析，显著性水平定义为P ≤ 0.05。
图1：通过心脏内穿刺法采集CD1小鼠血液。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：标准的人工饲喂装置。 玻璃饲喂器中含有 r-liq_diet，正用于饲喂雌性按蚊 Anopheles。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：Anopheles 蚊虫人工饲喂后的状态。 从左至右：接受r-liq_diet饲喂后完全吸血的雌蚊、接受r-liq_diet饲喂但未吸血的雌蚊、雄蚊，以及接受小鼠血液饲喂后完全吸血的雌蚊。请点击此处查看此图的高清版本。
图 4：Anopheles 雌蚊摄食 r-liq_diet 后 48 小时所产的卵。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：由卵发育而来的L2幼虫阶段，收集于滤纸上，并置于含有蒸馏水的培养皿中。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：来自子一代雌性冈比亚按蚊（Anopheles coluzzii）的右翅。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：人工饲料测试的示意图方案。 请点击此处查看此图的放大版本。
图8：雌性蚊虫摄食人工饮食或血液后的摄食率。 星号表示摄食r-液体和i-液体饮食的蚊虫与摄食血液的对照组之间存在显著差异。双侧Fisher精确检验：r-液体饮食组与血液组相比，****P ≤ 0.0001（相对风险：0.4828，95% 置信水平 [CL]：0.3776 至 0.6194）；血液组与i-液体饮食组相比，*P = 0.0335（相对风险：1.379，95% CL：1.044 至 1.836）。蓝色：未摄食；红色：已摄食。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：配制的无血餐对F1代Anopheles coluzzii蚊虫死亡率及雌雄比例的影响。 共进行了三个独立实验，每个实验每种饮食组使用30只蚊虫。非配对t检验显示，吸血组与r-liq_diet饲喂组之间无显著差异（P值范围为0.5047至0.8491）。请点击此处查看该图的放大版本。
图10：翅长。 翅长测量从轴切迹至R4+5翅脉的距离，不包括边缘刚毛。每种饮食组的5只雌性和5只雄性个体用于评估体型大小（均值 ± 标准误）。数据以均值 ± 标准误表示。粉色：r-liq_diet；红色：脊椎动物血液。非配对t检验；雌性左翅：t = 1.300，df = 8，P = 0.2298；雄性左翅：t = 2.400，df = 8，P = 0.0432；雌性右翅：t = 1.300，df = 8，P = 0.2298；雄性右翅：t = 2.277，df = 7，P = 0.0569。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 组分 | g/L |
| *三磷酸腺苷 | 0.55 |
| *牛血清白蛋白 | 200 |
| *胆固醇 | 1 |
| 无水氯化钙 | 0.2 |
| 氯化胆碱 | 0.004 |
| D-泛酸钙（维生素 B5） | 0.004 |
| 无水 D-葡萄糖 | 4.5 |
| 硝酸铁九水合物 | 0.0001 |
| 叶酸 | 0.004 |
| 甘氨酸 | 0.03 |
| 肌醇 | 0.007 |
| L-盐酸精氨酸 | 0.084 |
| L-盐酸半胱氨酸二水合物 | 0.063 |
| L-谷氨酰胺 | 0.584 |
| L-盐酸组氨酸一水合物 | 0.042 |
| L-异亮氨酸 | 0.105 |
| L-亮氨酸 | 0.105 |
| L-盐酸赖氨酸 | 0.146 |
| L-蛋氨酸 | 0.03 |
| L-苯丙氨酸 | 0.066 |
| L-丝氨酸 | 0.042 |
| L-苏氨酸 | 0.095 |
| L-色氨酸 | 0.016 |
| L-酪氨酸二钠盐二水合物 | 0.104 |
| L-缬氨酸 | 0.094 |
| 无水硫酸镁 | 0.098 |
| 烟酰胺（尼克酰胺） | 0.004 |
| 酚红 | 0.015 |
| 氯化钾 | 0.4 |
| 盐酸吡哆醇 | 0.004 |
| 丙酮酸钠 | 0.011 |
| 核黄素（维生素 B2） | 0.0004 |
| 碳酸氢钠 | 3.7 |
| 氯化钠 | 6.4 |
| 无水磷酸二氢钠 | 0.109 |
| 盐酸硫胺素（维生素 B1） | 0.004 |
| *仅存在于 r-liq_diet 中 | |
表1：i-液体饮食与r-液体饮食的成分。
| 总卵数（± 标准误） | 每只雌虫卵数（± 标准误） | |
| 血液 | 733 ± 330 | 24 ± 11 |
| r-liq_diet | 763 ± 164 | 25 ± 5 |
| i-liq_diet | 0 | 0 |
表2：按雌性 Anopheles coluzzii 产生的卵批次。 每种实验饮食均进行了3次独立实验，每次使用30只雌蚊。
| 雌性（天数 ± 标准误） | 雄性（天数 ± 标准误） | |
| 血液 | 24.5 ± 6.8 | 18.5 ± 6.9 |
| r-liq_diet | 22.5 ± 8.1 | 11.9 ± 6.9 |
表3：F1代的预期寿命 按蚊属 蚊子。 通过记录来自相同饮食组的F1代蚊子（人工饲喂F0代所得）的出生与死亡日期，评估其寿命（每组追踪15只雌蚊和15只雄蚊）。结果以每饮食组蚊子的平均寿命表示。
讨论
我们配制的无血饮食之所以成功，可能是由于添加到 i-liq_diet（富含糖类、氨基酸、维生素和微量元素）中的所有组分共同产生的协同生理效应：BSA（蛋白质来源）、ATP（取食刺激剂）和胆固醇（脂质来源）。单独补充 r-liq_diet 中的任一单一组分均未能有效促进产卵（数据未显示）。该方案的一个缺点可能是某些组分的成本较高，例如胆固醇。尽管如此，胆固醇的存在至关重要，因为昆虫无法自身合成胆固醇19，而该分子是蜕皮类固醇激素的前体，后者可调控节肢动物的卵黄合成与卵子成熟20。应测试更低浓度的胆固醇，以优化其所需用量，从而降低成本并提高人工饲料的效益。
该方法的另一个局限性在于，人工饲料必须使用储备液新鲜配制，因为一旦配制成最终的液体形式，其质量会在储存后下降。未来，我们的配方饲料可被制备成干燥粉末形式，类似于SkitoSnackt，后者是一种用于埃及伊蚊（Aedes aegypti）的人工血液餐替代物21。
除了提供必要的营养外，人工餐食还需能够吸引雌性蚊虫并刺激其取食，其效果应与雌蚊取食脊椎动物新鲜血液时相当。本文所述的人工无血饮食与脊椎动物血液喂养组相比，可使完全吸血的雌性蚊虫数量增加20%。这一对吸引力的间接衡量指标，可通过使用嗅觉仪进一步验证，以确认该人工饮食对蚊虫的吸引力和适口性是否优于新鲜血液。
饮食对幼虫死亡率的影响在来源于吸食血液的蚊子的幼虫中最为显著，表明与新鲜血液相比，成分稳定的无血人工饲料有助于降低死亡率，提高蚊子繁殖成功率。血液餐的不可预测性可能源于宿主血液成分的个体差异17以及血液中可能干扰蚊子生理功能的分子的存在22。上述事实凸显了无新鲜血液饲料在高质量蚊子饲养中的优势。
总体而言，本研究中雌蚊产卵数量相较于某些昆虫饲养设施报道的数据较低，但平均产卵数与以人血饲养的实验室驯化冈比亚按蚊（A. gambiae）品系相当（22.6 ± 5.5 枚卵/雌蚊）23。实验组之间无论饲喂新鲜血液或人工饲料，其产卵数量均未表现出显著的统计学差异（表2），表明采用本研究配制的饲料结合人工膜饲喂系统，足以在实验室条件下维持并扩增按蚊属（Anopheles）蚊虫种群。
人工无血饮食可以维持 Aedes 蚊群22，但将其应用于 Anopheles 按蚊时效果有限或完全无效11。最近报道了一种基于血浆的人工饮食用于 Anopheles 按蚊24，但摄食率和繁殖潜力较低。我们的结果代表了该领域现有技术水平的重大进展（Gonzales 和 Hansen11 综述），因为我们的配方化重组液体饮食在性能上等于或优于标准的脊椎动物血液餐。进一步改善其储存稳定性和降低成本将拓宽其应用范围。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Dinora Lopes（IHMT-NOVA 动物实验中心）提供的技术支持，感谢 Joana Gomes 和 Ana Catarina Alves（IHMT-NOVA 昆虫饲养中心）对按蚊（Anopheles）蚊群的维护。本研究由比尔及梅琳达·盖茨基金会（OPP1138841）以及科学技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia，项目编号：UID/Multi/04413/201、UID/Multi/04326/2013、SFRH/BPD/89811/2012、CEECIND/00450/2017）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物（ATP） | Sigma Aldrich | A2383 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich | A790G | |
| 胆固醇 | MP Biomedicals | 199342 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（高糖含L-谷氨酰胺） | Lonza Bioscience | BE12-604F | |
| Entellan 封片介质 | Merck | 1079610100 | |
| 玻璃喂食器（Glassfeeder） | 本地玻璃供应商 | 按设计定制 | |
| 肝素钠盐 | Pan Reac AppliChem | A3004,0001 | |
| Imalgène 1000 | Merial, Portugal | 01MER122 | |
| 20 G × 1"（0.9 × 25 mm）针头 | Terumo Europe | NN-2025R | |
| Parafilm 封口膜 | Sigma Aldrich | P6543-1EA | |
| Rompun | Bayer, Portugal | 7427831 | |
| Millex-HV 0.45 µm 过滤器 | Millipore | SLHVR25KS | |
| 1 ml 注射器，配 27 G × ½"（0.4 × 12 mm）针头 | Terumo Europe | BS-NIN2713 | |
| Teich Mix Astra Pond | Astra | 4030733100957 | |
| Tetra 金鱼薄片饲料 | Tetra | 4004218742642 |
参考文献
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