从线虫 Caenorhabditis elegans 中分离特定神经元群体

摘要

本文介绍一种从转基因生物中简单分离表达绿色荧光蛋白的特定活神经元细胞群的实验方案 秀丽隐杆线虫 线条. 该方法可实现针对特定神经元的多种离体研究，并能够分离细胞以进行进一步的短期培养。

摘要

在衰老过程中，许多细胞会积累大量损伤，导致细胞功能障碍，这是多种老年性疾病和病理状况的基础。终末分化的神经元是受衰老影响的主要细胞类型之一。尽管目前已存在多种哺乳动物神经元衰老模型，但这些模型的建立过程复杂且成本高昂。线虫 秀丽隐杆线虫 是一种研究神经元衰老的有力模型，因为这些动物具有较短的寿命、成熟的遗传操作工具以及结构明确的神经系统。本文所述方法可根据转基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，实现对特定细胞的高效分离。通过在不同细胞类型特异性启动子驱动下表达GFP的转基因动物品系，经消化去除外部角质层，并通过温和的机械破碎处理，获得包含多种细胞类型的悬液。随后利用荧光激活细胞分选技术或抗GFP偶联磁珠，将目标细胞与非靶细胞分离。分离所得细胞可进行短期培养，或直接用于细胞特异性的离体分析，例如通过实时定量PCR进行转录水平分析。因此，该实验方案可实现对不同神经元群体中细胞特异性应答的快速而可靠的分析 秀丽隐杆线虫.

引言

在过去的几十年中，多细胞动物模式生物Caenorhabditis elegans在神经元、神经环路及其在生理与行为反应以及衰老相关神经退行性疾病中的作用研究中发挥了重要作用。C. elegans的一个独特特征是其身体透明，使得所有成体体细胞的谱系均可被绘制出来¹。此外，C. elegans的神经元数量适中，因而其神经系统的形态和连接性已得到充分阐明²。由于C. elegans具有固定的细胞谱系、寿命短，并拥有大量可用于高通量遗传学研究的工具，因此它是研究不同神经元群体中衰老过程的理想模式生物。

神经元的衰老和神经退行性疾病十分复杂，每种疾病都有其独特的病理特征。然而，对于帕金森病和阿尔茨海默病等多种此类疾病而言，一个共同的特征是错误折叠蛋白的进行性累积^3,4,5。在这两种疾病中，蛋白质发生错误折叠并在细胞内聚集，导致细胞毒性，最终引发细胞死亡^4,5。神经元正常衰老过程中，线粒体稳态——更具体地说是蛋白质稳态——至关重要，因为稳态的扰动和失衡可导致神经退行性病变^6,7,8。细胞具备多种机制以维持蛋白质稳态，其中之一是未折叠蛋白反应（UPR）——一种经典通路，即来自内质网（ER）的信号激活细胞内信号级联，从而引发转录反应⁹。类似于这种UPR^ER，多细胞动物在发生线粒体蛋白质稳态失衡时也表现出类似的应答，即所谓的线粒体未折叠蛋白反应（UPR^mt）^7,8。C. elegans 似乎是已确认并具有明确UPR^mt通路的最基础生物体⁷。

由于神经元群体内在的连接性和复杂性，评估大型神经网络中特定神经元群体的功能/功能障碍可能十分困难³。然而，由于某些疾病具有细胞类型特异性且病理复杂（例如与细胞蛋白质稳态受损相关的疾病），常常需要对特定的神经元群体进行研究。在C. elegans中，可对特定神经元群体进行遗传学操作，从而便于在活体中进行观察。C. elegans的神经系统主要由神经元构成，胶质细胞仅占很小比例。在成年雌雄同体线虫中，约有302个神经元，可分为100多个不同的类别^2,10。例如，胆碱能神经元主要分布于神经肌肉接头，而多巴胺能神经元则主要参与感觉功能^10,11。随着年龄增长，运动能力和感觉功能均会下降，因此阐明这些特定神经元缺陷的机制至关重要^11,12。因此，亟需一种简单且可靠的方法来分离完整的靶细胞，以用于后续的离体研究。

本文介绍了一种优化的高效方法，用于快速分离表达绿色荧光蛋白（GFP）的特定神经元细胞，来源为C. elegans。该分离方法适用于幼虫、若虫或成虫阶段的线虫。从幼虫线虫中分离细胞的方法此前已由Zhang等人发表¹³，此处不再讨论。需要特别注意的是，所有线虫必须处于相同的生命阶段，以防止动物组织过度消化或受到不同生命阶段个体的污染。通过酶解和机械破坏富含胶原蛋白及其他结构蛋白的线虫角质层（一种外骨骼），可实现多种细胞的分离^13,14。随后可通过流式细胞术或抗体标记的磁珠对细胞进行分离。通常采用苯酚与异硫氰酸胍法提取RNA，以确保目标细胞群体的有效富集¹⁵。若操作得当，这些分离得到的细胞可在培养瓶或多孔板中维持培养。该方法为特定神经元的研究提供了独特而强大的工具，具备分离活细胞并保持其功能性的能力，可用于后续培养研究。

方案

1. 用于细胞分离的衰老线虫的准备与收集

注意：下文所述为从明尼苏达大学Caenorhabditis遗传中心（CGC）菌种库获取的转基因unc-17::GFP品系（OH13083）中分离胆碱能神经元的方法。必须保持无菌条件，以防止真菌或细菌污染。

1. 通过T. Stiernagle所述的漂白法准备并同步线虫¹⁶在进行衰老实验时，将线虫接种到含有25 µM氟脱氧尿苷（FuDR）水溶液的线虫生长培养基（NGM）平板上，以减少产卵并抑制卵的孵化。定期检查琼脂平板，防止污染或卵的孵化，因为这些情况会导致结果不可靠。
   注意：对于 unc-17::GFP 细胞，通常使用三块 100 mm × 15 mm NGM 平板来分离足量的目标细胞¹⁶.
2. 收集线虫并配制细胞分离所需的缓冲液。
   1. 收集线虫至15 mL锥形管中，用1.5 mL M9缓冲液（1 mM MgSO₄）从平板上冲洗线虫₄，85 mM NaCl，42 mM Na₂HPO₄·7H₂O, 22 mM KH₂PO，pH 7.0）中，于 1,600 × g 离心 5 分钟 g弃去上清液，用1 mL M9缓冲液洗涤线虫。重复离心和洗涤，共进行五次，以尽可能去除 E. coli 尽可能减少污染。
      注意：在此步骤中加入抗生素（如氨苄青霉素，50 µg/mL）有助于减少细菌污染。
   2. 对于两个样本，配制 2 mL 十二烷基硫酸钠-二硫苏糖醇（SDS-DTT）裂解缓冲液：200 mM DTT、0.25%（w/v）SDS、20 mM HEPES（pH 8.0）和 3%（w/v）蔗糖。
   3. 配制 15 mL 分离缓冲液（118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, 5 mM 葡萄糖，pH 7.4）₂，2 mM MgCl₂，25 mM HEPES [pH 7.3]）并置于冰上保存。
      注意：每次实验前必须新鲜配制SDS-DTT裂解缓冲液和分离缓冲液。
3. 角质层破坏与单细胞分离
   1. 离心步骤1.2.1中收集的动物样品，1,600 x g，离心5分钟 g去除所有上清液，将线虫重悬于1 mL M9培养基中，并转移至1.5 mL微量离心管中。
   2. 离心收集蠕虫，离心条件为 1,600 x g 5 分钟。
   3. 向线虫中加入 200 µL SDS-DTT 裂解缓冲液，在室温（RT）下孵育 5 分钟。若在光学显微镜下观察，线虫身体应呈现“皱缩”状。
      注意：长时间暴露于SDS-DTT裂解缓冲液可能导致线虫死亡，可通过观察线虫状态进行监测。死亡的线虫会伸长且不再卷曲。
   4. 加入800 µL预冷的分离缓冲液，轻轻弹击离心管混匀。
   5. 以13,000 x g离心蠕虫1分钟 g 在 4 °C 下，去除上清液，并用 1 mL 分离缓冲液洗涤。
   6. 重复步骤1.3.5，共进行五次，每次均需小心移除分离缓冲液。
   7. 加入100 µL蛋白酶混合液 Streptomyces griseus (15 mg/mL) (材料表将溶于分离缓冲液中的物质加入沉淀，室温孵育10−15分钟。
      注意：与SDS-DTT裂解缓冲液类似，延长蛋白酶消化时间可能导致细胞质膜蛋白过度切割，从而阻碍通过磁珠分离表面暴露的GFP。
   8. 孵育蛋白酶混合液期间，使用200 µL移液枪头在1.5 mL微量离心管底部反复吹打样本约60−70次，以实现机械解离。保持移液枪头紧贴微量离心管管壁并施加恒定压力，以充分解离细胞。
   9. 为确定消化阶段，取少量消化混合物（约1−5 µL），滴于玻璃载片上，使用组织培养显微镜观察。孵育5−7分钟后，可见虫体碎片的角质层明显减少，并可清晰观察到细胞悬液。
   10. 用900 μL市售的冷Leibovitz's L-15培养基终止反应，该培养基添加有10%胎牛血清（FBS）以及青霉素-链霉素（青霉素终浓度为50 U/mL，链霉素终浓度为50 μg/mL）。
   11. 离心 10,000 x g 5 分钟，沉淀分离的片段和细胞 g 在 4 °C 下，用 1 mL 冷的 L-15 补充培养基再清洗沉淀细胞两次，以确保去除多余的碎片和角质层。
   12. 将沉淀的细胞重悬于1 mL含L-15补充剂的培养基中，冰上静置30分钟。取上层约700−800 µL转移至微量离心管中。此层含有无细胞碎片的细胞，将用于后续目标细胞的分离。
   13. 按照制造商说明，使用自动细胞计数器或血细胞计数板对 10−25 µL 分离细胞进行细胞密度测定。

2. 通过流式细胞术或抗GFP磁珠分离GFP阳性细胞

注意：有两种方法可用于分离特定细胞类型。第一种方法是使用荧光激活细胞分选（FACS），第二种方法则使用抗体偶联的磁珠来富集表达特定质膜定位蛋白的细胞。后一种方法要求GFP定位于质膜，从而能够与抗体偶联的磁珠发生相互作用。

1. 通过流式细胞术分离GFP阳性细胞
   1. 取步骤1.3.12中收集的单细胞悬液，于4 °C以10,000 × g离心5分钟。弃上清，将沉淀细胞重悬于L-15补充培养基中，细胞密度不超过6 × 10⁶ 个/mL，以避免流式细胞仪过载。
   2. 使用具备分选功能的流式细胞仪，根据GFP阳性表达对细胞进行分选。GFP阴性细胞可用于非细胞类型特异性分析的对照。
      注意：如前所述，若目标GFP标记蛋白定位于细胞质膜，则可采用替代方法分离GFP阳性细胞。此时可使用第2.2节所述方案。
2. 通过抗GFP磁珠分离GFP阳性细胞
   1. 取步骤1.3.12中收集的单细胞悬液，于4 °C以10,000 × g离心5分钟。弃上清，将细胞重悬于485 µL L-15补充培养基中，加入15 µL经ddH₂O预清洗的偶联α-GFP抗体的磁珠。
   2. 在4 °C下将细胞与磁珠悬液孵育1小时，并进行极轻微翻转混匀。过度翻转会导致细胞损伤。
   3. 孵育结束后，于4 °C以10,000 × g离心5分钟，随后用1 mL L-15补充培养基洗涤沉淀2次，以去除GFP阴性细胞。
3. 分离细胞的培养
   1. 将分离的细胞接种至无菌的6孔板中。
      注意：这些孔板可用花生凝集素包被以增强细胞贴附；但如果细胞将立即使用，则可省略此步骤。
   2. 将培养板放入塑料容器中，在20 °C孵育，并放置湿润的擦拭纸或软纸巾（在ddH₂O中添加50 µg/mL氨苄青霉素，防止擦拭纸上细菌生长）以维持细胞湿度。切勿将细胞置于CO₂培养箱中孵育，因为升高的CO₂浓度可能损伤细胞。

3. 分离的GFP阳性细胞的荧光成像

1. 打开倒置显微镜荧光附件的荧光灯，并预热约10分钟。
2. 从培养箱中取出细胞培养物，置于带有荧光附件的倒置显微镜载物台上。将GFP滤光片滑入显微镜载物台下方的槽中。
3. 使用50倍放大倍数观察细胞。成功分离的GFP阳性细胞将清晰可见。使用显微镜上的相机附件拍摄照片。

4. 从分离的细胞中提取 RNA

注意：应在细胞分离后立即进行RNA提取，以确保材料的高质量。分离得到的RNA可用于合成cDNA，并通过定量PCR（qPCR）进一步检测转录水平。所有离心管、枪头和试剂均应为无RNase的，且在RNA提取前应用乙醇清洗工作区域。

1. 从步骤 2.1.2 收集的分离细胞中，将细胞在 1.5 mL 无菌、无 RNase 的微量离心管中于 4 °C 以 10,000 × g 离心 5 分钟。若细胞通过磁珠分离，则按照上述说明进行细胞收集。
2. 使用微量移液器从离心后的微量离心管中移除上清液，并加入 100 µL M9 培养基以洗去含 L-15 补充成分的培养基。在 4 °C 以 10,000 × g 离心 5 分钟后移除上清液。为确保完全去除所有培养基，重复洗涤共三次，每次均小心移除上清液。
3. 向细胞中加入 1 mL 苯酚和硫氰酸胍溶液（材料表），并用移液器轻轻吹打悬浮液。在室温下孵育混合物 5 分钟。
4. 孵育结束后，加入 250 µL 苯酚和硫氰酸胍溶液。
5. 在 25 °C 以 10,000 × g 离心溶液 5 分钟。
6. 用微量移液器尽可能多地吸取上层水相，避免扰动下层有机相，并将下层转移至新的 1.5 mL 无 RNase 的微量离心管中。向新管中加入 500 µL 异丙醇，并通过反复倒置混匀。在室温下孵育该溶液 5 分钟。
7. 在 25 °C 以 14,000 × g 离心管 20 分钟。
8. 保持样品置于冰上，用微量移液器尽可能吸除异丙醇，然后轻柔地向管中加入 1 mL 70% (v/v) 乙醇（溶于无 RNase 的 ddH₂O 中）。注意不要将溶液直接吹打到管底；应将乙醇/水混合液沿管壁加入。
9. 在 25 °C 以 10,000 × g 离心 5 分钟。
10. 移除大部分乙醇，并在冰上空气干燥 3−5 分钟。
    注意：此步骤后应完全去除乙醇；但需仔细检查管底，确保无残留乙醇。
11. 管中样品空气干燥后，加入 15−20 µL 无 RNase 的 ddH₂O，使用分光光度计在 260 nm 波长下测定 RNA 浓度和纯度。样品纯度应以 260 nm/280 nm 吸光度比值表示，该比值应约为 >2。
    注意：分离得到的 RNA 可冷冻并储存在 -20 °C。然而，为确保高质量 cDNA 的合成，强烈建议尽快使用 cDNA 合成试剂盒。随后可按照实验室所用热循环仪制造商提供的说明进行定量 PCR。

结果

本方案可实现从线虫C. elegans中特异性分离unc-17::GFP阳性的胆碱能神经元，用于后续离体研究，例如细胞类型特异性的基因表达谱分析，以及最终进行短期培养以开展膜片钳电生理学测量。

图1显示了胆碱能神经元在正常状态下的unc-17::GFP阳性表达。unc-17基因在C. elegans全身均有表达，编码一种囊泡性乙酰胆碱跨膜转运蛋白¹⁷。该基因的表达可在头部、躯干中部和尾部的神经元及其神经元投射中观察到。

图2A展示了方法部分所述神经元分离流程的示意图。第一步是同步...

讨论

秀丽隐杆线虫 C. elegans 是研究神经元健康与疾病的成熟且强大的模式生物²。利用丰富的遗传工具操控这些动物，并结合数量可控且神经元类型图谱精确的特点，研究人员可以用相对少量的材料收集大量数据。本文概述了一种从完整线虫中分离不同类型神经元的优化方法。通过破坏线虫的外部角质层蛋白，可分离出包含神经元和肌细胞在内的多种细胞混合物⁵。这些分离的细胞可用于多种独特的实验。通过流式细胞术进行细胞分选，或使用抗体标记的磁珠进行分离，使该技术可根据特定实验参数灵活调整。从特定的 C. elegans 细胞类型中提取 RNA，也有助于更深入地分析并从机制层面理解各种细胞过程。

以下是必须严格遵循的关键步骤：1）从含有25 µM FuDR的培养板中收集饲喂充分且经过适当衰老处理的线虫；2）SDS-DTT孵育时间或蛋白酶混合物处理时间；3）GFP阳性细胞的筛选。首先，在线虫衰老过程中，必须格外仔细，确保所产卵不会孵化，否则将导致收集到的线虫年龄不均一，从而引起实验数...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔板	Fisher Scientific	12-556-004
琼脂，分子生物学级	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
氯仿	Sigma	496189
Contess自动细胞计数仪	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
乙醇	Decon Labs	2701
FBS	Omega Scientific	FB-02
氟脱氧尿苷	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
异丙醇	VWR	BDH1133
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Kimwipes纸巾	Kimberly-Clark Professionals	7552
Leibovitz's L-15培养基	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl（漂白剂）	Clorox
NaOH	Amresco	O583
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	15140122
蛋白胨Y	USBiological	P3306
Pronase E	Sigma	7433	来自灰色链霉菌的蛋白酶混合物
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC荧光体视显微镜	Tritech Research
蔗糖	USBiological	S8010
SuperScript IV 一步法合成试剂盒	ThermoFisher	12594025
TRIzol	Invitrogen	15596026	苯酚与异硫氰酸胍溶液
台盼蓝染色液	Invitrogen	T10Z82
α-GFP磁珠	MBL	D153-11