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从线虫 Caenorhabditis elegans 中分离特定神经元群体

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DOI：

10.3791/60145

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2019年8月6日

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1Department of Biochemistry, University of Nebraska, 2Nebraska Redox Biology Center, University of Nebraska, 3Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication, University of Nebraska, 4Fred & Pamela Buffett Cancer Center, University of Nebraska Medical Center

本文内容

摘要

本文介绍一种从转基因生物中简单分离表达绿色荧光蛋白的特定活神经元细胞群的实验方案 秀丽隐杆线虫 线条. 该方法可实现针对特定神经元的多种离体研究，并能够分离细胞以进行进一步的短期培养。

摘要

在衰老过程中，许多细胞会积累大量损伤，导致细胞功能障碍，这是多种老年性疾病和病理状况的基础。终末分化的神经元是受衰老影响的主要细胞类型之一。尽管目前已存在多种哺乳动物神经元衰老模型，但这些模型的建立过程复杂且成本高昂。线虫 秀丽隐杆线虫 是一种研究神经元衰老的有力模型，因为这些动物具有较短的寿命、成熟的遗传操作工具以及结构明确的神经系统。本文所述方法可根据转基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，实现对特定细胞的高效分离。通过在不同细胞类型特异性启动子驱动下表达GFP的转基因动物品系，经消化去除外部角质层，并通过温和的机械破碎处理，获得包含多种细胞类型的悬液。随后利用荧光激活细胞分选技术或抗GFP偶联磁珠，将目标细胞与非靶细胞分离。分离所得细胞可进行短期培养，或直接用于细胞特异性的离体分析，例如通过实时定量PCR进行转录水平分析。因此，该实验方案可实现对不同神经元群体中细胞特异性应答的快速而可靠的分析 秀丽隐杆线虫.

引言

在过去的几十年中，多细胞动物模式生物Caenorhabditis elegans在神经元、神经环路及其在生理与行为反应以及衰老相关神经退行性疾病中的作用研究中发挥了重要作用。C. elegans的一个独特特征是其身体透明，使得所有成体体细胞的谱系均可被绘制出来1。此外，C. elegans的神经元数量适中，因而其神经系统的形态和连接性已得到充分阐明2。由于C. elegans具有固定的细胞谱系、寿命短，并拥有大量可用于高通量遗传学研究的工具，因此它是研究不同神经元群体中衰老过程的理想模式生物。

神经元的衰老和神经退行性疾病十分复杂，每种疾病都有其独特的病理特征。然而，对于帕金森病和阿尔茨海默病等多种此类疾病而言，一个共同的特征是错误折叠蛋白的进行性累积3,4,5。在这两种疾病中，蛋白质发生错误折叠并在细胞内聚集，导致细胞毒性，最终引发细胞死亡4,5。神经元正常衰老过程中，线粒体稳态——更具体地说是蛋白质稳态——....

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方案

1. 用于细胞分离的衰老线虫的准备与收集

注意：下文所述为从明尼苏达大学Caenorhabditis遗传中心（CGC）菌种库获取的转基因unc-17::GFP品系（OH13083）中分离胆碱能神经元的方法。必须保持无菌条件，以防止真菌或细菌污染。

  1. 通过T. Stiernagle所述的漂白法准备并同步线虫16在进行衰老实验时，将线虫接种到含有25 µM氟脱氧尿苷（FuDR）水溶液的线虫生长培养基（NGM）平板上，以减少产卵并抑制卵的孵化。定期检查琼脂平板，防止污染或卵的孵化，因为这些情况会导致结果不可靠。
    注意：对于 unc-17::GFP 细胞，通常使用三块 100 mm × 15 mm NGM 平板来分离足量的目标细胞16.
  2. 收集线虫并配制细胞分离所需的缓冲液。
    1. 收集线虫至15 mL锥形管中，用1.5 mL M9缓冲液（1 mM MgSO₄）从平板上冲洗线虫4，85 mM NaCl，42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO，pH 7.0）中，于 1,600 × g 离心 5 分钟 g弃去上清液，用1....

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结果

本方案可实现从线虫C. elegans中特异性分离unc-17::GFP阳性的胆碱能神经元，用于后续离体研究，例如细胞类型特异性的基因表达谱分析，以及最终进行短期培养以开展膜片钳电生理学测量。

图1显示了胆碱能神经元在正常状态下的unc-17::GFP阳性表达。unc-17基因在C. elegans全身均有表达，编码一种囊泡性乙酰胆碱跨膜转运蛋白17。该基因的表达可在头部、躯干中部和尾部的神经元及其神经元投射中观察到。

图2A展示了方法部分所述神经元分离流程的示意图。第一步是同步.......

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讨论

秀丽隐杆线虫 C. elegans 是研究神经元健康与疾病的成熟且强大的模式生物2。利用丰富的遗传工具操控这些动物，并结合数量可控且神经元类型图谱精确的特点，研究人员可以用相对少量的材料收集大量数据。本文概述了一种从完整线虫中分离不同类型神经元的优化方法。通过破坏线虫的外部角质层蛋白，可分离出包含神经元和肌细胞在内的多种细胞混合物5。这些分离的细胞可用于多种独特的实验。通过流式细胞术进行细胞分选，或使用抗体标记的磁珠进行分离，使该技术可根据特定实验参数灵活调整。从特定的 C. elegans 细胞类型中提取 RNA，也有助于更深入地分析并从机制层面理解各种细胞过程。

以下是必须严格遵循的关键步骤：1）从含有25 µM FuDR的培养板中收集饲喂充分且经过适当衰老处理的线虫；2）SDS-DTT孵育时间或蛋白酶混合物处理时间；3）GFP阳性细胞的筛选。首先，在线虫衰老过程中，必须格外仔细，确保所产卵不会孵化，否则将导致收集到的线虫年龄不均一，从而引起实验数.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Jennifer Fox 博士和 Khalimonchuk 实验室成员提出的深刻见解。本研究得到美国国立卫生研究院的支持（项目编号：R01 GM108975 资助 O.K.，T32 GM107001-01A1 资助 E.M.G.）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6孔板Fisher Scientific12-556-004
琼脂，分子生物学级VWRA0930
CaCl2SigmaC5670
氯仿Sigma496189
Contess自动细胞计数仪InvitrogenZ359629
DTTUSBiologicalD8070
乙醇Decon Labs2701
FBSOmega ScientificFB-02
氟脱氧尿苷SigmaF0503
HEPESSigmaH3375
异丙醇VWRBDH1133
KClAmrescoO395
KH2PO4USBiologicalP5110
Kimwipes纸巾Kimberly-Clark Professionals7552
Leibovitz's L-15培养基Gibco21083027
MgCl2SigmaM8266
MgSO4USBiologicalM2090
Na2HPO4·7H2OUSBiologicalS5199
NaClVWRX190
NaOCl（漂白剂）Clorox
NaOHAmrescoO583
青霉素-链霉素Fisher Scientific15140122
蛋白胨YUSBiologicalP3306
Pronase ESigma7433来自灰色链霉菌的蛋白酶混合物
SDSAmrescoO227
SMT1-FLQC荧光体视显微镜Tritech Research
蔗糖USBiologicalS8010
SuperScript IV 一步法合成试剂盒ThermoFisher12594025
TRIzolInvitrogen15596026苯酚与异硫氰酸胍溶液
台盼蓝染色液InvitrogenT10Z82
α-GFP磁珠MBLD153-11

参考文献

  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
  2. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. Th....

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标签

GFP RNA PCR

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